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Chemistry

포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여

doi: 10.3791/53462 Published: April 26, 2016

Introduction

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포스트 컬럼 유도체 (PCD)과 결합 된 고속 액체 크로마토 그래피 (HPLC)의 분석 실험실에서 여러 문제를 해결하는 유용 강력한 도구이다. 이것은, 1,2- 가능한 검출기의 스위트 그렇지 않으면 발견 할 수있는 화합물을 검출 선택적으로 검출 및 정량 3-5의 하한을 허용하거나 표적 피검의 신호를 증가시킬 수있는 것은 피하기 위해 타깃 분석 물을 유도체 화 매트릭스 효과 6. 일반적으로 사용되는 반응은 PCD 또는 9,10 11,12 카민, 2,2- 디 페닐와 반응성 산소 종의 유도체 (ROS) 닌히 드린 오르토 phthaladehyde 7-9과 아미노산 등 아민의 반응을 포함 1 picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •)를 13, 14 또는 2,2'- 아지노 비스 (3- ethylbenzothiazoline -6- 술폰산 (ABTS) 15, 16, 및 황 C를 유도체 화하는 요오드화 지드 시약의 사용ontaining 화합물 17, 18.

HPLC 시스템 6 PCD 반응의 사용에 대한 여러 결점 그러나있다. 주로 이들 중에서 혼합하고, 반응을 8 발생하기위한 시간을 허용하는 유도체 화 시약 (들) 및 상기 검출기의 첨가 시점 간의 반응 코일을 사용하는 것이다. 이러한 반응은 종종 HPLC 시스템 (19)의 나머지 부분의 부피에 비해 상당한 500 μL 이상의의 볼륨이 루프. 이러한 대량의 반응의 사용은 반응 루프가 존재하지 않고 관찰 될지에 비해 증가 된 피크 넓어짐 결과 루프. 이는 정량 및 검출 높은 한계가 짧고 넓은 피크 결과 부정적인 크로마토 해상도에 영향을 미친다. 1 및도 2는 다양한 후 열 반응 루프 볼륨의 추가 결과 피크 형상의 열화를 강조. 이 분석모바일 94 % 메탄올 위상 조성물 6 % 밀리 Q 물로 수행 하였다. 이동상의 유속은 1 ㎖ / 분으로하고, 주입 부피는 20 μL이었다 및 분석 파장은 265 nm였다. 20 μL 1,000 μL에서 죽은 볼륨을 변화 코일은 열 및 PCD 방법에서 반응 루프 죽은 볼륨의 효과를 시뮬레이션 할 수있는 검출기 사이에 삽입되었다. 이러한 루프는 0.5 mm 내경 스테인레스 스틸 튜브로 제조되었다. 실험은 제어기 (SCL-10AVP)로 이루어진 HPLC 시스템에서 수행하고, 저압 그라디언트 밸브 (FCL-10ALVP), 펌프 (LC-20AD), 인젝터 (SIL-10ADVP) 및 PDA 검출기 ( SPD-M10ADVP). 이동상 전에 HPLC 시스템으로 도입 탈기를 통해 펌핑 하였다. 분리는 250 mm X 4.6 mm ID가 5 μm의 컬럼을 사용하여 수행 하였다. 실험 조건은 최근 문헌에 게시 된 PCD 반응의 통상적으로 선택 하였다.

그만큼간단하게는, 일반적인 포스트 칼럼 반응기 설치 효과적으로 액체가 흐를 수 있으며, 반응이 일어날 수있는 가늘고 긴 튜브이다 비 분할 된 관형 반응기를 지칭한다. 이 시스템 피크 넓어짐은 단지 시스템에 추가 데드 볼륨뿐만 아니라, 이이 지마 등. (8)에 의해 강조된 상기 튜브의 내부 직경에 의존한다. 또한, 코일 형상이 관찰 된 브랜드의 폭이 넓어의 역할을한다. 반응기의 권취하면 불감 부피가 최소화 될 수 있다는 것을 의미 잘 혼합의 결과로, 보조 유동 프로파일을 변경하는 것을 스튜어트 20 밝혔다. 21 코일 니트 열린 관을 사용하는 경우 피크 폭이 넓어은 중요하지 않습니다 것을 주장하고있다. 피크 넓어짐이 지나치게 큰 경우, 리액터의 다른 형태는 (20, 22)를 고려할 수있다. 이 침대 원자로 또는 분할 흐름 반응기를 포함 할 수있다. 이 원자로는 달리의 requir 것 느린 반응에 특히 유용하다전자 큰 반응이 반복됩니다. 비 단편화 된 관형 반응기는 PCD의 응용 프로그램에서 사용되는 반응기의 가장 일반적인 유형의 반응기 설정이 유형의 상품이 문서의 나머지 부분은 같다.

반응 플로우 (RF) 컬럼 디자인은 이동상이 외측에 위치하는 반경 방향 중앙 열의 영역 또는 세 개의 포트에 위치한 하나의 포트 중 하나를 통해 열을 종료 (또는 입력) 할 수있는 멀티 - 포트 단부 피팅을 포함 칼럼의 벽 영역 (도 3 참조). 이 두 스트림은 열 벽 밖으로 확장하는 외부 다공성 프릿에 둘러싸여 차례에 불 침투성 링에 둘러싸여 중앙 다공성 프릿을 포함하는 최종 피팅을 사용하여 분리된다. 때문에 중앙 불 침투성 링 크로스 흐름에 두 개의 다공성 영역 사이 수 없습니다.

반응물 흐름 크로마토 동안 유도체 화 시약 (들)은 하나 또는 TW로 이동상 흐름의 방향에 대해 펌핑반응 유동 열의 외측 포트 O. 컬럼 용리액이 자유로운 외부 포트를 통해 외부 프릿의 유도체 화 시약 (들)과 혼합되어 검출기로 전달된다. 반응 흐름 중 하나의 시약 유도체 사용할 수 있습니다 또는 듀얼 시약 시스템합니다 (유도체 화 시약 2 포트와 1 포트에 연결합니다 (유도체 화 시약 1 포트, 1 포트는 검출기 1 포트 차단에 열 용출액을 전달하는) ) 검출기에 열 리제를 전달합니다. 중앙 스트림의 흐름은 어느 underivatized 칼럼 용출액 효과적으로 다중화 검출부 (23), 폐기물 전달을 검출하는데 사용될 수있다.

RF-PCD 크로마토 그래피를 실행하는 중앙 및 주변 유동의 비율이 때 사용할 하나의 주요 튜닝 방법. 각 유도체의 최적 비율은 중앙 유동 검출 또는 폐기물 전달할지 여부와 같은 요인에 달려있다. 따라서, 최적의 비율이 결정되면이를 적절한 유동 비율은 각 실행이 수행되기 전에 달성되는 것이 보장되어야한다.

또한 프릿의 사용은 컬럼 용리액 스트림 전형적 제로 데드 볼륨 T 피스 또는 낮은 데드 볼륨을 사용하는 기존의 혼합 기법에 비해 더 효율적인 믹싱 RF-PCD 결과에서 유도체 화 시약을 혼합하는 것으로 밝혀졌다 W- 작품은 두 개의 스트림을 혼합합니다. 이는 상대적으로 작은 반응 루프의 사용을 허용하거나, 완전히 반응 루프 심지어 제거 하였다. 전통적인 포스트 컬럼 유도체 화 방법에 비해 선명한 피크에서의 반응 루프의 크기 결과의 감소. 이 모든 컬럼 용리액이 유도된다는 사실에도 불구하고 대 잡음비 큰 신호가 관찰되고, 검출 및 정량 하한값 따라서 달성 할 수 있다는 것을 의미한다.

반응 유동 크로마토 그래피 PCD 반응의 적응에 어려움을 극복하기 위해 개발 된때문에 많은 양의 반응 루프 사용의 필요성으로 인한 큰 포스트 칼럼 죽은 볼륨 현대 HPLC 컬럼 및 시스템 확대 밴드에 의한 효율 특히 손실의. 종래의 PCD에 비해 RF-PCD에보다 효율적인 혼합 공정은 작은 반응 루프 볼륨 관측 분리 효율의 증가로 이어지는 사용될 수 있다는 것을 의미한다. 또한 RF-PCD 크로마토 두 신호가 증가하고, 종래의 PCD 법에 비해 검출 및 정량 하한값의 결과 PCD 종래 기술에 비해 노이즈 감소이다. PCD 종래의 방법에 비해 RF-PCD의 추가적인 장점은 RF 열의 중앙 포트뿐만 아니라 칼럼의 주변부로부터 용출 유도 된 스트림으로부터 용출 underivati​​zed 스트림을 모니터링 할 수있는 능력이다. RF-PCD는 기존의 PCD의 방법에 비해 많은 장점을 표시하는 비교적 새로운하지만 유망한 기술이다.

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Protocol

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주의 : (메탄올에 대한, MSDS)를 사용하기 전에 모든 재료 및 시약에 대한 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 용매 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 용리액을 처리 할 때 모든 적절한 안전 관행의 사용을 확인합니다. HPLC, 분석 균형과 검출기 장비의 공학적 통제의 적절한 사용을 보장하고, 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지와 폐쇄 발가락 신발)의 사용을 보장합니다.

참고 :이 프로토콜은 관심의 화학 물질 화합물의 특성에 특정한 다른 시약과 반응 흐름 포스트 컬럼 유도체의 3 가지 방법 (RF-PCD) 기술, 각각에 대해 설명합니다. ROS의 분석을 위해 "플루오 레스 카민을 사용하여 주 아민의 2 감지"절을 참조하십시오 차 아민의 분석을 위해, "ROS의 1 감지 DPPH • 사용"섹션으로 이동 페놀 화합물의 분석 절 "3로 이동 . 페놀류의 검출4 aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨 "을 사용. 걸쳐 초순수 (예를 들어, 밀리 Q 물)를 사용합니다.

주 : RF 열 연결은 큰 차이가 RF 열에 피팅의 개수로되는 종래의 HPLC 칼럼과 거의 동일한 방식으로 달성된다. HPLC 시스템 표준 HPLC 컬럼을 연결하는 피팅은 HPLC 시스템에 RF 열을 연결하는 데 사용될 수있다.

1. ROS의 검출은 DPPH • 사용

  1. HPLC 기기의 설정
    1. 선 A 100 % 물 이동상과 같은 라인 B 100 % 메탄올 HPLC 기기를 준비한다. 제조업체의 요구 사항에 따라 펌프를 제거.
    2. HPLC를 계기 요소와도 4a에 도시 된 바와 같이 추가적인 유도체 펌프를 설정한다.
    3. 520 nm의 파장을 분석하는 UV-비스 검출기를 설정한다.
  2. 의 설정RF 열
    1. HPLC를 계기로 RF 컬럼의 입구를 연결합니다.
    2. 고주파 열 중앙 포트를 콘센트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 연결합니다.
    3. 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 사용하여 UV-마주 검출기 출구 주변 포트를 연결합니다.
    4. 상기 RF 컬럼의 출구에 주변 포트에 DPPH • 펌프 라인을 연결합니다.
    5. 열 마개를 사용하여 RF 컬럼의 출구에서 미사용 포트 주변 블록.
    6. 1 ml를 분으로 HPLC 펌프의 유량을 가져 -1 100 % B에서 행 - 100 % 메탄올.
    7. 4.6 mm의 ID × 100 mm 길이 열을 10 분 동안 100 % 메탄올을 이동상으로 열 평형. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 조정되어야한다.
  3. DPPH의 • 시약의 제조
    1. 메탄올 DPPH 0.1 ㎎ / ㎖ 용액을 제조 하였다. 10 분 동안 DPPH • 시약을 함유하는 플라스크를 초음파 처리.
    2. 빛에 노출을 방지하기 위해 호일에 플라스크를 커버.
    3. 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 DPPH • 시약과 DPPH • 펌프를 제거.
  4. 고주파 열 배출구 조정
    1. 정확하게이 깨끗하고 건조 선박의 무게. 하나의 중앙으로 용기 및 주변과 다른 레이블.
    2. 1.0 분 동안 중앙 표시된 용기에 중앙 포트에서 나오는 폐수를 수집합니다.
    3. 중앙 포트 용기를 다시 무게를 다음과 같이 중앙 포트로부터 유동의 무게를 구한다
      중앙 포트 선박의 초기 무게 (g) - 중앙 포트 (g)의 무게는 중앙 포트 선박 (g)의 최종 무게 =
    4. 반복 UV-VI를 RF 컬럼의 주변 포트에 연결하고, 주변 포트 용기 등을 위해 무게를 계산되어 배출되는 폐수에 대한 1.4.2와 1.4.3 단계다음과 같습니다 :
      주변 포트 선박의 초기 무게 (g) - 주변 포트 (g)의 무게는 주변 포트 선박 (g)의 최종 무게 =
    5. 다음과 같은 중추 및 말초 포트에서 나오는 유동의 비율을 계산한다 :
      % 중앙 포트 중앙 포트 (g)의 = 무게 / (중앙 포트 (g) + 주변 포트 (g)의 무게의 무게) × 100
      % 주변기기 포트 주변 포트 (g)의 = 무게 / (중앙 포트 (g) + 주변 포트 (g)의 무게의 무게) × 100
    6. 중심 흐름과 주변 유동의 분할 비를 확보하기 30:70 (말초의 중앙)이다. 중앙 흐름이 30 % 이상이면, 중앙 포트의 출구에 0.13 mm ID에 튜브의 길이를 추가하여 나오는 유동의 양을 감소시킨다. 중앙 흐름이 30 % 미만이면, 중앙 포트로부터 0.13 mm 튜브의 길이를 감소시킨다.
    7. (: 주변 중앙) 달성 30:70의 분할 비율이 될 때까지 단계를 반복 1.4.1은 1.4.6입니다.
    8. 는 D의 유량을 설정0.5 ml의 분 -1 PPH • 시약 펌프.
      참고 : DPPH의 • 시약으로 설정 한 RF 열은 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. 이제 샘플 주입 될 수있다.
  5. 포스트 실행 종료 조건
    1. 모든 샘플이 실행이 완료되었음을 나타내는 주입 된 후에는 유도체 화 시약 펌프 흐름을 중지합니다.
    2. 주변 포트에서 DPPH 시약 펌프 라인을 제거하고 포트를 마개.
    3. 이 이동상은 1 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1 10 분간 허용하여 저장하고자하는 상기 이동상과 열 평형.
    4. HPLC를 악기에 이동상 펌프의 흐름을 중지합니다.
    5. 메탄올 DPPH • 시약을 교체하고 추가 펌프를 제거.
      주 : HPLC 시스템은 이제 종료 될 수있다.

Fluoresc를 사용하여 주 아민 2. 검출아민

  1. 이동상 제조
    1. 볼륨 전에 희석 5 M 수산화 암모늄 9.0 용액의 pH를 조정 된 10 mM 아세트산 암모늄 용액의 1 L를 준비한다.
    2. 95:05 (: ACN 버퍼)의 혼합 이동상을 달성하기 위해 초산 암모늄 버퍼에 아세토 니트릴 (ACN)의 52.6 ML을 추가합니다.
  2. HPLC 기기의 설정
    1. 이동상으로서 라인 A의 미리 준비된 혼합 완충액으로 HPLC 기기를 준비한다. 제조업체의 요구 사항에 따라 펌프를 제거.
    2. HPLC를 계기 요소와도 4a에 도시 된 바와 같이 추가적인 유도체 펌프를 설정한다.
    3. 유도체 화 펌프 펄스 완충 장치 코일을 연결합니다.
    4. 셋업 형광 검출기 (FLD)를 475 내지 390 nm의 발광 파장의 여기 파장.
  3. RF 열 설정
    1. 일 연결HPLC 기기에 RF 컬럼의 전자 입구.
    2. 고주파 열 중앙 포트를 콘센트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 연결합니다.
    3. 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 사용하여 FLD 검출기로 RF 컬럼의 출구 주변 포트를 연결합니다.
    4. 상기 RF 컬럼의 출구에 주변 포트 유도체 펌프 라인을 연결합니다.
    5. 열 마개를 사용하여 RF 컬럼의 출구에서 미사용 포트 주변 블록.
    6. 1 ml를 분으로 HPLC 펌프의 유량을 가져 -1 100 %의 라인 (A)에서 - 5 % ACN으로 미리 혼합 된 10 mM 아세트산 암모늄 완충액 pH 9.
    7. 4.6 mm의 ID × 100 mm 길이 열을 10 분 동안 100 %의 A 이동상과 열을 평형. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 확장 할 수 있습니다.
  4. 플루오 레스 카민 시약의 제조
    1. 0.1 밀리그램 ml의 -1 플루오 레스 카민 시약을 100 ㎖를 확인합니다.
    2. <1 분 리> 초음파 처리.
    3. 빛에 노출되지 않도록 호일로 커버.
    4. 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 플루오 레스 카민 시약 시약 펌프를 제거.
  5. 고주파 열 배출구 조정
    1. 정확하게이 깨끗하고 건조 선박의 무게. 하나의 중앙으로 용기 및 주변과 다른 레이블.
    2. 1.0 분 동안 중앙 표시된 용기에 중앙 포트에서 나오는 폐수를 수집합니다.
    3. 중앙 용기를 다시 무게 단계 1.4.3에서 다음과 같이 중앙 포트로부터 유동의 중량을 계산한다.
    4. 반복 RF 컬럼의 주변 포트에 연결 단계 1.4.4에서 다음과 같이 주변에 대한 가중치를 계산하는 FLD를 종료 유출 2.5.3에 2.5.2 단계를 반복합니다.
    5. 단계 1.4.5에서 다음과 같은 중추 및 말초 포트에서 나오는 유동의 비율을 계산한다.
    6. 중심 흐름과 주변 사이의 분할 비를 확보흐름은 43:57 (: 주변 중앙)입니다. 중앙 흐름이 43 % 이상이면, 중앙 포트의 출구에 0.13 mm ID에 튜브의 길이를 추가하여 나오는 유동의 양을 감소시킨다. 중앙 흐름이 43 % 미만이면, 중앙 포트로부터 0.13 mm 튜브의 길이를 감소시킨다.
    7. (: 주변 중앙) 달성 43:57의 분할 비율이 될 때까지 단계를 반복 2.5.1은 2.5.6입니다.
    8. 0.7 ml의 분까지 이동상 펌프의 유량 설정 -1.
    9. 0.1 ml를 분으로 흐르게 유도체 펌프 세트 -1.
      참고 : 플루오 레스 카민 시약으로 설정 한 RF 열은 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. 이제 샘플 주입 될 수있다.
  6. 포스트 실행 종료 조건
    1. 모든 샘플이 실행이 완료되었음을 나타내는 주입 된 후에는 유도체 펌프를 중지합니다.
    2. 주변 포트와 스토퍼의 유도체 펌프 라인을 제거합니다.
    3. 이동상과의 열 평형이는이 이동상은 1 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1 10 분간 허용하여 저장한다.
    4. 이동상 펌프의 흐름을 중지합니다.
    5. 아세토 니트릴과 플루오 레스 카민 시약을 교체하고 유도체 펌프를 제거.
      주 : HPLC 시스템은 이제 종료 될 수있다.

4 Aminoantipyrene과 칼륨 페리시 아나이드를 사용하여 페놀의 3 검출

  1. 이동상 제조
    1. 볼륨 전에 희석 5 M 수산화 암모늄 9.0 용액의 pH를 조정, 100 mM의 아세트산 암모늄 용액의 1 L를 준비한다.
    2. (메탄올 버퍼) 5 : 95의 혼합 이동상을 달성하기 위해, 아세트산 암모늄 완충액, 메탄올 52.6 mL를 추가.
  2. HPLC 기기의 설정
    1. 이동상으로서 라인 A의 미리 준비된 혼합 완충액으로 HPLC 기기를 준비한다. 제조 업체에 따라 펌프를 제거 ';의 요구 사항.
    2. HPLC를 계기 부품 및도 4b에 도시 된 바와 같이 두 개의 추가 시약 펌프를 설정한다.
    3. 시약 펌프의 각 펄스 완충 장치 코일을 연결합니다.
    4. 500 nm의 파장에서 분석하는 UV-마주 검출기를 설정합니다.
  3. RF 열 설정
    1. HPLC를 계기로 RF 컬럼의 입구를 연결합니다.
    2. 고주파 열 중앙 포트를 콘센트에 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 연결합니다.
    3. 0.13 mm ID를 튜브의 15cm 길이를 사용하여 UV-마주 검출기로 RF 컬럼의 출구 주변 포트를 연결합니다.
    4. 각 시약 (즉, 4 aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨)를 RF 컬럼의 출구에 주변 포트에 펌프 라인을 연결합니다.
    5. 1 ml를 분으로 HPLC 펌프의 유량을 가져 -1 100 %의 라인 (A)에서 - 5 % 메탄올로 예비 혼합 100 mM의 아세트산 암모늄 완충액 pH 9.
    6. w 열을 평형4.6 mm의 ID × 100 mm 길이 열을 10 분 동안 100 %의 A 이동상 번째. 이 시간은 사용자가 사용할 수있다 다른 컬럼의 크기에 따라 확장 할 수 있습니다.
  4. 4-aminoantipyrene 시약의 제조
    1. 단계 3.1.1에 따라 pH가 9 암모늄 아세테이트 완충액을 준비한다.
    2. 150 mg의 4-aminoantipyrene을 달아 제조 아세트산 암모늄 완충액 (pH 9) 100ml에 녹인다.
    3. 1 분 동안 초음파 처리.
    4. 빛에 노출되지 않도록 호일로 커버.
    5. 제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 4 aminoantipyrene 시약 첫 번째 시약 펌프를 제거.
  5. 페리 시안화 칼륨 시약의 제조
    1. 페리 시안화 칼륨 150 mg의 무게를 측정하고, 단계 3.1.1에 따라 제조 초산 암모늄 완충액 100 ㎖ (PH 9)에 녹인다.
    2. 1 분 동안 초음파 처리.
    3. 빛에 노출되지 않도록 호일 커버.
    4. Purg제조업체의 요구 사항에 따라 제조 된 페리 시안화 칼륨 시약과 전자 두 번째 시약 펌프.
  6. RF 열 조정
    1. 정확하게이 깨끗하고 건조 선박의 무게. 하나의 중앙으로 용기 및 주변과 다른 레이블.
    2. 1.0 분 동안 중앙 표시된 용기에 중앙 포트에서 나오는 폐수를 수집합니다.
    3. 중앙 용기를 다시 무게 단계 1.4.3에서 다음과 같이 중앙 포트로부터 유동의 중량을 계산한다.
    4. 반복 UV-VI를 RF 컬럼의 주변 포트에 연결 단계 1.4.4에서 다음과 같이 주변에 대한 무게를 계산되어 배출되는 폐수에 대한 3.6.3에 3.6.2 단계를 반복합니다.
    5. 단계 1.4.5에서 다음과 같은 중추 및 말초 포트에서 나오는 유동의 비율을 계산한다.
    6. 중심 흐름과 주변 유동의 분할 비를 확보하기 50:50 (말초의 중앙)이다. 중앙 흐름이 50 % 이상인 경우, 감소중앙 출구 포트 0.13 mm ID에 튜브의 길이를 추가하여 출사 흐름 양. 중앙 흐름이 50 % 미만이면, 중앙 포트로부터 0.13 mm 튜브의 길이를 감소시킨다.
    7. (: 주변 중앙) 달성 50:50의 분할 비율이 될 때까지 단계를 반복 3.6.1은 3.6.6입니다.
    8. 0.5 ml의 분당 4 aminoantipyrene 펌프의 유량 설정 -1.
    9. 0.25 mL의 분에 페리 시안화 칼륨 펌프의 유량 설정 -1.
      참고 :이 성분 시약으로 설정 한 RF 열은 이제 분석을위한 준비가되어 있습니다. 이제 샘플 주입 될 수있다.
  7. 포스트 실행 종료 조건
    1. 모든 샘플은 실행이 완료되었음을 나타내는 완료 실행 주입되고 나면, 시약 펌프를 모두 중지합니다.
    2. 주변 포트에서 시약 펌프 라인을 제거하고 0.13 mm 튜브의 15cm 조각으로 대체.
    3. WHI의 이동상과 열 평형CH는 이동상은 1 ml를 분으로 컬럼을 통과 -1 10 분간 허용하여 저장한다.
    4. HPLC를 악기에 이동상 펌프의 흐름을 중지합니다.
    5. 대체 두 시약의 시약은 메탄올로 펌프 및 제조 요구 사항에 따라 추가 펌프를 제거.
      주 : HPLC 시스템은 이제 종료 될 수있다.

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Representative Results

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RF-PCD에 의해 사용하기 위해 적응 된 제 PCD 방법은, 2,2- 디 페닐 -1- picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •) (24)를 사용하여 항산화 물질의 유도체이다. 이 반응은. Koleva 등의 알 25를 도입 널리부터 사용되어왔다. 검출은 반응성 산소 종의 존재하에, DPPH 라디칼 탈색, 관측 흡광도 저하 항산화 결과에 따라서 존재에 의존한다. DPPH • 반응은 종종 500 μL 또는 13-15 더 큰 반응 루프를 사용하지만 그것은 RF-PCD 열을 사용하는 경우에는 반응 루프가 필요하지 않은 것으로 나타났습니다. 그림 5는 사용 유도 Ristretto 커피의 샘플의 두 크로마토 그램을 보여줍니다 기존의 PCD와 RF-PCD 계측을 모두 사용하여 DPPH 라디칼 •.

RF-PCD에 의해 사용하기 위해 적응 된 제 PCD 방법은 인 DER유도체 화 시약 (23)로 플루오 레스 카민을 사용하여 네 개의 아미노산 (글리신, 류신, 페닐알라닌 및 트립토판)의 ivatization. 상기 방법은 RF 컬럼에 최적화 이동상 조성, 농도 및 플루오 레스 카민 카민 유량 Udenfriend 외. 11 일에서 적응시켰다. 종래의 방법은 pH가 9.0 버퍼가 이미 버퍼링 된 이동상 이용되는 RF-PCD 법 동안의 카민 시약의 첨가 전에 유출 물 스트림에 첨가 된 두 시약 유도체 시스템, 따라서 단일 시약 유도체 시스템을 이용 필요했다. 이 애플리케이션 유도 스트림은 형광으로 검출에 사용 된 여기 파장에 대응하는 UV 가시 검출기를 이용하여 390 nm에서 분석 하였다. 유도 된 스트림은 큰 잡음 신호를주고 검출 및 정량 하한값의 그러므로, 형광 검출기를 사용하여 검출 될 수있다itation, Udenfriend 등. (11)에 의해 작업에 따라. 또한, RF-PCD 설정의 중앙 포트로부터 나오는 용리액은 제 UV 가시 검출기를 이용하여 모니터링 하였다.

아미노산의 유도체에 대한 RF-PCD 법의 성능은 종래의 PCD 방법. 표에 RF-PCD 종래 PCD 모드 모두에서 분석 된 아미노산의 각각에 대한 정량 및 검출 한리스트 계산 한도를 비교 하였다. 검출 한계는 정량 한계는 (10)의 잡음 비율로 신호가 달성 된 농도로 정의하면서 2 대 잡음비 신호를 얻었다 농도로 정의 하였다. 그림 6은 네 크로마토 그램을 도시 아미노산은 통상적 인 PCD에있어서, 상기 RF-PCD 방법 및 RF-PCD 법에서 underivatized 스트림을 이용하여 분석 하였다. (7)은 완에 대해 얻어진 신호를 비교 도표종래 PCD 방법 및 RF-PCD 방법을 사용하여 글리신 류신에 의한 KS. RF-에서 통상의 PCD에있어서, 상기 RF-PCD 법 및 underivatized 스트림을 이용하여 분석 할 때 8 트립토판 피크의 피크 폭을 비교 한 도표 PCD 방법.

RF-PCD (26)에 의해 사용되도록되어 최종 PCD 방법은 네 페놀 (페놀, 4- 메 톡시, P는 p- 크레졸과 토코페롤)의 유도체이다. 이 방법은 RF 열 함께 사용하는 방법을 최적화하기 위해 작은 변화와 비글리와 GROB (27)에 의해 직장에서 적응했다. 이 작업은 모두 4 amionantiprine 페리 시안화 칼륨 용액은 RF 열의 단부 피팅에서 칼럼 용출액에 첨가 이성 유도체 화 반응을 이용했다. 이 반응을위한 RF 열을 사용하는 경우에 필요한 추가 후 열 반응 루프는 사용되지 것을 발견 하였다.도 9는 크로마토 곳의 예를 도시상기 유도체 방식에 대응하고, 분리 유도체 및 (블랙 추적) 검출되었다하지 않는 몇 가지를 보여 일부 구성 요소를 포함 21 구성 요소 테스트 샘플. 같은 혼합물은 분리 비교 (빨간색 추적)에 대한 underivati​​zed 검출되었다. 도 9에서, RF-PCD 응답도 10. 쉬운 시각적 차이 (수득 검출기 응답은 긍정적)에 대한 부정 응답 표시 (P)의 피크 형상의 비교를 도시 한 p- 크레졸 모두 RF-PCD 컬럼을 사용하여 유도체 화 및 underivati​​zed.

그림 1
그림 1. 크로마토 그래피 컬럼 및 검출기 사이에 추가 다양한 죽은 볼륨과 HPLC 시스템에 주입 hexylbenzene의 오버레이. 하십시오 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 톨루엔, 에틸 벤젠과 열 및 검출기 사이에 추가 다양한 죽은 볼륨과 HPLC 시스템에 주입 프로필 벤젠의 크로마토 그래피 오버레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 반응 흐름 열 설계 3. 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. 기악은 RF-PCD의 설정합니다. (A) 단일 시약 (즉, DPPH 또는 플루오 레스 카민 유도체 화 시약) 및 (B) 듀얼 시약 (즉, 4 aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨 유도체 화 시약). 여기를 클릭하세요하여 볼 수 이 그림의 더 큰 버전.

그림 5
그림 사용 후 컬럼 유도체 화 후 검출와 Ristretto 커피의 분리 5. 크로마토 그램을 2,2- 디 페닐 -1- picrylhydrazil 라디칼 (DPPH •). 유도체는 500 ㎕의 반응 코일 기존의 열을 사용하여 수행 하였다 (A) 및 반응 흐름 칼럼 (B )> 룽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
네 개의 아미노산 그림 6. 크로마토 그래피 오버레이 (글리신 (G), 류신 (L), 페닐알라닌 (P)과 트립토판 (T))은 PCD 시약 이후로 플루오 레스 카민을 사용하여 포스트 컬럼 유도체에 의해 검출 된 10 1,000 ppm으로의 범위 HPLC로 분리. (A) 기존의 PCD, (B) RF-PCD 및 (C) RF-PCD에서 중앙 (underivatized) 포트 :. 다음과 같이 크로마토 그램은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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글리신 (제 1 피크) 및 기존의 PCD (빨간색 추적) 및 RF-PCD (블랙 추적)에서 류신 (제 2 피크)에서 얻은 신호 그림 7. 비교. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8
인해 (A) 보유 시간 (B) 피크 체적 기준 트립토판의 피크도 8 피크 폭 비교. 검은 추적 종래 PCD 방법을 나타내고, 적색 트레이스는 RF-PCD 법을 도시 녹색 트레이스는를 나타낸다 상기 RF-PCD 방법의 중앙 포트에서 underivatized 스트림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1 "> :"유지 - together.within 페이지 = FO "십t 그림 9
인공 시료도 9 크로마토 그래피 분리. 성분 페놀 (P)를 포함하는, 4- 메 톡시 페놀 (M), P는 p- 크레졸 (C) 토코페롤 (T)뿐만 아니라 다수의 알킬 벤젠, 다핵 방향족 탄화수소, 아니 솔 phentanole, 카페인, 페닐알라닌 및 벤즈 아미드. 피크는 II, 내가 레이블 및 III는 예기치 않게 유도체 방식에 응답 알킬 벤젠 있습니다. 블랙 추적 적색 트레이스 500 nm에서의 유도체 화 반응을 나타낸다 254 nm에서 UV 검출기를 사용하여 underivati​​zed 응답을 나타낸다. 유도 된 응답이 반전 된 시각적 명확성을 위해 주. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10 빨간 추적이 500 nm에서의 유도 (RF-PCD) 응답을 나타낸다 그림 10 페이지의 p- 크레졸의 크로마토 그래피의 반응은. 검은 추적은 254 nm에서 자외선 검출기를 사용하여 underivatized 응답을 나타냅니다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.

반응 형 글리신 류신 페닐알라닌 트립토판
LOD (PPM) LOQ (PPM) LOD (PPM) LOQ (PPM) LOD (PPM) LOQ (PPM) LOD (PPM) LOQ (PPM)
RF-PCD 6 (25) (10) (100) (25) (250) (50) (250)
RF-PCD 중앙 포트 (underivatized) 감지되지 않음 감지되지 않음 감지되지 않음 1 (10)
기존의 PCD (10) (100) (50) (500) (50) (500) (100) (500)

검출 및 HPLC에 의한 분리 후 유도체 화 시약을 사용하여 플루오 레스 카민 다른 포스트 컬럼 유도체 화 시스템에 의해 검출 된 네 가지 아미노산의 정량 1. 제한한다.

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Discussion

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RF-PCD는 밴드 넓히는 효과를 최소화하고 분리 성능을 향상 반응 코일을 사용하지 않고 폐수 HPLC 포스트 컬럼 유도체 화 시약의 효과적인 혼합을 허용한다. RF-PCD 방법은 또한 검출 방법에 대한 신호 응답의 개선을 보여 주었다. Camenzuli 등. (28)는 에스프레소 커피 샘플에서 ROS의 검출에 대한 DPPH •와 반응 흐름 컬럼의 사용을보고하는 첫번째이었다. 이들 연구는 각종 DPPH 반응물 유속과 DPPH • 농도의 범위를 테스트하는 최대 성능을 달성하기 위해 분석 및 RF 조건의 최적화를 포함했다. 그것은 0.1 밀리그램 ml의 -1 0.5 ml를 분의 DPPH 반응물 유량의 DPPH • 농도 -1 RF-PCD 하에서 ​​개선 된 분리 성능 (즉, 효율성과 감도)에 최적이라고 결론 지었다조건 DPPH •의 유도체의 기존 PCD 방법에 비교했다. 5 에스프레소 커피 샘플에서 산화 방지제의 DPPH • 분석을 이용하여 두 개의 크로마토 그램을 보여줍니다. 특히 흥미로운 약 5 분의 체류 시간과 높은 강도의 피크이다. 이는 전통적인 DPPH • 유도체 화 방법의 전형적인 500 μL 반응 루프를 사용하면, 하나의 넓은 피크가 관찰 될 수 있음을 알 수있다. 상기 RF-PCD 법은 반응 루프를 필요로하지 않고 사용하는 경우에는, 그 하나의 피크가 500 μL 루프는 사실상 두 피크에 관찰 분명해진다. 상기 RF-PCD 설정을 사용하는 경우 또한, 추가 세부 사항은 5.5 분 후에 볼 수 있습니다. 따라서, DPPH •, RF-PCD의 기술을 이용하여 샘플에서 ROS의 분석을 이용하여 DPPH ROS 분석의 통상적 인 방법보다 우수한 것을 알았다.

와 RF-PCD카민 시약 차 아미노산 분석에 이용하고 카민 20 PCD의 종래 형태와 비교되었다. 유출 및 플루오 레스 카민의 유도체는 UV- 통해 RF 엔드 피팅의 외부 영역에서 수행하고 검출 된 반면 RF 컬럼 엔드 피팅 다중 검출을위한 플랫폼을 제공하는 또 때문에, underivati​​zed 중심 흐름은 UV-비스 통해 모니터링 하였다 비스. 네 개의 아미노산을 포함하는 표준 테스트의 시리즈는 6 PCD (도 6a)과 RF-PCD (유도의 검출 (도 6b)의 종래의 방법에 대한 크로마토 그래피 프로파일을 비교 한 도표. 다중 RF-PCD 조건 분석 underivatized 하였다 (도 6C)) 아미노산의 시리즈.도 7은 종래의 RF-PCD 및 PCD를 통해 얻은 개의 아미노산 신호의 오버레이도이다. 는 것을 알 수있다 t으로 인해보다 효율적인 분리 관찰반응 루프의 그 제거는 모든 컬럼 유출 물이 유도되었다는 사실에도 불구하고, 큰 신호 응답하게되었다. 또한, 더욱 효율적인 유도체 화제의 혼합 방식은 또한 신호 대 잡음비를 증가 하부 기저선 노이즈 결과. 이 효과는 표 1의 종래의 PCD 법에 비해 RF-PCD 법에 대해 계산 된 검출 및 정량의 하한에서 지탱된다. 이러한 경향은 DPPH •로 산화 반응을위한 큰도 5에서 알 수있는 종래 PCD 법에 비해 RF-PCD 법. 유의 한 피크 열화 종래 PCD 설정이 방법의 하부 신호 응답을 유도하는 데 사용 된 크로마토 그램에서 관찰 될 수있다.

RF-PCD (모두 유도체 및 underivatized 스트림) 및 종래의 PCD에 의해 분석 할 때도 8은 트립토판의 피크 프로파일을 비교. 피크 프로파일이 시간에 대해 플롯되는 경우, 피크 폭은 모두 대체로 유사한 (도 8a)으로 나타난다. 피크 프로파일 최대 음량 (도 8b)에 대해 도시 할 때, 종래의 PCD에 비해 RF-PCD 검색된 향상은 분명하다. 피크 량에 대해 플롯 팅 할 때, RF-PCD 피크가 underivati​​zed 피크에 비해 열화 소량 표시하면서 저하하지만 종래 PCD 법에서 관찰 된 것과 비교하여 최소의 것을 알 수있다. 기존의 PCD에 비해 RF-PCD의 분리 효율의 개선은 모두 기존의 PCD와 RF-PCD에 의해 유도체 화 한 후 글리신과 류신의 피크 모양을 비교 그림 7에서 설명된다. 이 RF-PCD 모드 신호가 2 개의 피크들 사이의 훨씬 더 긴 기간 동안 초기에있는 동안 종래 PCD 모드 글라이신 및 류신 피크 기준 거의 분리되어있는 것을 알 수있다.

PCD 종래의 방법에 비해 RF-PCD의 또 다른 이점은 다중 검출을 가능 RF 열의 중앙 포트로부터 underivati​​zed 유출 물을 모니터 할 수있다. 상기 RF 단부 피팅 내의 프릿 디자인이 방사상 중심 영역에서의 유동 이음쇠 단부의 주변 영역에서의 흐름과 함께 혼합 할 수 없기 때문에이 가능하고, 따라서,의 외측 영역으로부터 유도 된 스트림을 모니터링 할 수 있도록 피팅뿐만 아니라 중앙 포트로부터 underivati​​zed 스트림 모니터링. (280 nm에서) underivatized 때 이러한 능력은 카민 (20)에 의해 유도화 한 후에 신호가 약한 반응이 공지되어 표 1에서 트립토판에 대해 얻어진 결과에 의해 강조되어 있지만, 다른 아미노산 달리 그것은 UV 검출기에 대한 반응을 도시 . 검출 및 정량의 한계가 상대적으로 높았다 모두 유도체 시스템, 검출 및 정량 그러나 한계를 들어 t 훨씬 낮았다그는 스트림을 underivati​​zed. 기능을 사용하여 검출 파라미터를 각각의 아미노산에 대한 성능의 최대 레벨을 제공하기 위해 최적화 될 수있다 모두 유도 및 underivati​​zed 유출 스트림을 모니터링한다.

상기 RF 최종 피팅의 멀티 디자인은 듀얼 유도체 화 시약 분석 할 수 있습니다. 셀 림 등. (23)는 4-aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨을 사용하여 PCD의 종래 기술에 비해 페놀 성 화합물의 분석을 위해 RF-PCD 조건을 사용하여 두 시약 (4-aminoantipyrene 및 페리 시안화 칼륨)의 성능을 조사 하였다. PCD 기술이 유형의 두 개의 펌프를 필요로하고, 반응은 DPPH 하나 펌프 및 반응 루프를 대향 각각 유도체 화 시약 루프. 각종 페놀과 알킬 벤젠 화합물은 종래의 RF PCD 조건 하에서 분석 하였다. 사실 미 검출에서 흥미롭게도, 종래의 방법에 따라 검출되지 않은 비 페놀 화합물이었다데르 RF-PCD 조건. 그림 9는 UV-마주 크로마토 그래피 응답과 표준 테스트 혼합에 RF-PCD 비색 반응을 보여줍니다. 도 10에서 관찰 된 바와 같이 RF-PCD는 분리 성능의 저하없이, 계측의 관점에서 단순화 PCD 기술을 제공 하였다. 유도체 화없이 또한 RF-PCD에 의해 분석 할 때 열이 비례 p- 크레졸의 피크 프로파일을 비교 한 도표. RF-PCD 크로마토 그램의 피크의 폭이 underivati​​zed 크로마토 매우 유사 함을 알 수있다. 두 크로마토 그램의 주요 차이점은 RF-PCD 크로마토베이스 약간 넓은 점이다. 이 때문에 RF-PCD 기술에 더 피크 분산 거의가 있음을 보여줍니다. 유사한 반응은 단지 그 underivatized 피크에 비해 RF-PCD에 의해 유도 유사한 피크 폭을 갖는 P 개의 p- 크레졸 피크 것을 보여준다도 9에서 관찰 되었으나, 모든 알킬 페놀 및유도체 화 방식에 응답 lbenzenes이 같은 경향을 보였다. 두 유도체 화 시약을 사용하여 RF-PCD는 종래의 비 - 유도체 화 방법과 유사한 분리 성능을 수득하지만, RF-PCD는 비 - 유도 상태에서 검출되지 않고 하나의 페놀 화합물의 선택적 검출을 허용 .

RF-PCD 종래 HPLC-PCD 방법의 개발 등 이동상 조성물로서 일반적으로 HPLC 방법에서 사용할 수있는 튜닝 모든 도구 및 유량이기 때문에, 주입 부피 및 분석 파장은 RF-PCD 법에 적용될 수있다. 또한, 이러한 시약 PCD 유량비 이동상뿐만 아니라 PCD 시약 조성물로서 통상적 인 HPLC-PCD 방법에서 사용할 조정 도구는 RF-PCD 법에 적용될 수있다. 기존의 PCD 방법에서 사용할 수 없습니다 사용할 수있는 추가 조정 도구 RF-PCD를 사용하여 중추 및 말초에서 오는 흐름의 비율이다컬럼의 포트. 흐름은 골대 검출기의 길이 및 / 또는 내부 직경을 제어함으로써 라인들 각각에 대해 다시 압력을 변화시킴으로써 제어 (또는 중앙 포트로부터 오는 유량이 검출되지 않는 경우에 열 POST) 튜브이다. 외주 흐름에 대한 중앙의 최적 비율은 중앙 포트 검출 때 여부 질문에 반응뿐만 아니라 다른 요인에 의존한다. 주변 60 % 및 40 %의 중앙의 유동 비율은 종종 좋은 출발점이다.

튜닝 파라미터들에 따라, RF-PCD 열을 이용하여 발생할 수있는 많은 문제도 PCD 종래 방법과 공통된다. 크로마토 그래피 사용은 RF-PCD 분석을 수행 할 때 인식하는 하나의 특정 파라미터는, 시약 펌프, 특히 시스템의 유동 및 압력의 안정성 때문이다. 시스템의 흐름이 안정되지 않으면 초기 불안정성 때문에 감소 될 수 있습니다신호 대 잡음 비 및 정량 및 검출 한계이어서.

RF-PCD 크로마토 현대 HPLC 컬럼 및 시스템 PCD 반응 적응에 어려움을 극복하기 위해 개발되었다. 종래 PCD 방법과 비교하여 RF-PCD의 주요 장점 때문에 그것은 RF 열의 단부 피팅 내의 유리 재 안에 일어나는 것이 더 효율적 혼합하고,이 혼합은 다시 약간 높은 압력이다. 이 최소화 또는 PCD 많은 종래의 방법에서 사용되는 대량의 반응 루프 심지어 제거 가능하다. 포스트 칼럼 죽은 볼륨이 최소화와 함께, 더 큰 크로마토 그래피 해상도보다 효율적인 분리를 수행 할 수 있습니다.

RF-PCD 모드 PCD 종래의 방법에 비해 잡음에 대한 분리 효율 피크 형태 및 신호 개선 가져왔다. 그러나, 그 신호 개선 검출기 의존하는 것이 중요하다. 예를 감지기의존하는 샘플 량은 종래의 방법에 비해 RF-PCD 조건 신호 응답의 증가를 나타낼 수 없다. 이 칼럼에 샘플의 100 %가 어디 RF-PCD 조건 컬럼에 샘플의 일정 비율 아래는 분할 비율에 따라 감지, 감지하기 때문에 기존의 방법에서 그렇다. 이는 그러나, RF-PCD의 반응 (한 양의 시약이 동시에 추가되는) 최소 재 최적화 PCD 반응 중 어느 하나 또는 두개의 시약에 적용 할 수있을 것으로 예상되며, 이점 세 관찰 것을 반응은 지금까지 다른 모든 PCD 반응으로 변환합니다 테스트.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
HPLC instrument Agilent 1290 Series HPLC
Additional Pump(s) for derivatization system Shimadzu LC-20A
RF colum Non-commercial
PEEK tubing Sigma Aldrich Z227307
Column stoppers Provided with column
PEEK tube cutter Sigma Aldrich Z290882
Analytical Scale Balance 4-point analytical balance
Stop watch Non-Scientific equiptment
Eluent collection vials Any Small vial with a flat bottom will do, e.g., HPLC vials
HPLC Vials Will depend on instrument used
Vessels for mobile phase and derivatization solution(s) Sigma Aldrich Z232211
General Laboratory glassware Volumetric Flasks, pippettes, etc. Quantity and volumes will depend on sample preparation method.
Methanol Sigma Aldrich 34860
DPPH Sigma Aldrich D9132
Ammonium Acetate Sigma Aldrich 17836
Ammonia Sigma Aldrich 320145 Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998
Fluorescamine Sigma Aldrich F9015
4-aminoantipyrene  Acros Organics BVBA AC103151000
Potassium ferricyanide  AnalaR B10204-30

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References

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포스트 컬럼 유도체 화 반응 흐름 고성능 액체 크로마토 그래피 컬럼을 사용하여
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Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).More

Jones, A., Pravadali-Cekic, S., Hua, S., Kocic, D., Camenzuli, M., Dennis, G., Shalliker, A. Post Column Derivatization Using Reaction Flow High Performance Liquid Chromatography Columns. J. Vis. Exp. (110), e53462, doi:10.3791/53462 (2016).

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