Måling og analyse af Ekstracellulær syre produktion til Bestem glycolytisk Rate

Introduction

Det overordnede mål med denne metode er en nøjagtig måling den glycolytiske sats af celler ved hjælp af ekstracellulær flux analyse. Kvantitativ måling af glycolytiske sats hjælp ekstracellulær forsuring er det ønskede endepunkt mange eksperimenter. Men den samlede pris af ekstracellulær forsuring er summen af to elementer: respiratorisk forsuring, i form af _CO2 (der hydratiserer til H ₂ CO ₃ derefter dissocierer til HCO ₃ ^- + H ^+), og glycolytisk forsuring, i form lactat ^- + H ^+.

Bidragene _af CO 2 til den samlede ekstracellulær forsuring har indtil for nylig været betragtet som ubetydelig i målingen platformen her anvendes, XF24 analysator ^7. Det er dog klart i flere andre _systemer, at CO 2 kan være en stor bidragyder til ekstracellulær forsuring ^4-5. Flere papirer anerkende dette conbidrag, men ikke forsøge direkte kvantificering af _CO2-afledt syre ^3,8,9. Vi har for nylig vist, kvantitativt at CO ₂ produktionen er en væsentlig kilde til ekstracellulær forsuring i dette system ^6. Desuden, selv om der er flere metaboliske veje, der genererer _CO2 fra glukose katabolisme, der udføres af matrix dehydrogenaser i citronsyrecyklus er de overvældende bidragydere og alle andre kilder genererer mængder af _CO2, der er inden eksperimentelle fejl ^6.

Uden at korrigere for CO _{2-produktion,} er ekstracellulær forsuring derfor en tvetydig indikator for glycolytiske sats og kan ikke bruges kvantitativt. Vores tidligere publikation fremhæver flere tilfælde, hvor respiratorisk CO _{2 omfatter} størstedelen af den samlede forsuring signal, selv i celler generelt menes primært at anvende glycolyse ^6. Derudoverrespiratorisk CO ₂ bidrag til samlet forsuring varierer meget i løbet af fælles stofskifteprofil eksperimenter, der viser, at korrekt sammenligning af den glycolytiske sats i forskellige dele af et eksperiment kræver korrektion for CO _2.

For at måle den glycolytiske på celler under anvendelse af hastigheden af ekstracellulær forsuring, er det nødvendigt at konvertere pH-ændringer på ændringer i alt H ⁺ genereret, og at trække den ekstracellulære forsuring forårsaget af _CO2 frigives under drift af citronsyre cyklus. Her beskriver vi en enkel metode til at måle ekstracellulær proton produktionshastighed (fra ekstracellulære ændringer i pH og den kalibrerede buffering effekt af testsubstratet) og CO _2-produktion (fra ekstracellulære ændringer i O ₂ koncentration), og demonstrerer, hvordan man beregner glycolytiske sats ved hjælp af disse målinger.

Denne metode styrke ker anvendeligheden af ​​ekstracellulær forsuring måling ved at bruge det til korrekt beregne glycolytiske sats som defineret i lactatproduktion. Uden korrektion for respiratorisk CO _{2 (eller} direkte måling af lactat), er det umuligt at afgøre, om og i hvilket omfang den samlede forsuring afspejler glycolytiske sats, confounding fortolkningen af eksperimenter, der anvender de samlede ekstracellulære forsuring som en direkte måling af lactat-produktion.

BEREGNINGER

_CO 2 og laktat er, inden for eksperimentel fejl, de eneste to bidragydere til ekstracellulær syreproduktion, baseret på eksperimenter med myoblastceller ^6. Derfor kan antallet af samlede ekstracellulær forsuring (PPR, proton produktionshastigheden) defineres som:

PPR _tot = PPR _resp + PPR _Glyc ligning 1

. _content "> hvor tot = total, hhv = respiratorisk; Glyc = glycolytisk glykolytiske PPR er således:

PPR _Glyc = PPR _tot - PPR _hhv ligning 2

Her,

PPR _tot = ECAR _tot / BP ligning 3

hvor ECAR = ekstracellulær forsuring rate (mph / min), og BP = buffering effekt (mph / pmol H ⁺ i 7 pi), mens

PPR _resp = (10 ^{pH-pKa ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pKa ₁₎₎} (max H ⁺ / O ₂₎ (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Ligning 4

hvor K = ₁ kombineret ligevægtskonstant _CO 2 hydrering og dissociation til HCO ₃ ^- + H ^+; max H ⁺ / O ₂ = the CO _2-afledte forsuring for en bestemt metabolisk transformation såsom fuldstændig oxidation af ^glucose-6; OCR = iltforbrug sats (pmol _O 2 / min), og OCR _{rot / MYX} = ikke-mitokondrie OCR.

Ligning 4 isolater mitokondrie OCR ved at trække ikke-mitokondrie OCR (defineret som OCR, der er resistent over for den mitokondriske respiratoriske giftstoffer rotenon og myxothiazol) og tegner sig for den maksimale H ⁺ genereret pr O ₂ forbrugt for hvert substrat (max H ⁺ / O ₂ ) ^(se 6), samt andelen af CO ₂ giver anledning til H ^{+ ved} den eksperimentelle temperatur og pH (10 ^{pH-pKa ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pK _1).} For fuld oxidation af glucose, mitochondrial Oxygen Forbrug Rate (OCR) er nøjagtig lig med hastigheden af _{CO2-produktion.} I begrænset assayvolumen på ekstracellulært flux måling, CO ₂ produkterd ved respiration forbliver fanget i analysen medium. De fleste af de fanget CO ₂ hydratiseres til H ₂ CO _3, som derefter dissocierer til HCO ₃ ^- + H ^+. En lille fraktion forbliver opløst, men ikke hydreret, og en anden lille fraktion er hydreret, men ikke adskilles, som dikteret termodynamisk ved den kombinerede ligevægtskonstant _CO 2 hydrering og dissociation til HCO ₃ ^- + H ^{+ ved} eksperimentel temperatur (37 ° C) og pH (~ 7.4).

Således fuldstændige ligning for beregning PPR _g ved at trække PPR _resp fra PPR _tot er:

PPR _Glyc = ECAR _tot / BP - (10 ^{pH-pKa ₁} / (1 ​​+ 10 ^{pH-pKa ₁₎₎} (max H ⁺ / O ₂₎ (OCR _tot - OCR _{rot / myx)} Ligning 5

jegn denne måde satser for respiration og glycolyse, samt deres tilknyttede ATP produktion satser, kan kvantitativt bestemmes ud fra enkle målinger (ilt forbrug, ekstracellulær forsuring, bufferkapacitet) og importere eller beregning af andre nødvendige værdier ^(H + / O ₂ , P / O, og ligevægtskonstanten K ₁₎ ^6. Den her beskrevne eksperiment udvider på standard teknikker til at bruge den ekstracellulære Flux Analyzer såsom Seahorse XF24 ^10,11; for andre ekstracellulære flux måling formater (f.eks XF ^e 96, eller XFP) bør alle volumener nedenfor skaleres korrekt.

Buffering effekt af testsubstratet kan måles ved konstruktion af en standardkurve enten direkte i det ekstracellulære flux platform eller separat ved anvendelse af en kalibreret pH-sonde. Her er tre muligheder for at måle buffering af det ekstracellulære flux assaymediet givet, herunder ved hjælp af alle plast propå havne i den ekstracellulære flux analysator med cellefrie prøvebrønde, eller kun bruger den sidste injektion havn i celle-holdige brønde (afsnit 1) eller ved hjælp af en ekstern pH-måling (afsnit 2). Se vedlagte regneark for de fulde beregninger af eksempel data.

For at måle buffering strøm ved hjælp af pH-afsløring evne til ekstracellulære flux instrument, er det sikrest at bruge cellefrie brønde for at minimere signal variation. Inden fejlen findes imidlertid ingen statistisk forskel mellem cellefri og celleholdige brønde ved udførelse af denne måling (data ikke vist). BEMÆRK: beskrevet i trin 1.7 variation bærer fordel for medregning af eventuelle ændringer buffering knyttet tilsatte forbindelser eller af tilstedeværelsen af ​​celler, med den ulempe, støjende signal. Men som nævnt ovenfor, fandtes ingen signifikante forskelle i den beregnede buffering magten mellem celle-frit design vist i tabel 1 ogpost-eksperimentet design i tabel 2 under de eksperimentelle betingelser er beskrevet her.

Derudover over små ΔpH intervaller (<0,4 enheder eksperimentelt bedst begrænset til 0,2 enheder), den lineære hældning opnået ved at afbilde Δ mph / pmol H ⁺ tilstrækkeligt tilnærmer logaritmisk forhold mellem ΔpH og [H ^+]. Hældningen af denne standard kurve repræsenterer derfor buffering magt assaymediet under test i pH / nmol ^H + i 7 pi, eller mph / pmol ^H + i 7 pi. Vi anbefaler at øge medium buffering magt eller faldende celledensitet for prøver, der overskrider en 0,2 pH-enhed ændring under målingen tid. Målingen tid kan også faldet, men det kan forkorte steady state forsuring sats og indføre fejl i beregningen af ​​satsen.

Protocol

1. Måling Buffering Power i et ekstracellulært Flux instrument: To Variationer

BEMÆRK: beregningerne og metoder der er beskrevet her, blev udviklet ved hjælp af et ekstracellulært Flux Analyzer. For andre instrumenter, skal volumen målingen skaleres korrekt.

1. Forbered 0,1 M HCI standard i vand ved anvendelse af HCI-koncentrat (se Materialer og udstyr) ifølge producentens instruktioner.
   Bemærk: En regneeksempel til fremstilling af HCI injektioner til brug i alle fire indsprøjtningsporte er vist i tabel 1:

Tabel 1. Konsekutive HCI injektioner i et ekstracellulært flux assay godt.

2. Forbered fortyndinger af HCI standarden i mediet, der skal analyseres som i tabel 1 for antallet af tekniske gentagelser bliver carrIED i én plade, plus en til at give mulighed for pipettering fejl, fx fire tekniske replikater af havnen En injektion, forberede et lager af (1,1 pi x 5) 0,1 M HCI i (48,9 pi x 5) assaymedium.
3. Fordel 50 pi i hver Port A af målingen sonden patron. Gentag denne procedure for de resterende porte B, C og D.
4. Kør en ekstracellulær flux assay ^{10 med en} standardkalibreringskurve cyklus, efterfulgt af to cyklusser af [2 min blanding, 1 min ventetid, og 5 min måling] for hver af de fire port tilføjelser (se figur 2).
   1. Programmere eksperimentet ovenfor i instrumentets software i henhold til software instruktioner. Læg det forberedte patron ind i maskinen og udføre kalibrering i henhold til software instruktioner.
   2. Når du bliver bedt af programmet, skal du fjerne kalibrant-holdige plade og indsæt plade indeholdende assaymediet i hver brønd i instrumentet; fortsætte programmet.
5. U synge gennemsnittet af 8-10 datapunkter opnået ved steady state (typisk de sidste 8-10 point) fra før og efter hver port Desuden beregne (kumulativ) forskel i pH (ΔpH) forårsaget af hver injektion af standard syre.
6. Plot ΔpH mod nmol H ⁺ indeholdt i 7 pi volumen fanget af målesonden. Den lineære hældning er buffering effekt (BP) i mph / pmol ^H +.
7. Som et alternativ til trin 1,2-1,3, udføre de ΔpH målinger efter en assay, hvor porte A, B og C er anvendt til udførelse af et eksperiment, efterfulgt af en HCl-injektion i Port D. Som i tabel 2, fire tekniske gentagelser anvendes til at generere hvert punkt i en 5-punkts standardkurve i de 20 brønde eksperimentelle (bortset fra temperaturkorrektion fire baggrund brønde) i den ekstracellulære flux assayplade.

53464table2.jpg "/>
Tabel 2. Single HCI injektion i et ekstracellulært flux assay godt.

2. Måling Buffering Power med ekstern pH Meter

BEMÆRK: For at måle buffering kraft af et medium ved hjælp af en ekstern pH-sonde, kalibrere probe ved 37 ° C og holder denne temperatur for alle reagenser under eksperimentet.

1. Forbered 0,1 M HCI standard i vand ved anvendelse af HCI koncentrat ifølge producentens instruktioner.
2. Varm pH-sonde, pH standarder, assaymediet hvis buffering strømmen skal måles, og 0,1 M HCI til 37 ° C i et vandbad.
3. Kalibrere pH-sonde ved 37 ° C ifølge producentens anvisninger. Opretholde alle reagenser ved 37 ° C i hele assayet ved anvendelse af en varme- plade eller vandbad.
4. Portion 10 ml af testsubstratet i en lille bægerglas eller konisk rør. Overvåge pH kontinuerligt ved hjælp af en nedsænket pH probe.
5. Tilføj 0,1 M HCI til somsige medium i 10-20 pi alikvoter.
   1. Sikre blanding ved anvendelse af en omrører eller ved manuelt hvirvlende beholderen efter hver syreadditionssalt.
   2. Tillad et par sekunder til pH-måling til at stabilisere, derefter optage pH efter hver tilsætning.
   3. Som vist i tabel 3, foretage et tilstrækkeligt antal tilføjelser for at sikre beregning nøjagtig hældning og dække det pH-interval forventes under eksperimentet.

Tabel 3. Måling buffering strøm ved hjælp af et pH-meter. Data viser et typisk forsøg med seks 20 pi tilsætninger af 0,1 M HCI.

6. Plot ΔpH mod nmol H ⁺ tilsat pr 7 pi, hvilket giver en lineær hældning, der repræsenterer buffering effekt (figur 1).

Figur 1. Bestemmelse buffering magt. HCI standardkurve målt som i tabel 1, tabel 2 eller (her) som i tabel 3. Hældningen af den lineære kurvetilpasning giver buffering effekt (pH / nmol H ⁺ i 7 pi). Hvert punkt repræsenterer middelværdi ± SEM af n = 9 tekniske replikater.

7. Når buffering effekt kendes fra Metode 1 eller 2 ovenfor, konvertere ECAR signal (mph / min) til PPR (pmol H ⁺ / min / ug protein) ved at dividere ECAR ved buffering effekt (BP) (mph / pmol H ⁺⁾ og skalering til proteinindholdet i hver brønd:
   PPR _tot (pmol H ⁺ / min / ug protein) = ECAR (mph / min) / BP (mph / pmol H ⁺ i 7 pi) / protein per brønd (ug) Ligning 6
8. Alternativt kan du bruge de samme eksperimenter i metodes 1 eller 2 til at beregne (BC) værdi bufferkapacitet anvendes af instrumentsoftwaren til automatisk at beregne PPR under dataindsamlingen.
   BEMÆRK: Instrumentet brugsanvisning ¹² (side 107) indeholder detaljerede oplysninger om beregning og brug af bufferkapacitet, hvor BC beskrives som
   BC (mol / l) = mol H ⁺ / (ΔpH x buffer volumen (L)) Ligning 7
   BEMÆRK: bufferkapacitet som defineret i ligning 7 kan beregnes på instrumentet eller ekstern pH probeassays beskrevet ovenfor. Konvertering mellem buffering magt og bufferkapacitet gøres nemt (se vedlagte regneark):
   BC = 1 x 10 ^-9 / BP ((mph / pmol H ⁺ i 7 pi) / 7 pi) Ligning 8
   BEMÆRK: Hvis kendt før udførelse af assayet, kan indtastes bufferkapacitet direkte ind instrumentsoftwaren under forsøgsopstillingen.
9. Anvend denne procedure, og de ​​beregninger, der anvendes ovenfor til de fleste konventionelle buffersystemer, som beskrevet i tidligere publikation ^6.
   BEMÆRK: I tabel 4 buffering magt og bufferkapacitet flere konventionelle medier.

Tabel 4. Buffering magt og bufferkapacitet af udvalgte medier.

3. Udførelse et ekstracellulært Flux assay under anvendelse af C2C12 myoblastceller

BEMÆRK: I trin 3.4.3, var der ingen observerede forskelle i CO ₂ afledt syreproduktion afhængig af tilstedeværelsen af kulsyreanhydrase i C2C12 kultur, hvilket tyder på, at dens tilstedeværelse ikke er påkrævet for fuldstændig omdannelse af CO _{2 til} HCO ₃ ^- + H ^+. Men empirisk teste dette i forskellige eksperimentelle systemer anbefales før aboutitting carbonanhydrase.

1. Kultur muse C2C12 myoblaster ¹³ ved 37 ° C under 95% luft / _5% CO2 i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) med 11,1 mM glucose, 2 mM glutamin, 10% v / v føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin.
2. 24 timer før assay plade / frø celler i 100 pi af det samme dyrkningsmedium ved 20.000 celler / brønd i en 24-brønds polystyren ekstracellulære flux assayplade (se Materialer og metoder) uden yderligere belægning.
3. Fortynd oligomycin, FCCP og rotenon plus myxothiazol, og HCI (ekstraudstyr) til 10x endelig koncentration i Krebs Ringer Fosfat HEPES (KRPH) assaymedium (2 mM HEPES, 136 mM NaCl, 2 mM NaH ₂ PO _4, 3,7 mM KCI, 1 _mM MgCl2, 1,5 mM _CaCl2, 0,1% w / v fedtsyre-bovint serumalbumin, pH 7,4 ved 37 ° C).
4. Cellepræparation
   1. 30 minutter før assayet vaskes adhærente celler tre gange ved sugning til gently fjerne mediet fra brønden og derefter langsomt at tilsætte 500 pi KRPH.
   2. Cellerne inkuberes efter den tredje vasketrin ved 37 ° C under luft (ikke under 5% CO _{2, der} ændrer pH i denne bicarbonat-frit medium).
   3. Ved assay start, erstatte KRPH i brønde med 500 pi frisk KRPH indeholdende 500 U / ml kulsyreanhydrase og enten glucose (10 mM) eller kun medium, uden ekstra substrat.
5. Ilægning sensoren patron
   1. Pipetter 50 pi prøver af hver 10x forbindelsen fremstillet i trin 3.3 i patron havne et ekstracellulært flux sensorpatron som følger (slutkoncentrationer i assayet godt i betragtning): Port A: 2 ug / ml oligomycin, Port B: 0,5 pM FCCP, Port C : 1 pM rotenon, 1 uM myxothiazol, Port D: HCl (hvis udførelse af en in-assay acid kalibrering som beskrevet ovenfor og i tabel 2).
      BEMÆRK: med henblik på fuldstændig respiratoriske kæde hæmning beskrevet her, 1 uM minexothiazol kan anvendes i flæng med 1 uM antimycin A.
6. Ekstracellulære flux assay:
   1. Udfør en standard ekstracellulær flux assay til bestemmelse af respiratorisk kontrol som beskrevet i ^10.

BEMÆRK: For hvert segment af eksperimentet, fastlægge mix, vent, og måling gange ønsket, samt antallet af cyklusser per segment.

BEMÆRK: Dataene i tabel 5 blev indsamlet over to assay cyklusser af 2 min mix, 1 min ventetid, og 5 min mål for hvert segment, med tre assay cyklusser indtruffet efter Port D tilsætning af forskellige mængder af HCI (til kalibrering af buffer effekt som i tabel 2).

Tabel 5. ekstracellulært flux assay konfiguration.

4. Measuring slutpunkt lactatkoncentration

BEMÆRK: For at validere indirekte assay her beskrevet i nogen andet system, slutpunktet lactat koncentration ved afslutningen af ​​et ekstracellulært flux forsøget kan bestemmes direkte i en traditionel plade med 96 brønde ved at måle den oprindelige hastighed (over 2 min) reduktion af NAD ⁺ NADH → katalyseret af laktatdehydrogenase, beskrevet i detaljer i vores forudgående offentliggørelse ^6. For dataene vist i Repræsentative resultater, slutpunktet lactat-koncentrationen i glucoseholdige assaybrønde var ~ 40 uM.

1. Forbered 2x hydrazin medium: 1 M Tris, 20 mM EDTA, 400 mM hydrazin, pH 9,8 ved 22 ° C). Umiddelbart før assay start, tilføje NAD ⁺ til 4 mM og laktat dehydrogenase (LDH) til 40 U / ml. Endelige assaymedium sammensætning (1x): 500 mM Tris, 10 mM EDTA, 200 mM hydrazin, 2 mM NAD ^+, 20 U / ml LDH.
2. Umiddelbart efter den ekstracellulære flux assay, fjerne 100pi assaymedium fra hver brønd af den ekstracellulære flux assayplade og overføres til en brønd i en uigennemsigtig (sort) 96-brønds plade.
3. Til hver prøve godt, tilsættes 100 ul 2x hydrazin medium.
4. Umiddelbart indlæse pladen ind i en mikropladeaflæser og begynde at overvåge NADH fluorescens ved 340 nm excitation / 460 nm emission.
5. Optag starthastigheden for ca. 2 min.
6. Kør et lignende eksperiment til at konstruere en standardkurve ved at plotte starthastighed mod lactatkoncentration for tilsat laktat koncentrationer fra 0 til 50 uM.
7. Beregn lactat-koncentrationen i hver forsøgsgruppe brønd under anvendelse af standardkurven.

5. Måling Proteinindhold

1. Fjern resterende assaymedium fra hver brønd i assaypladen.
2. Vask brøndene tre gange med 250 pi BSA-fri KRPH, være omhyggelig med at minimere løsner af celler fra bunden godt overflade.
3. Tilføj 25 pi RIPA lysemedium (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% v / v Triton X-100, 0,5% w / v natriumdeoxycholat, 0,1% v / v SDS, pH 7,4 ved 22 ° C) til hver brønd i assaypladen.
4. Inkuber plade på is i 30 minutter.
5. Agitere plade på en pladeryster ved 1200 rpm i 5 min.
6. Mål proteinkoncentration ved standardmetoder, fx ved BCA assay sikre, at lysisbuffer sammensætning er forenelig med målemetoden. Proteinindholdet i forsøget i figur 2 var ca. 4 pg / brønd.

Representative Results

Figur 2 viser rådata for et typisk eksperiment. De sidste 10 målepunkter fra registrering af både OCR og pH (skraveret lodrette stænger) punkt-til-punkt blev brugt til beregningerne. Indledende bekymringer, at den gennemsnitlige værdi (midterste punkt måling) af hvert assay cyklus ikke ville give tilstrækkelig opløsning af satsen for en nøjagtig beregning, især da der syntes at være en lille forsinkelse mellem port tilføjelse og steady state forsuring sats, ikke blev bekræftet, da dette ikke synes at bidrage væsentligt til regnefejl (ikke vist). Alternativt, hvis den korrekte bufferkapacitet er indtastet under forsøgsopstilling, PPR kan aflæses direkte fra udlæsning dataindsamling instrument ved at vise PPR output i instrumentets software eller i PC-kompatibelt format til rådighed som et af de data output indstillinger.

ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
Figur 2. Repræsentative ekstracellulære flux spor af _O2 og H ^+. OCR og pH spor for eksempel forsøg i tabel 5, indeholdende 10 mM glucose ved assay start. Port D havde forskellige HCl-koncentrationer til kalibrering af buffer effekt (ikke vist i disse midlede spor). Data fra tidligere publikation ^6. Hvert punkt repræsenterer gennemsnit ± SEM af n = 8 biologiske replikater. Klik her for at se en større version af dette tal.

Dataanalyse af repræsentative resultater

Brug regnearket vist i tabel 6 og forudsat som en vedhæftet fil, kan indtastes dataværdier fra enkelte brønde i kolonnerne vises med gule overskrifter. Alle seks søjler til ret er beregnet ud fra disse poster. Eksemplet i tabel 6 viser beregningerne af PPR _resp og PPR _Glyc hjælp ECAR og OCR data fra de enkelte brønde til de indfødte betingelser med eller uden tilsat glukose, før Port A tilsætning af oligomycin. Tekniske replikater på hver biologisk præparat er normalt gennemsnit for at give enkeltværdier af udgangene i de sidste fire kolonner, så data fra forskellige biologiske præparater midles med passende udbredelse af fejlstatistik i BP og disse fire værdier.

Tabel 6. Beregning af respiratoriske og glycolytisk forsuring. Kolonnerne med overskriften i gult angiver værdier, der skal indtastes fra beregningen (f.eks BP, max ^H + / _O 2), eller fra dataindsamlingen (fx ECAR _tot, OCR). ps: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af denne tabel |. Klik her for at downloade denne tabel som et Excel-regneark .

Bidrag fra glykolyse og respiration til PPR efter korrektion

Figur 3 viser den grafiske udlæsning af data beregnes som i tabel 6 for indfødte satser glykolytisk og respiratorisk forsuring, priser efter oligomycin tilsætning (Port A), og priser efter FCCP tilføjelse (Port B). Disse data viser tydeligt, hvordan andelene af respiratoriske og glycolytiske forsuring ændres med valget af substrat (glucose versus kontrol (CTL) med ingen tilsat) og med mitokondrie status (native funktion vs. farmakologisk ændret funktion).

">
Figur 3. Proton produktionshastighed (PPR) fra glycolytiske og respiratoriske kilder. PPR fra respiration (åbne portioner) og glykolyse (fyldte portioner) i C2C12 celler beregnet ved hjælp af ligning 5 med ekstra glukose (tre venstre søjler) eller uden tilsat glukose (tre rigtige søjler). Data fra ^6. Alle data repræsenterer middelværdi ± SEM af n = 8 biologiske replikater.

Discussion

Ekstracellulær forsuring er et let måles indikation af cellulære stofskifte. For at kunne bestemme hastigheden af ​​cellulær glycolyse (som defineret af lactat produktion) er det vigtigt at kende buffering effekt af testsubstratet og til at konvertere de ekstracellulære flux målinger af oxygenforbrug og syrning til proton produktionshastigheder. Ved at udføre denne beregning, kan forsuringen som følge af CO ₂ frigivet i citronsyrecyklus fratrækkes, forlader forsuring, der resulterer fra produktion af lactat.

De mange forskellige måder, der gives her at måle buffering strøm til denne korrektion bære forskellige fordele og ulemper. Ekstern måling under anvendelse af en pH-sonde er meget nøjagtig og reproducerbar, men kan afvige små forskelle i pH detektion indført af fluoroforer indeholdt i assaypladen, tilsætning af forbindelser i assayet, eller tilstedeværelsen af ​​tHan cellerne selv. Den in-plade pH-målinger løse disse problemer, men også indføre varierende grader af eksperimentel støj.

_CO 2 korrektion ECAR giver mulighed for første gang den entydige og kvantitativ beregning af glycolytisk sats, og afslører variation i respiratoriske og glycolytiske bidrag til den samlede ECAR i løbet af et eksperiment. Ved hjælp af ligning 5 og målingerne af OCR, ECAR og buffering magt, kan glycolytisk sats beregnes ved hjælp af den simple regneark forudsat (tabel 6). Denne sats kan verificeres ved post-hoc laktat måling, hvis det ønskes ^6. I celler, hvor pentosephosphatvejen er meget aktive, kan anvendelsen af ​​pathway-inhibitorer, såsom 6-aminonicotinamide være nyttigt at isolere glycolytisk sats. Beregning af bidrag fra både CO _{² -} og laktat-afledt ^H + fra den samlede målte Ekstra Cellular Forsuring Vurder og Oxygen Consumption Rate er et uvurderligt værktøj for brug af ekstracellulære flux data til at foretage kraftige og kvantitative udsagn om metabolisk aktivitet.

Under anvendelse af fremgangsmåderne her beskrevet, herunder forskellige modifikationer til måling buffering magt, og optimere den ekstracellulære flux eksperiment for cellerne under undersøgelsen og data ønskes, kan hastigheden for glycolyse i intakte celler kvantificeres under en lang række eksperimentelle betingelser. Denne fremgangsmåde er begrænset til celler, der kan vokse i vedhængende kultur på (eller celler eller organeller, der kan klæbes til) en polystyrenoverflade. Det er mest pålidelig, når dyrkede celler er homogene og sammenflydende, selvom nyttige data stadig kan opnås over et område af disse betingelser. Beregningerne kræver et vist kendskab til stofskiftet i cellerne, som max ^H + / O ₂ spænder fra 0,65 til 1,0 for fuld oxidation af forskellige substrater og mere for delvis oxidation ^6, men hvis cellerne er known at oxidere glukose, kan antages en værdi på 1,0.

Selvom der er relevante for alle metaboliske karakterisering, kan denne metode være særligt nyttigt, når det anvendes i systemer, hvor et skift mellem respiratoriske og glycolytiske metabolisme til at opretholde cellulær ATP levering er en kritisk fænotype, herunder karakterisering af stamceller og tumorafledte cancerceller. Forståelse metaboliske kontrol ændringer i disse og andre sammenhænge vil give en større grad af raffinement og præcision i den eksperimentelle design og analyse af disse celletyper.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pherastar FS	BMG	n/a	microplate reader
Seahorse XF-24	Seahorse Bioscience	n/a	extracellular flux instrument
Seahorse XF assay plate	Seahorse Bioscience	V7-PS	consumable
XF Calibrant	Seahorse Bioscience	100840-000	solution
HCl standard	Sigma	38280	chemical
oligomycin	Sigma	O4876	chemical
FCCP	Sigma	C2920	chemical
Rotenone	Sigma	R8875	chemical
Myxothiazol	Sigma	T5580	chemical
DMEM	Corning	10-013-CV	medium component
FBS	Corning	35-010-CV	medium component
penicillin/streptomycin	Corning	30-002-CI	medium component
carbonic anhydrase	Sigma	C2624	chemical
96-well assay plate	Corning	CLS3991	consumable
NAD+	Sigma	N7004	chemical
LDH	Sigma	L1254	chemical