Introduction
Общая цель этого метода является точно измерить скорость гликолиза клеток с использованием анализа внеклеточной потока. Количественное измерение скорости гликолиза, используя внеклеточный подкисления является искомым конечная точка многих экспериментах. Тем не менее, общая скорость внеклеточного подкисления является суммой двух составляющих: дыхательная подкисление, в виде СО 2 (который увлажняет Н 2 СО 3, то распадается на НСО 3 - + Н +), и гликолитического подкисления, в виде лактата - + Н +.
Вклады CO 2 в общей внеклеточной подкисления до недавнего было считать незначительным в измерительной платформы, используемой здесь, в XF24 анализатора 7. Тем не менее, очевидно, в нескольких других систем, которые CO 2 может быть одной из основных причин внеклеточной подкисления 4-5. Несколько статей признать этот конвклад, но не пытайтесь прямой количественный СО 2 -derived кислоты 3,8,9. Недавно мы показали, что количественно СО 2 производство является значительным источником внеклеточной подкисления в этой системе 6. Кроме того, хотя существует множество метаболических путей, которые генерируют СО 2 из катаболизма глюкозы, тем осуществляется матричных дегидрогеназ в цикле лимонной кислоты подавляющие Авторы и все другие источники генерации количество CO 2, которые в пределах экспериментальной ошибки 6.
Без коррекции СО 2 производства внеклеточного подкисления, следовательно, является неоднозначным показателем гликолитического скорости и не могут быть использованы в количественном отношении. Нашей предыдущей публикации подчеркивается несколько случаев, когда дыхательная СО 2 содержит основную часть общего сигнала подкисления, даже в клетках, как правило, как полагают, в основном, используют гликолиз 6. Кроме того,дыхательная СО 2 вклад в общую подкисления широко варьируется в ходе общих метаболических экспериментах профилирования, демонстрируя, что правильно сравнение гликолитического скоростью в разные части эксперимента требует коррекции для CO 2.
Для измерения скорости гликолиза клеток с использованием скорости внеклеточной подкисления, необходимо преобразовать изменение рН на изменения в общем H +, генерируемых и вычесть внеклеточный подкисление вызванное CO 2 выделяется при работе в цикле лимонной кислоты. Здесь мы опишем простой метод для измерения внеклеточной дебит протонов (с внеклеточной изменения рН и калиброванного буферизации власти анализа среды) и СО 2 производства (от внеклеточного изменений в O 2 концентрации), и продемонстрировать, как рассчитать гликолитический скорость На основе этих измерений.
Эта сила метод ENS утилиту внеклеточного подкисления измерения, используя его правильно рассчитать скорость гликолиза, как определено лактата. Без коррекции дыхательных CO 2 (или прямого измерения лактата), невозможно определить, если и в какой степени общий уровень кислотности отражает гликолитический скорость, не оправдав интерпретацию экспериментов, использующих общую внеклеточный подкисления в качестве прямого измерения лактата.
РАСЧЕТ
СО 2 и лактата, в пределах экспериментальной ошибки, только два вклад в производство внеклеточной кислоты, основанные на экспериментах с клетками миобластов 6. Таким образом, скорость общего внеклеточного подкисления (PPR, дебита протон) может быть определена как:
PPR PPR малыш = соответственно + PPR Glyc Уравнение 1
. _content ">, где малыш = общее; соответственно = дыхания; Glyc = гликолитическая гликолитических PPR такова:PPR PPR Glyc = малыш - PPR соответственно Уравнение 2
Вот,
PPR малыш = РВЦА малыш / ВР Уравнение 3
где РВЦА = внеклеточного скорости подкисление (миль / ч / мин), и ВР = буферизации питания (миль / ч / пмоль Н + в 7 мкл), а
ППР = соответственно (10 рН-PK 1 / (1 + 10 рН-PK 1)) (макс Н + / О 2) (OCR TOT - OCR об / MYX) Уравнение 4
где К 1 = комбинированный константа равновесия СО 2 гидратации и диссоциации в НСО 3 - + Н +; макс Н + / O 2 = йе СО 2 -derived подкисление для конкретного метаболической трансформации, таких как полное окисление глюкозы 6; OCR = скорость потребления кислорода (O 2 пмоль / мин), и OCR об / MYX = без митохондриальной OCR.
Уравнение 4 изолирует митохондриальной OCR путем вычитания любого не-митохондриальной OCR (определяется как OCR, которая устойчива к митохондриальной дыхательной ядов ротенона и myxothiazol) и счетов для максимального H +, образованное на O 2 потребляется для каждого субстрата (макс Н + / O 2 ) (см 6), а также доля CO 2 порождая H + на экспериментальной температуры и рН (10 рН-PK 1 / (1 + 10 рН-PK 1). Для полного окисления глюкозы, митохондриальная кислорода Потребление Оценить (OCR) в точности равна скорости CO 2, производства. В ограниченном объеме анализа измерения внеклеточной потока, CO 2, продуктыд дыханием остается в ловушке в среду для анализа. Большая часть захваченных СО 2 увлажненной, чтобы H 2 CO 3, который затем распадается на НСО 3 - + Н +. Небольшая часть остается растворенным, но не гидратированного, а другой небольшая часть является гидратированный, но не диссоциируют, как продиктовано термодинамически комбинированным константа равновесия СО 2 гидратации и диссоциации, чтобы HCO 3 - + Н + при температуре эксперимента (37 ° C) и рН (~ 7,4).
Таким образом, полное уравнение для расчета PPR г путем вычитания PPR PPR соотв от TOT является:
PPR Glyc = РВЦА малыш / ВР - (10 рН-PK 1 / (1 + 10 рН-PK 1)) (макс Н + / O 2) (OCR малыш - OCR об / MYX) Уравнение 5
яп Таким образом, темпы дыхания и гликолиза, а также связанных с ними темпы производства АТФ, может быть количественно определена из простых измерений (потребления кислорода, внеклеточный подкисления, буферная емкость) и импорта или расчета других необходимых значений (Н + / вывода 2 , п / о, а константа равновесия K 1) 6. Эксперимент, описанный здесь расширяется на стандартных методов для использования внеклеточной поток анализатор, таких как конек XF24 10,11; для других форматов измерений внеклеточного поток (например, XF е 96, или XFP), все объемы ниже должны быть расширены соответствующим образом.
Буферный мощность в среду для анализа может быть измерена путем построения калибровочной кривой либо непосредственно во внеклеточном платформы потока или отдельно с помощью калиброванного рН зонда. Здесь три варианта для измерения буферизации внеклеточным потока среды для анализа даны, в том числе с использованием всех injectiна портах внеклеточного анализатора потока с скважин образцов клеточных бесплатно, либо с использованием только последней инъекции порт в ячейке, содержащей скважин (раздел 1), или с помощью внешнего измерения рН (раздел 2). См.прикрепленную таблицу для полных расчетов, например, данные.
Для измерения буферизации питание с помощью рН-обнаружения возможности внеклеточного инструмента потока, это самый безопасный в использовании бесклеточных скважин, чтобы минимизировать изменение сигнала. Тем не менее, в пределах погрешности, статистической разницы не существует между бесклеточной и клеточно-содержащий скважин при выполнении этого измерения (данные не показаны). Примечание: Изменение описано на стадии 1.7 осуществляет преимущество составляет любых потенциальных изменений в буферизации, предоставляемых добавленных соединений или в присутствии клеток, с недостатком шумной сигнала. Однако, как указано выше, никаких существенных различий не было обнаружено в расчетной мощности между буферным конструкции бесклеточной показанном в таблице 1, идизайн после эксперимента в таблице 2 в экспериментальных условиях, описанных здесь.
Кроме того, на малых диапазонах ΔpH (<0,4 единиц; экспериментально лучше ограниченные до 0,2 единиц), то линейный наклон получается путем построения Д миль / ч / мкмоль H + адекватно приблизительно логарифмическая зависимость между ΔpH и [H +]. Наклон стандартной кривой, следовательно, представляет собой буферную силу в среду для анализа тестируемого рН / нмоль H + в 7 мкл или миль / ч / пмоль Н + 7 мкл. Мы рекомендуем увеличение средней мощности буферизации или уменьшением плотности клеток в образцах, которые превышают единичное изменение рН 0,2 в течение времени измерения. Время измерения также может быть уменьшена, но это может привести к сокращению установившейся скорости подкисления и ввести ошибку в расчете скорости.
Protocol
1. Измерение Буферизация Сила в внеклеточной Flux инструмент: два варианта
Примечание: расчеты и способы, описанные здесь, были разработаны с использованием внеклеточного Flux Analyzer. Для других инструментов, объем измерения должны быть расширены соответствующим образом.
- Подготовка 0,1 М HCl в стандартной воде с использованием концентрата HCl (см Материалы и оборудование) в соответствии с инструкциями производителя.
Примечание: Пример расчета для приготовления инъекций HCl для использования во всех четырех инжекционных отверстий показано в таблице 1:
Таблица 1. Последовательные инъекции HCl в внеклеточного анализа потока также.
- Подготовьте разведения стандарта HCl в среде должны быть анализировали как описано в таблице 1 для ряда технических повторов, являющихся CarrIED в одной тарелке, плюс один, чтобы позволить ошибки пипетирования; например, для четырех технических повторов порта впрыска, подготовить запас (1,1 мкл х 5) 0,1 М HCl в (48,9 мкл х 5) анализа среды.
- Распределить 50 мкл в каждую Порт А картриджа измерения зонда. Повторите эту процедуру для оставшихся портов B, C и D.
- Запуск внеклеточный анализа потока 10 со стандартным циклом калибровки, после чего два цикла [2 мин смесь в течение 1 минуты ждать, и 5 измерения мин] для каждого из четырех портов дополнений (рисунок 2).
- Программирование эксперимент выше программного обеспечения прибора в соответствии с инструкциями программного обеспечения. Загрузите подготовленную картридж в аппарат и выполнить калибровку в соответствии с инструкциями программного обеспечения.
- При появлении в программе, удалите калибрующего содержащие пластину и вставьте пластину, содержащую анализа среды в каждую лунку в прибор; продолжить программу.
- U петь среднем 8-10 точек, полученных в стационарном состоянии (как правило, в последние 8-10 баллов) до и после каждого порта Кроме того, рассчитать совокупный () разница в рН (ΔpH), вызванного каждой инъекции стандартного кислоты.
- Участок ΔpH против нмоль Н +, содержащиеся в объеме 7 мкл захваченных измерительного зонда. Линейный наклон буферного питания (БП) в миль / ч / пмоль Н +.
- В качестве альтернативы к шагам 1,2-1,3, провести измерения ΔpH следующие анализе, в котором порты A, B, и С, используемого для проведения эксперимента с последующим инъекции HCl в Порт D. Как в таблице 2, четыре параллельных образца технические используется для генерации каждую точку стандартной кривой 5-балльной в 20 экспериментальных скважин (за исключением четырех фон коррекции температуры скважин) внеклеточного потока анализа пластины.
53464table2.jpg "/>
Таблица 2. Одноместный HCl инъекции в внеклеточного анализа потока скважины.
2. Измерение Буферизация питания Использование внешнего измерителя рН
Примечание: Для измерения буферизации мощность среде, используя внешнюю рН зонд, калибровку зонда при 37 ° С и поддерживают эту температуру в течение всех реагентов в ходе эксперимента.
- Подготовка 0,1 М HCl стандартный в воде с использованием концентрата HCl в соответствии с инструкциями производителя.
- Теплый рН зонд, стандарты рН, анализ среды, буферизация мощность должна быть измерена, и 0,1 М HCl до 37 ° С на водяной бане.
- Калибровка рН электрод при 37 ° С в соответствии с инструкциями производителя. Поддержание все реагенты при 37 ° С в течение всего теста с помощью тепла пластину или водяной бане.
- Аликвоты 10 мл среды для анализа в небольшой стакан или коническую трубку. Монитор рН постоянно используя погруженную рН зонда.
- Добавить 0,1 М HCl в качествеговорят среду в 10-20 мкл аликвоты.
- Убедитесь, смешивая с помощью мешалкой или вручную вращая контейнер после каждого добавления кислоты.
- Подождите несколько секунд для измерения рН для стабилизации, а затем записать рН после каждого добавления.
- Как показано в таблице 3, чтобы достаточное количество дополнений, чтобы обеспечить точный расчет наклона и охватывают диапазон рН ожидаемое в ходе эксперимента.
Таблица 3. Измерение энергии с использованием буферизации рН-метр. Данные представляют собой типичного эксперимента с шестью 20 мкл добавлением 0,1 М HCl.
- Участок ΔpH против нмоль H + добавлены в 7 мкл, давая линейный наклон, который представляет власть буферизации (рисунок 1).
Рисунок 1. Определение буферизации власть. Стандартная кривая HCl измеряли в таблице 1, Таблица 2 или (здесь), а в таблице 3. Наклон линейной аппроксимации кривой дает силу буферизации (рН / нмоль H + в 7 мкл). Каждая точка представляет среднее ± SEM п = 9 технические повторов.
- После того, как мощность буферизации известно через метод 1 или 2, преобразовать РВЦА сигнал (миль / ч / мин), чтобы PPR (пмоль Н + / мин / мкг белка) путем деления Ecar буферизацией мощности (ВР) (миль / ч / пмоль Н +) и масштабирование, чтобы содержание белка в каждой лунке:
PPR малыш (пмоль Н + / мин / мкг белка) = РВЦА (миль / ч / мин) / BP (миль / ч / пмоль Н + в 7 мкл) / белка на лунку (мкг) Уравнение 6 - В качестве альтернативы, используйте те же самые эксперименты в методес 1 или 2 для расчета стоимости буферную емкость (BC), используемый программным обеспечением прибора для автоматического расчета РНП во время сбора данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Руководство пользователя инструмент 12 (стр 107) содержит подробную информацию о расчете и использовании буферную емкость, где до н.э. описывается как
БК (моль / л) = моль H + / (ΔpH объем буфера х (L)) Уравнение 7
ПРИМЕЧАНИЕ: буферная емкость, как определено в уравнении 7, может быть рассчитана в инструмент или внешний рН зонда анализов, описанных выше. Преобразование между буферным власти и буферной емкости легко сделать (прилагается таблица):
BC = 1 х 10 -9 / BP ((миль / ч / пмоль Н + в 7 мкл) / 7 мкл) Уравнение 8
ПРИМЕЧАНИЕ: Если известны до проведения анализа, буферная емкость может быть введен непосредственно в программное обеспечение прибора во время эксперимента. - Применение этой процедуры и расчеты, используемые выше большинства обычных буферных систем, как описано в предыдущей публикации 6.
ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 4 перечислены электрические буферизации и буферная емкость из нескольких традиционных средств массовой информации.
Таблица 4. Буферизация мощности и буферная емкость отдельных средств массовой информации.
3. Выполнение внеклеточного Flux анализе с использованием клеток миобластов C2C12
Примечание: На шаге 3.4.3, не было никаких различий в наблюдаемых CO 2 не -derived производство кислоты зависит от наличия карбоангидразы в С2С12 культуры, предполагая, что его присутствие не требуется для полного превращения CO 2 в НСО 3 - + Н +. Тем не менее, для эмпирической проверки этого в разных экспериментальных системах рекомендуется перед омitting карбоангидразы.
- Культура мыши C2C12 миобластов 13 при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха / 5% CO 2 в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 11,1 мМ глюкозы, 2 мМ глутамина, 10% об / об эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
- 24 ч до анализа, пластина / семян клетки в 100 мкл той же культуральной среде при 20000 клеток / лунку в 24-луночный полистирольный внеклеточного поток Аналитический планшет (см Материалы и методы) без дополнительной покрытием.
- Развести олигомицин, FCCP и ротенон плюс myxothiazol и HCl (опция) до 10x конечной концентрации в Кребса Рингера фосфат HEPES (KRPH) анализа среды (2 мМ HEPES, 136 мМ NaCl, 2 мМ NaH 2 PO 4, 3,7 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2, 1,5 мМ CaCl 2, 0,1% вес / объем жирных кислот, свободных бычий сывороточный альбумин, рН 7,4 при 37 ° С).
- Подготовка сотовый
- 30 мин перед анализом, мыть адгезивных клеток три раза путем аспирации с Gently удалить среды от скважины, а затем медленно добавляя 500 мкл KRPH.
- Инкубируйте клетки после третьего шага стирки при 37 ° С в атмосфере воздуха (не менее 5% CO 2, который будет изменить рН этой бикарбоната среде без).
- При запуске анализа, заменить KRPH в скважинах с 500 мкл свежей KRPH содержащей 500 U / мл карбоангидразы и либо глюкозу (10 мм) или только среду, без дополнительной подложке.
- Загрузка картриджа датчика
- Пипеткой 50 мкл аликвоты каждого 10x соединения, полученного на стадии 3.3 в патронных портов внеклеточного потока картриджа датчика следующим образом (конечные концентрации в тесте также приведены): порт A: 2 мкг / мл олигомицину, Порт B: 0,5 мкм FCCP, Порт C : 1 мкМ ротенон, 1 мкМ myxothiazol, порт D: HCl (если калибровке в-анализа кислоты, как описано выше, и в таблице 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: для назначения полной торможения дыхательной цепи, описанные здесь, 1 мкМ Моиxothiazol могут быть использованы взаимозаменяемо с 1 мкМ антимицином А.
- Пипеткой 50 мкл аликвоты каждого 10x соединения, полученного на стадии 3.3 в патронных портов внеклеточного потока картриджа датчика следующим образом (конечные концентрации в тесте также приведены): порт A: 2 мкг / мл олигомицину, Порт B: 0,5 мкм FCCP, Порт C : 1 мкМ ротенон, 1 мкМ myxothiazol, порт D: HCl (если калибровке в-анализа кислоты, как описано выше, и в таблице 2).
- Внеклеточной анализ потока:
- Выполните стандартную внеклеточный анализа потока для определения дыхательного контроля, как описано в 10.
Примечание: Для каждого сегмента эксперимента, определить смесь, подождать, и время измерения необходимо, а также количество циклов в сегменте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные в таблице 5 были собраны в течение двух циклов анализа по 2 мин смеси, 1 мин ожидания, и 5 мин меры для каждого сегмента, с трех циклов анализа происходящих после Порт D добавлением различных количеств HCl (для калибровки буферизации Мощность, как в таблице 2).
Таблица 5. внеклеточной поток конфигурации анализа.
4. Measuriнг конечная точка концентрации лактата
Примечание: Для проверки косвенного анализа, описанного здесь, в какой-то другой системе, точка концентрации лактата конец к концу внеклеточного эксперимента потока могут быть определены непосредственно в обычном 96-луночного планшета путем измерения начальной скорости (в течение 2 мин) снижения НАД + НАДН → катализируемой лактатдегидрогеназы, подробно описанной в предшествующих публикации 6. Для данных, представленных в Представитель Результаты, концентрация лактата конечная точка в содержащей глюкозу аналитические лунки был ~ 40 мкм.
- Подготовьте 2x гидразина среды: 1 М Трис, 20 мМ ЭДТА, 400 мМ гидразин, рН 9,8 при 22 ° С). Непосредственно перед началом анализа, добавить NAD + до 4 мм и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) до 40 Ед / мл. Окончательный анализ состава среды (1x): 500 мМ Трис, 10 мМ ЭДТА, 200 мМ гидразина, 2 мМ НАД +, 20 ед / мл ЛДГ.
- Сразу же после внеклеточный анализа потока, удалить 100мкл среды для анализа из каждой лунки внеклеточного потока анализа пластины и передачи в лунку непрозрачной (черный) 96-луночного планшета.
- Для каждого образца, добавьте 100 мкл 2x гидразина среду.
- Сразу загрузить пластину в микропланшетного и начать мониторинг флуоресценции NADH при возбуждении 340 нм / 460 нм излучения.
- Запишите начальную скорость примерно на 2 мин.
- Запустите подобный эксперимент, чтобы построить стандартную кривую начальную скорость от концентрации лактата для добавленных концентрации лактата от 0 до 50 мкм.
- Рассчитать концентрацию лактата в каждой экспериментальной скважины с использованием стандартной кривой.
5. Измерение содержания белка
- Удалить остатки среды для анализа из каждой лунки аналитического планшета.
- Вымойте лунки три раза 250 мкл BSA-Free KRPH, будьте осторожны, чтобы свести к минимуму оплывание клеток из нижней поверхности скважины.
- Добавить 25 мкл лизис Рипасреда (150 мМ NaCl, 50 мМ Трис, 1 мМ EGTA, 1 мМ ЭДТА, 1% об / об Тритон Х-100, 0,5% вес / об дезоксихолат натрия, 0,1% об / об SDS, рН 7,4 при 22 ° С) В каждую лунку планшета для анализа.
- Инкубируйте пластины на льду в течение 30 мин.
- Перемешивают пластину на шейкере при 1200 оборотах в минуту в течение 5 мин.
- Измерение концентрации белка стандартными методами, например, путем анализа BCA, гарантируя, что состав буфера для лизиса совместимы с методом измерения. Содержание белка в эксперименте на рисунке 2 составляла ~ 4 мкг / лунку.
Representative Results
Рисунок 2 показывает исходные данные для типичного эксперимента. Последние 10 точек измерения от записи точка-точка, так и OCR (рН затененной вертикальные полосы) были использованы для расчетов. Первоначальные опасения, что среднее значение (измерение средняя точка) каждого цикла анализа не обеспечивают достаточную разрешение скорости для точного расчета, в частности, так как, казалось, было небольшое отставание между портом того и постоянной скоростью государственной подкисления, не оправдались, как это не появляется в значительной степени способствовать ошибки в расчетах (не показан). Кроме того, если правильно буферная емкость вводится во время экспериментальной установки, PPR можно прочитать непосредственно из инструмента сбора данных считывания, отображая выход PPR в программном обеспечении прибора или в формате PC-совместимый доступной в качестве одного из параметров выходных данных.
ftp_upload / 53464 / 53464fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Типичные внеклеточные потока следы O 2 и H +. OCR и рН следы на примере эксперимента в таблице 5, содержащем 10 мМ глюкозы в начале анализа. Порт D имеют различные концентрации HCl для калибровки мощности буферизации (не показан на этих усредненных следов). Данные предыдущей публикации 6. Каждая точка представляет среднее ± SEM из N = 8 биологических повторяет. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Анализ данных представительств результатов
Использование таблицы, показанной в таблице 6, который в качестве вложения, значения данных из отдельных скважин может быть введен в колонках с желтыми заголовками. Все шесть колонок в право вычисляются на основе этих записей. Пример в таблице 6 показаны расчеты PPR PPR соответственно и Glyc использованием Ecar и данные OCR из отдельных скважин для нативных условиях с добавлением или без добавления сахара, до порта A добавлением олигомицина. Технические повторов на каждую биопрепарата обычно в среднем, чтобы дать отдельные значения выходов в последних четырех столбцах, то данные из различных биологических препаратов в среднем с соответствующим распространения статистических данных об ошибках в ВР, и эти четыре значения.
Таблица 6. Расчет дыхательной и гликолитического подкисления. Колонны главе желтым указывают значения вводится из расчета (например, ВР, макс Н + / О 2), или от сбора данных (например, РВЦА малыш, OCR). PS: //www.jove.com/files/ftp_upload/53464/53464table6.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой таблице |. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот стол в качестве таблицы Excel ,
Вклады гликолиза и дыхания в PPR после коррекции
Рисунок 3 показывает графический вывод данных, рассчитанных в таблице 6 в родных для ставок гликолиза и дыхания подкисления, ставки следующие олигомицин того (Порт A), и ставки следующие FCCP того (Порт B). Эти данные ясно показывают, как пропорции дыхательной и гликолитического изменения подкисления с выбором подложки (глюкозы по сравнению с контролем (CTL) ни с нами) и митохондриальной статуса (родной функции против фармакологически измененной функции).
">
Рисунок 3. Протон дебит (PPR) из гликолитических и дыхательной источников. PPR от дыхания (открытые участки) и гликолиза (заполненные участки) из С2С12 клеток, рассчитанных с использованием уравнения 5 с добавлением глюкозы (три левых бар) или без добавления сахара (три правых бар). Данные 6. Все данные представляют собой среднее ± SEM из N = 8 биологических повторяет.
Discussion
Внеклеточной подкисления является легко измерить указание сотовой метаболизма. Чтобы правильно определить скорость гликолиза сотовой (как определено лактата) важно знать буферизации силу в среду для анализа, и для преобразования внеклеточного измерений параметров потоков потребления кислорода и подкисления протона темпы производства. При выполнении этого расчета, подкисление в результате CO 2 выпущен в цикле лимонной кислоты могут быть вычтены, оставляя подкисление, которая является результатом лактата.
Несколько различных способов приведенные здесь, чтобы измерить силу буферизации для этой коррекции нести различные преимущества и недостатки. Внешний измерений с использованием рН электрод обладает высокой точным и воспроизводимым, но может не соответствовать небольшие различия в обнаружении рН введенной флуорофоров, содержащихся в планшет для анализа, добавлением соединений в процессе анализа, или в присутствии третон сами клетки. В-пластины измерения рН решать эти вопросы, но и ввести в разной степени экспериментального шума.
CO 2 поправка к РВЦА позволяет впервые однозначными и количественного расчета скорости гликолиза, и показывает изменение в дыхательной и гликолитического вклад в общую РВЦА в ходе эксперимента. Использование уравнения 5 и измерения OCR, РВЦА и буферизации власть, гликолитическая ставка может быть рассчитана с помощью простого таблицу представленную (таблица 6). При желании 6 Эта скорость может быть проверена путем измерения лактата после специальной. В клетках, где пентозофосфатный путь обладает высокой активностью, применение ингибиторов пути, такие как 6-aminonicotinamide может быть полезно, чтобы изолировать гликолитических скорость. Расчет взносов как CO 2 - и лактата, полученных Н + из общего измеряется внеклеточной подкислением Оценить и кислород Consumptионная Оценить является бесценным инструментом для использования внеклеточные данные потока сделать мощные и количественные заявления о метаболической активности.
Используя методики, описанные здесь, включая различные модификации для измерения буферизации мощности и оптимизации внеклеточный эксперимент потока для клеток исследуемых и данных желании скорость гликолиза в интактных клетках может быть определена количественно в широком диапазоне условий эксперимента. Этот метод ограничен клетками, которые могут расти в прикрепленной культуре на (или клетки или органеллы, которые могут быть придерживались) полистирольный поверхность. Это самый надежный при культивируемые клетки однородны и сливной, хотя полезные данные могут еще быть получены в диапазоне этих условиях. Расчеты требуют некоторые знания о метаболизме клеток, как максимум H + O 2 / колеблется от 0,65 до 1,0 для полного окисления различных субстратов и больше для частичного окисления 6, однако, если клетки кNown окислять глюкозу, значение 1.0 можно предположить.
Хотя отношение к метаболическим всех характеристик, этот способ может быть особенно полезным при использовании в системах, в которых сдвиг между дыхательной и гликолитического метаболизма, чтобы поддерживать питания сотовой АТФ является критическим фенотип, в том числе характеристики стволовых клеток и опухолевых полученных раковых клеток. Понимание метаболических нарушений контроля в этих и других контекстах позволит в большей степени сложности и точности в экспериментальной разработки и анализа этих типов клеток.
Disclosures
Д-р Шона Мукерджи заявляет, что она не имеет конкурирующие финансовые интересы. Доктор Мартин Марка консультировал Морской конек биологических наук, который производит инструменты и реактивы, используемые в этой статье. Открытые сборы для доступа к этой статье были оплачены Морской конек биологических наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
| Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
| Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
| XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
| HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
| oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
| FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
| Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
| Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
| FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
| penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
| carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
| 96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
| NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
| LDH | Sigma | L1254 | chemical |
References
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).
- Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).
- Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism. Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).
- Seahorse Biosciences. F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).
- Blau, H., Chiu, C., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons. Cell. 32, 1171-1180 (1983).
