Summary
Her præsenterer vi en protokol til at bygge en hurtig Brillouin spektrometer. Cascading næsten afbildet fase array (VIPA) etalons opnå en måling hastighed mere end 1.000 gange hurtigere end traditionel scanning Fabry-Perot spektrometre. Denne forbedring giver midlerne til Brillouin analyse af væv og biomaterialer ved lave effektniveauer in vivo.
Abstract
Målet med denne protokol er at opbygge en parallel høj udslettelse og høj opløsning optisk Brillouin spektrometer. Brillouin spektroskopi er en berøringsfri målemetode, der kan anvendes til at opnå direkte udlæsninger af viskoelastisk materialeegenskaber. Det har været et nyttigt redskab i materiale karakterisering, strukturel overvågning og miljømæssig sensing. Tidligere har Brillouin spektroskopi sædvanligvis scanning Fabry-Perot etalons at udføre spektralanalyse. Denne proces kræver høje belysning effekt og lange erhvervelsestider, hvilket gør teknikken uegnet til biomedicinske anvendelser. En nylig indført nye spektrometer overvinder denne udfordring ved at ansætte to VIPAs på tværs af aksen konfiguration. Denne nyskabelse gør det muligt for sub-gigahertz (GHz) opløsning spektralanalyse med sub-anden erhvervelse tid og belysning magt inden de sikkerhedsmæssige grænser for biologisk væv. De mange nye applikationer lettes af denne forbedring er currently blive undersøgt i biologisk forskning og klinisk anvendelse.
Introduction
Brillouin spredning, først beskrevet af Leon Brillouin 1 i 1922, er uelastisk spredning af lys fra de termiske akustiske modes i et solidt og fra den termiske udsving densitet i en væske eller gas. Den spektrale forskydning af det spredte lys, som regel i sub GHz-området, giver oplysninger om samspillet mellem det indfaldende lys og de akustiske fononer i prøven. Som et resultat, kan det give nyttig information om de viskoelastiske egenskaber af det undersøgte materiale.
I sin spontane udgave, generelt Brillouin spredning har tværsnit i størrelsesordenen Raman-spredning, hvilket resulterer i et meget svagt signal. Derudover Brillouin frekvens skift er størrelsesordener mindre end Raman skift. Som følge heraf, elastisk spredte lys (fra Rayleigh eller Mie spredning), falsk lys, og back-off refleksioner af prøven kan alle let overskygge Brillouin spektrale signatur. Derfor, En Brillouin spektrometer skal ikke kun nå sub-GHz spektral opløsning, men også høj spektral kontrast eller udryddelse.
I traditionelle Brillouin spektrometre disse krav er opfyldt ved scanning-rivning monokromatorer, optiske bankende metoder og, mest populært, multiple-pass scanning Fabry-Perot interferometre 2. Disse metoder måler hver spektralkomponent sekventielt. Denne tilgang fører til erhvervelse gange for en enkelt Brillouin spektrum lige fra nogle få minutter til flere timer, afhængigt af instrumentet, og på prøven. De to-trins VIPA spektrometer, bygget ved hjælp af denne protokol, har evnen til at samle alle de spektrale komponenter inden for mindre end et sekund samtidig give tilstrækkelig udslettelse (> 60 dB) til effektivt at undertrykke andre falske signaler 2.
Integrationen af VIPA etalons er det centrale element i denne spektrometer. En VIPA er en solid etalon med tre forskellige cvariabelt områder: i den forreste overflade, giver en smal antireflekterende belægning strimmel af lys ind i VIPA, mens resten af overfladen har et stærkt reflekterende (HR) belægning; i den bageste overflade, en delvist reflekterende belægning tillader en lille del (~ 5%) af det lys, der skal transmitteres. Når fokuseret på den smalle indgangen til lidt på skrå VIPA, bliver lysstrålen reflekteres i delkomponenter med fast fase forskel i VIPA 2. Interferens mellem sub komponenter opnår den tilstræbte høj spektral spredning. Justering to VIPAs sekventielt på tværs af aksen konfiguration introducerer spektral spredning i vinkelrette retninger 3. Den spektrale dispersion i vinkelrette retninger rumligt adskiller Brillouin toppe fra uønskede krydstale, hvilket gør det muligt kun at stige Brillouin signal. Figur 1 viser en skematisk afbildning af de to trin VIPA spektrometer. Pilene under de optiske elementer angiver degree frihed, hvor translationelle etaper bør være orienteret.
Figur 1. Instrumental opsætning. En optisk fiber leverer Brillouin spredning i spektrometer. En cylindrisk linse C1 (f = 200 mm) fokuserer lyset ind i indgangen til den første VIPA (VIPA1). En anden cylindrisk linse C2 (f = 200 mm) kortlægger den spektrale kantede dispersion i en rumlig adskillelse i brændplan C2. I dette plan, er en lodret maske anvendes til at vælge den ønskede del af spektret. Et analogt konfiguration følger, vippes ved 90 grader. Strålen passerer gennem en sfærisk linse S1 (f = 200 mm) og fokuseres i indgangsslidsen for det andet VIPA (VIPA2). En sfærisk linse S2 (f = 200 mm) skaber det todimensionale spektralt adskilte mønster i brændplanet, hvor en anden vandret maske er placeret. Den horsontale maske afbildes på EMCCD kamera ved hjælp af en akromatisk linse par. Klik her for at se en større version af dette tal.
En bachelor studerende med nogle optik kursusaktiviteter og grundlæggende justering erfaring bør være i stand til at opbygge og bruge denne to-trins spektrometer. Spektrometeret er for nylig blevet vist at være kompatibel med en række standard optiske prober 3,4,5 (f.eks konfokalt mikroskop, endoskop, spaltelampe oftalmoskop). Her er spektrometer forbundet til et konfokalt mikroskop. Laserlyset er rettet ind i en standard forskning omvendt mikroskop systemet efter at integrere en 90:10 stråledeler. Den tilbagespredning fra prøven kobles til en enkelt mode fiber, hvilket gør mikroskopet konfokal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Brillouin spektralanalyse kræver et enkelt længde-mode laser (~ 10 mW ved prøven). Til justering øjemed, anvendelse en stærkt svækket del af denne laserstråle (<0,1 mW).
1. Indledende opsætning af Fiber og EMCCD (Electron ganget Charge Coupled Device) Kamera
- Identificere omkring 1.600 mm fri justering plads til spektrometer på en optisk tabel.
- Monter EMCCD kameraet ved udgangen af den frie justering plads.
- Brug skruerne til at montere kameraet på indlæg. Spænd indlæg i stillingsindehavere på det ønskede optiske akse højde. Spænd stillingsindehavere på optiske tabel ved hjælp bordklemmer.
- Tænd EMCCD kamera. Vær opmærksom på at undgå kamera mætning.
- Installer kamera software på lab computer og tilslutte kameraet til computeren.
- Deaktiver forstærkningen og indstille lav integration tid (~ 0,01 sek). Begynd at erhverve EMCCD billeder. Overhold kamerabilledets på computerskærmen.
- Monter fiber kollimatoren omkring 1.600 mm foran kameraet.
- Placer fiber kollimatoren i fiberen kollimator adapter.
- Monter adapteren på et indlæg. Spænd stillingen i en stillingsindehaver på den omtrentlige højde af den optiske akse (højde af kameraet). Stram stillingsindehaver på optisk tabel ved hjælp bordklemmer.
- Juster output stråle langs den optiske akse.
- Brug en stilleskrue til at forbinde en standard iris til et indlæg. Spænd stillingen i en stillingsindehaver.
- Placer iris foran fiber kollimator (<50 mm). Justere højden af iris til bjælken. Flyt iris langs den ønskede optiske akse, som skal pege direkte ind i kameraet.
- Sæt et optisk filter tæthed direkte efter laser udgang, hvis kameraet mættede fedtsyrer. Brug justeringsskruerne af fiberen kollimator mount at tilpasse strålen langs den optiske akse. Når dette er opnået,stråle rent passere gennem irisen langs hele strålegangen.
- Montere en matchet akromatisk linse par (f = 30 mm) foran kameraet.
2. Horisontal fase af Spectrometer
- Monter horisontale maske.
- Brug skruerne til at fastgøre den vandrette maske på et indlæg. Spænd stillingen i en stillingsindehaver. Monter Stillingsindehaveren på en translationel fase, således at masken at glide horisontalt ind og ud af strålegangen. (Figur 1)
- Brug sætskruer at stramme den translationelle fase på den optiske bordet, således at masken er afbildet skarpt på CCD-kameraet ved brændvidden (f = 30 mm) af akromatisk linse par.
- Mount og tilpasse sfærisk linse S1 (f = 200 mm) 600 mm foran den horisontale maske.
- Brug skruerne til at montere S1 på en stillingsindehaver. Spænd stillingen i en stillingsindehaver.
- Monter to iris som beskrevet i 1.5.1. Før placing S1 i strålegangen, indsætte en iris før og en iris efter den ønskede position S1 (600 mm foran den horisontale maske). Juster højden af iris, således at strålen rent passerer gennem dem begge.
- Placer S1 600 mm foran den horisontale maske (figur 1). Juster højde og vinkel S1 indtil både, bagsiden refleksion ud af linsen og ud kommende stråle, rent passere gennem iris. Spænd stillingsindehaver holder S1 på optiske tabel ved hjælp bordklemmer.
- Mount VIPA2 i brændplanet af sfærisk linse (200 mm foran S1).
- Monter VIPA holderen på en post ved hjælp af de medfølgende skruer med holderen. Spænd stillingen i en stillingsindehaver. Spænd Stillingsindehaveren på en horisontal forskydningstrin. (Figur 1)
- Placer VIPA2 omhyggeligt i VIPA holderen med indgangen slids orienteret lodret. (Figur 1)
- Fin-justere placeringen of VIPA montere at være præcis i brændplanet af S1. (Check ved at spore strålen taljen med et hvidt kort.)
- Brug cap skruer til at stramme translationel etape på den optiske bord og slide VIPA2 ud af strålen ved hjælp af graden af frihed, translationel etape.
- Mount og tilpasse sfærisk linse S2 (f = 200 mm) 200 mm efter at VIPA og 200 mm foran den horisontale maske. Følg proceduren beskrevet i 2.2.1-2.2.3. I stedet for at fastgøre stolpen holderen på det optiske tabellen, montere den på en translationel fase med frihedsgrad orienteret langs den optiske akse. (Figur 1) Brug cylinderskruer at stramme den translationelle fase på den optiske tabel.
- Brug den vandrette translationel etape (2.3.4) for at skubbe VIPA2 indgangen ind i strålen sti. Overhold lodrette linjer på kameraet billedet.
- Fin-justering S2 ved hjælp af den translationelle etape monteret i 2.4, indtil de lodrette linjer på kameraet billedet visesskarp.
- Juster spektret med vandret-tilt grad af frihed på VIPA indehaveren og translationel scenen. Brug den vandrette-oversættelse grad af frihed til at tune indgangen positionen af strålen ind i Etalon. Brug den vandrette-tilt grad af frihed til at tune input vinkel strålen ind i Etalon.
- Mål finesse og gennemløb.
- Tag et billede ved at trykke F5 eller alternativt ved at klikke på "setup erhvervelse" i øverste venstre hjørne og vælge indstillingen "tage billede" i kameraet software.
- Højreklik på billedet og vælger "linien plot". Træk markøren vandret over billedet for at frembringe en linje plot. Slip markøren til at observere den genererede linje plot.
- Brug den linje plottet til at måle finesse. Divider afstanden mellem to toppe ved deres fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM). Sigt efter> 30.
- Bestem gennemløb ved measuring magten med en power meter umiddelbart før og efter VIPA2. Målet for> 50%.
- Tune input vinkel strålen ind i Etalon med den grad af frihed på VIPA holderen (2.6) og observere afvejning mellem finesse og gennemløb.
- Hvis finesse og gennemløb ikke er tilfredsstillende gå tilbage og fin-justere tilpasningen. Sørg VIPA2 er i brændplanet af S1. Gentag trin 2.3.3 -2,7.
3. Lodret fase af Spectrometer
- Skub VIPA (VIPA2), justeret i del 2, ud af strålen ved hjælp af den translationelle fase (2.3.4). Den vandrette trin i spektrometer vil nu opføre sig som en 1: 1 imaging system.
- Monter lodrette maske.
- Brug skruerne til at fastgøre den lodrette maske på et indlæg. Spænd et indlæg ind i en ret vinkel indlæg klemme adapter. Spænd en anden stilling i den rigtige vinkel adapter og sætte det ind i en stillingsindehaver. Monter stillingsindehaver på en lodret translationel scene, allowing masken at glide lodret ind og ud af strålegangen. (Figur 1)
- Brug cylinderskruer at stramme den lodrette translationelle fase på optiske tabel, således at den lodrette maske afbildes skarpt på EMCCD kameraet 200 mm foran S1.
- Mount og tilpasse cylindriske linse C1 (f = 200 mm) 600 mm foran det lodrette maske.
- Skru cylindriske linse holderen på et indlæg. Spænd stillingen i en stillingsindehaver. Placer forsigtigt C1 i linseholderen og stram skruerne til at ordne det på plads.
- Monter to iris som beskrevet i 1.5.1. Før du placerer C1 i strålegangen, indsætte en iris før og en iris efter den ønskede S1 positionen (600 mm foran det lodrette maske). Juster højden af iris, således at strålen rent passerer gennem dem begge.
- Place C1 600 mm foran det lodrette masken (figur 1). Justere forsigtigt højde, tilt og laterale position C1 indtilbåde, bagsiden refleksion ud af linsen og ud kommende stråle, er fokuseret på de iris. Spænd stillingsindehaver bedriften C1 på den optiske tabel ved hjælp bordklemmer.
- Mount VIPA1 i brændplanet af cylindriske linse (200 mm foran C1).
- Monter VIPA holderen på et indlæg med skruen forsynet med holderen. Spænd stillingen i en stillingsindehaver. Spænd Stillingsindehaveren på en lodret forskydningstrin. (Figur 1)
- Placer VIPA1 forsigtigt ind i VIPA holderen med indgangen slids orienteret vandret. (Figur 1)
- Fin-justere placeringen af VIPA montere at placere VIPA1 nøjagtigt i brændplanet C1. (Check ved at spore strålen taljen med et hvidt kort.)
- Brug cap skruer til at stramme den lodrette translationel etape på den optiske bord og skub VIPA1 ud af strålen ved hjælp af graden af frihed, translationel etape.
- Monter og tilpassecylindrisk linse C2 (f = 200 mm) 200 mm efter VIPA1 og 200 mm foran det lodrette maske, efter proceduren beskrevet i 3.3.1-3.3.3. I stedet for at fastgøre stolpen holderen på det optiske tabellen, montere den på en translationel fase med frihedsgrad orienteret langs den optiske akse. (Figur 1) Brug cylinderskruer at stramme den translationelle fase på den optiske tabel.
- Brug oversættelse etape (3.4.4) for at skubbe VIPA1 indgangen ind i strålen sti. Overhold vandrette linjer på kameraet billedet.
- Fin-justering C2 ved hjælp af den translationelle etape monteret i 3,5 indtil de vandrette linjer på kameraet billedet vises skarpt.
- Juster spektret med den lodrette-tilt grad af frihed på VIPA indehaveren og translationel scenen. Brug den lodrette-oversættelse grad af frihed til at tune indgangen positionen af strålen ind i Etalon. Brug den lodrette-tilt grad af frihed til at tune input vinkel strålen ind i Etalpå.
- Mål finesse og gennemløb.
- Følg trin 2.7.1 -2.7.2 at generere en linje plot lodret hen et billede af kameraskærmen.
- Brug linjeplot at måle finesse ved at dividere afstanden mellem to vandrette linjer ved deres fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM). Sigt efter> 40.
- Mål gennemløb ved at måle strøm med en power meter umiddelbart før og efter VIPA1. Målet for> 30%.
- Tune lodrette input vinkel strålen i Etalon med den lodrette hældning grad af frihed på VIPA holderen (3.7). Overhold afvejning mellem finesse og gennemløb.
- Hvis finesse og gennemløb ikke er tilfredsstillende gå tilbage og fin-justere tilpasningen. Sørg VIPA1 er i brændplanet C1. Gentag trin 3.4.3-3.8.
4. Kombination af de to etaper og Final Alignment
- Glide i VIPA2. Overhold vandret og lodret afstand prikker. Disse prikker enre den spektrale underskrift enkelt frekvens laser. Juster translationelle stadier af VIPAs indtil prikkerne er i skarp fokus.
- Mål finesse og gennemløb af spektrometer.
- Følg trin 2.7.1.-2.7.2 for at generere en linje plot diagonalt på tværs to af laser prikker.
- Brug linjeplot at måle finesse ved at dividere den diagonale afstand mellem to punkter ved deres fulde bredde ved halvt maksimum (FWHM). Sigt efter> 30.
- Byg en sort boks til at omslutte spektrometer.
- Brug byggeri skinner til at opbygge skelettet kassen, som skal omslutte hele spektrometer fra fiberen kollimator til CCD-kameraet (63 cm x 9 cm x 15 tommer).
- Dæk skelettet boks med Blackout Fabric og tape det fast i hjørnerne. Sørg for, at masker og de VIPAs er let tilgængelige.
- Slut fiber til en standard optisk sonde, såsom en reflektans konfokalt mikroskop 4. Standard optisk pklæder, der anvendes til at indsamle tilbage-spredte lys vil bære en Brillouin signal.
5. Måling af Brillouin Shift
- Luk både lodrette og den vandrette masker, indtil laseren signatur forsvinder. Flyt etaper oversættelse i overensstemmelse hermed.
- Aktiver forstærkningen og øge integrationstiden kameraets så meget som muligt uden at mætte EMCCD kamera.
- Overhold Brillouin skift af en prøve.
- Placer en prøve i fokus i et konfokalt mikroskop (eller anden optisk sonde). Den rumlige opløsning vil afhænge af objektivlinsen anvendes i konfokalt mikroskop. Brug en plastik skål eller en kuvette for væsker. Brug Methanol for den første måling.
- For at optimere spektrometer gennemløb, åbent én maske ad gangen og scanne gennem de spektrometer ordrer ved at vippe VIPA og justere dets oversættelse scenen. Find den rækkefølge, som signalet vises den stærkeste. Tæt maske igen indtil the laser signalet forsvinder. Gentag med den anden maske og VIPA (beskrevet i 2.6 og 3.7).
- Foretage en måling af prøven.
- Tag et billede af spektret efter trin 2.7.1.
- Opnå kalibreringsmålinger ved at tage et billede af spektret af vand og glas (eller anden prøve med kendt Brillouin skift). Gem billedet ved at klikke på "File" i øverste venstre hjørne og vælge muligheden "gem som". Gem billedet i ".sif" format, hvis dataanalysen udføres i kameraet software. Gem billedet i ".tif" format, hvis analysen af data er udført i et andet beregningsmæssige softwareprogram.
6. Kalibrering og analyse af Brillouin Spectrum
- Bestem frie spektrale område (FSR) og EMCCD pixel for optisk frekvens conversion ratio (PR) i Brillouin spektrometer.
- Indlæse data i kameraet software eller anden computationale program.
- Følg trin 2.7.2 at generere en linje plot hele spektret af vandet kalibrering billedet.
- Monter de to toppe af spektret med Lorentz kurver at bestemme toppositioner i form af pixel position (P Vand-S, P Vand-AS). Alternativt udlæse toppositioner manuelt ved at tage det højeste punkt af toppene.
- Gentag trin 6.1.2-6.1.3 med spektret af glasset kalibrering billedet.
- Alternativt til 6.1.1-6.1.4, tilføje både EMCCD rammer og passer alle fire toppe på en gang. (Figur 2)
- Beregn PR ved anvendelse af ligning 1. Sæt værdierne for P Vand-AS og P Glass-som bestemt i 6.1.3 og 6.1.4. Ω Glass-AS vides at være 29,3 GHz. I dette tilfælde, da det frie spektrale område er kun 20 GHz det vises alias med den hyppighed skift på 9,3 GHz. For enkelhedens skyld anvender 9,3 GHz til Ω Glass-AS. Brug 7.46 GHz for ΩVand-AS.
- Beregn FSR ved hjælp af ligning 2. Sæt i værdierne for P Glas-S, P Glass-AS og PR, beregnet i 6.16. Brug 9,3 GHz til Ω Glass-AS.
Figur 2. Spektrometer kalibrering. (A) EMCCD kamera ramme opnået fra kalibreringsprøve. (B) Lorentz kurvetilpasning (rød) til de målte data (blå). Klik her for at se en større version af dette tal.
- Bestem Brillouin forskydning afen prøve.
- Følg trin 2.7.2 for at generere en linje scanning hele spektret af prøven.
- Monter de to toppe af spektret med Lorentz kurver at bestemme toppositioner i form af pixel position. Alternativt udlæse toppositioner manuelt ved at tage det højeste punkt af toppene.
- Brug følgende ligninger 4 og 5 og de tidligere beregnede værdier for FSR og PR til at beregne Brillouin skift af prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser repræsentative Brillouin spektre og deres passer til forskellige materialer. De VIPAs begge har en tykkelse på 5 mm, hvilket resulterer i en FSR på ca. 20 GHz. Integrationstiden for disse målinger var 100 msek. 100 målinger blev taget og gennemsnit. Én kalibrering måling blev taget før erhverve spektre.
Figur 3. Brillouin spektre af forskellige materialer. Lorentz kurve fit (rød) til de målte data (blå). (A) Brillouin spektrum af methanol. Den målte Brillouin skift er 5,59 GHz. (B) Brillouin spektrum for ethanol. Den målte Brillouin skift er 5,85 GHz. (C) Brillouin spektrum af polystyren. Den målte Brillouin skift er 14.12 GHz.annonce / 53468 / 53468fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
De opnåede Brillouin forskydninger enig med tidligere offentliggjorte data 3,6,7. For at bestemme om tilpasning af spektrometret er optimal, kan tages mange spektrale målinger af det samme materiale sekventielt, og standardafvigelsen af toppositioner kan beregnes. Figur 4A viser en tids-spor af 250 Brillouin målinger af methanol tages successivt ; et histogram af de evaluerede Brillouin skift er vist i figur 4B. Et godt afstemt spektrometer med 5 mW af lys ved prøven og en integrationstid på 100 ms vil have en standardafvigelse på σ ~ 10 MHz. Ændringer i Brillouin skift inden hornhinde og linse væv er blevet målt til at være i størrelsesordenen 1 GHz 9,10,11. Derfor vil Brillouin skift aflæsninger med variabilitet ≤10 MHz muliggøre måling af relevantemekaniske variationer i væv.
Figur 4. Afvigelse i Brillouin skift over 250 methanol målinger. (A) Time-spor af 250 Brillouin målinger af methanol. (B) Histogram af Brillouin skift afvigelse over 250 målinger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et centralt træk i denne spektrometer konfiguration er, at de to faser kan justeres uafhængigt af hinanden. Når en VIPA Etalon glides ud af den optiske bane, de resterende linser af spektrometret fase danner en 1: 1 imaging system, således at den spektrale mønster fra hvert trin er afbildet på CCD-kameraet. Derfor er det ligetil at gå tilbage til enten en af de faser for at forbedre sine resultater uden at påvirke tilpasningen af den anden fase. Sættet af translationelle stadier og frihedsgrader foreslået i protokollen følge denne filosofi om at bevare evnen til selvstændigt at optimere begge faser af spektrometer.
Det er svært at montere VIPA etalons således at tilt frihedsgrad roterer rundt indtastningsvinduet akse. Efterfølgende når der arbejdes med kommercielt tilgængelige opto-mekanisk komponenter, vippe Etalon uundgåeligt introducerer en lille oversættelse af input-vinduet. Den translation langs den optiske akse skal beam fremprovokere negative virkninger på grund af den store Rayleigh række input-linsen (~ 3 mm). På den anden side kan oversættelsen på aksen vinkelret på strålen formering signifikant nedsætter omsætningen af spektrometer. Det er derfor, det translationelle og tilt frihedsgrader på VIPA holderen kun kan betjenes i tandem for at maksimere finesse og gennemløb. Det foreslås at indlede proceduren tilpasningen til relativt høje tilt vinkel (~ 3-5 grader), så koblingen lys ind i VIPA Etalon er næsten tabsfri. Da tilpasningen forbedres, kan hældningsvinklen reduceres for at forbedre finesse. Optimeringen af finesse og gennemløb er en vigtig del af protokollen tilpasning, især for applikationer i biologiske materialer, hvor integration tid og laser magt skal holdes så lavt som muligt.
I protokollen, er det blevet foreslået at ekstrahere Brillouin skift fra tHan analyse af to spektrale spidser, nemlig Stokes og Anti-Stokes toppe fra to tilstødende diffraktion ordrer. Dette er i sig selv en robust procedure, der minimerer artefakter på grund af laser frekvens driver, eller ændringer etalon temperatur. Dog kan måle toppe med signifikant forskellig spektral forskydning har ulemper. Faktisk er den medfølgende procedure for spektral kalibrering baseret på antagelsen om konstant spektral dispersion på tværs af spektrale mønster. I virkeligheden, den spektrale spredning øges i de lavere klasser af diffraktion. Som et resultat, regionerne i spektret, som analyseres (dvs. de Stokes og Anti-Stokes toppe fra to tilstødende diffraktion ordrer) kan have forskellige spektrale dispersioner. I dette tilfælde vil den spektrale kalibrering skrevet her give unøjagtige Brillouin skift. Det foreslås, at flere materialer med kendt Brillouin skift bør anvendes i denne situation til at bygge en spektral kalibreringskurve med polynomium. Dette er især vigtigt, hvis den absolutte værdi af Brillouin skift skal sammenlignes snarere end den relative ændring i Brillouin skift mellem to betingelser.
Typisk finesse af frit-space etalons, herunder VIPA beskrives her, ikke overgå ~ 50. Som følge heraf vil der være en afvejning mellem at overveje høj spektral opløsning og frie spektrale område. I denne protokol en frie spektrale område på 20 GHz er foreslået for grøn (532 nm) laser operation, da de fleste biomaterialer har Brillouin forskydninger på mindre end 10 GHz. Kun halvdelen af FSR er tilgængelig for Brillouin analyse, fordi Stokes og anti-Stokes frekvensskift større end halvdelen FSR vil blive vist alias i spektret.
Hvis der stødt på vanskeligheder i at observere Brillouin-signalet, er det vigtigt at erkende, om spørgsmålene er relateret til en stor mængde af falsk lys, eller til et lavt antal Brillouin fotoner. Overdreven omstrejfende light skal effektivt elimineret. Sørg for, at den sorte boks kabinettet er lystæt. Uden prøve, bør tænde værelse lys eller slukke laseren ikke væsentligt ændre EMCCD kamera baggrunden foton tæller. For at eliminere laserlys reflekteret af prøven overflade tiltes prøven, og start iagttagelse med rumlige masker lukket så meget som muligt uden at blokere signalet. Disse to procedurer vil gøre det muligt at øge integrationen tid, at observation af en meget dim Brillouin signal. Hvis der stadig ikke er noget signal, er det sandsynligt, at Brillouin signal er for svagt. Brug en anden prøve med stærke Brillouin signal såsom methanol, eller tjek tilpasningen af optikken indsamling i konfokale mikroskop. Efter en vellykket observere et signal, optimere den yderligere ved at følge trin 5.4 beskrevet i protokollen.
Tab af indfaldende lys på grund af absorption eller spredning vil øge opkøbet tid required til prøveanalyse. Som følge heraf er de bedste resultater opnås sædvanligvis i gennemsigtige eller tynde materialer. Et godt afstemt spektrometer bør være i stand til at få en høj foton count (> 1.000 på toppen) med 5 mW af lys ved prøven og 100ms integration tid til flydende materialer eller klare plastik prøver. Det er betydeligt hurtigere end traditionelle scanning spektrometre. På grund af sin lave erhvervelse tid og belysning magt, har sådan et spektrometer aktiveret ved hjælp Brillouin spektroskopi til in vivo -Mekaniske billeddannelse 3,10,11,12. Ved hjælp af denne type spektrometer, har flere grupper demonstreret en lang række applikationer, såsom måling af rheologiske egenskaber af øjets linse 13, afsløre bakteriel meningitis i spinalvæske 4, samt analyse af hornhinden elasticitetsmodul 14.
Yderligere forbedringer af spektrometer ventes i den nærmeste fremtid, især hvis lavt tab ultra-snævre båndpass og / eller notch-filter kan indarbejdes til at slappe af udslettelse krav til VIPA spektral spredning. Da spektrometer kan anvendes i kombination med en række standard optiske prober, f.eks konfokale mikroskoper 3,4,5, endoskoper og spaltelampe oftalmoskoper, kunne VIPA spektrometer være en medvirkende komponent i flere biomedicinske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
