Summary
Her presenterer vi en protokoll for å bygge en rask Brillouin spektrometer. Cascading nesten avbildes fase array (Vipa) etalons oppnå en måling hastighet mer enn 1000 ganger raskere enn tradisjonelle skanning Fabry-Perot spektrometre. Denne forbedringen som sørger for Brillouin analyse av vev og biomaterialer ved lave effektnivåer in vivo.
Abstract
Målet med denne protokollen er å bygge en parallell høy utryddelse og høyoppløselig optisk Brillouin spektrometer. Brillouin spektroskopi er en ikke-kontakt måling metode som kan brukes for å oppnå direkte avlesning av viskoelastisk materialegenskaper. Det har vært et nyttig verktøy i materialkarakterisering, strukturelle overvåking og miljø sensing. I det siste har Brillouin spek vanligvis ansatt skanning Fabry-Perot etalons å utføre spektralanalyse. Denne prosessen krever høy effekt og belysning lange innhentingstider, noe som gjør teknikken uegnet for biomedisinske anvendelser. En nylig innført roman spektrometer seirer denne utfordringen ved å ansette to VIPAs i et kryss-aksen konfigurasjon. Denne innovasjonen gir sub-gigahertz (GHz) oppløsning spektralanalyse med under andre oppkjøp tid og belysning makt innenfor grensene sikkerhetskravene i biologisk vev. De mange nye applikasjoner tilrettelagt av denne forbedringen er currently blir utforsket i biologisk forskning og klinisk anvendelse.
Introduction
Brillouin-spredning, først beskrevet av Leon Brillouin 1 i 1922, er uelastisk spredning av lys fra de termiske akustiske modi i en solid og fra de varme tetthetsvariasjoner i en væske eller gass. Den spektrale forskyvning av spredt lys, vanligvis i under GHz-serien, gir informasjon om samspillet mellom den innfallende lyset og de akustiske fononer i utvalget. Som et resultat, kan det gi nyttig informasjon om de viskoelastiske egenskapene til det undersøkte materiale.
I sin spontane versjon, har Brillouin-spredning generelt tverrsnitt i størrelsesorden Raman-spredning, som resulterer i et meget svakt signal. I tillegg Brillouin frekvens skift er størrelsesordener mindre enn Raman skift. Som en konsekvens, elastisk spredt lys (fra Rayleigh eller Mie-spredning), strølys, og tilbake-refleksjoner ut av prøven kan lett overskygge Brillouin spektrale signaturen. Derav, Trenger en Brillouin spektrometer å ikke bare oppnå sub-GHz spektral oppløsning, men også høy spektral kontrast eller utryddelse.
I tradisjonelle Brillouin spektrometre disse kravene er oppfylt ved skanning-grating monokromatorer, optiske juling metoder, og, mest populært, multiple-pass skanning Fabry-Perot Interferometre 2. Disse metodene måle hver spektralkomponent sekvensielt. Denne fremgangsmåten fører til innhentingstider for en enkelt Brillouin spektrum som strekker seg fra noen få minutter til flere timer, avhengig av apparatet og på prøven. Den to-trinns VIPA spektrometer, bygget ved hjelp av denne protokollen, har evnen til å samle alle de spektrale komponentene i løpet av mindre enn et sekund og samtidig gi tilstrekkelig ekstinksjon (> 60 dB) til effektivt å undertrykke andre uønskede signaler 2.
Integrasjonen av Vipa etalons er det sentrale element i denne spektrometer. En VIPA er et solid etalon med tre forskjellige cytende områder: i front, en smal antirefleksbelegg stripe gjør at lys inn i VIPA, mens resten av overflaten har en svært reflekterende (HR) belegg; på den bakre overflate, gjør det mulig for en delvis reflekterende belegg en liten del (~ 5%) av det lys som skal overføres. Når fokusert på den smale inngangen til litt på skrå VIPA, blir lysstrålen reflekteres i delkomponenter med fast fase forskjell i VIPA to. Interferens mellom underkomponentene oppnår håpet høy spektral spredning. Samkjøre to VIPAs sekvensielt i tverrakse konfigurasjon introduserer spektral spredning i ortogonale retninger 3. Den spektrale dispersjon i ortogonale retninger romlig skiller Brillouin topper fra uønsket krysstale, som gjør det mulig å plukke opp bare Brillouin signal. Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av de to trinns VIPA spektrometer. Pilene under de optiske elementene indikerer graderree av frihet der translasjonsforskning stadier bør være orientert.
Figur 1. Instrumental oppsett. En optisk fiber leverer Brillouin spredning i spektrometeret. En sylindrisk linse C1 (f = 200 mm) fokuserer lyset inn i inngangen til den første VIPA (VIPA1). En annen sylindrisk linse C2 (f = 200 mm) tilordner den spektrale vinkel dispersjonen inn i en romlig atskillelse i fokalplanet for C2. I dette plan er en vertikal maske som brukes for å velge den ønskede delen av spekteret. En analog konfigurasjon følger, skråstilt i 90 grader. Strålen passerer gjennom et sfærisk linse S1 (f = 200 mm) og er fokusert inn i inngangen av den andre slissen VIPA (VIPA2). En sfærisk linse S2 (f = 200 mm) oppretter den todimensjonale spektralt adskilt mønster i sitt midtplan, hvor en annen horisontal masken er plassert. Den horizontal masken er avbildet på EMCCD kameraet ved hjelp av en akromatisk linseparet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En lavere student med litt optikk kurs og enkel justering erfaring bør være i stand til å bygge og bruke denne to-trinns spektrometer. Spektrometeret har nylig blitt vist å være forenlig med en rekke standard optiske sonder 3,4,5 (f.eks konfokalt mikroskop, endoskop, slit-lampe oftalmoskop). Her blir spektrometer koblet til et konfokalt mikroskop. Laserlyset blir justert til en standard invertert forskningssystem mikroskop etter å integrere en 90:10 strålesplitter. Den tilbakespredning lys fra prøven er koplet til en enkeltmodus-fiber, noe som gjør det konfokale mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Brillouin spektralanalyse krever en enkelt langsgående modus-laser (~ 10 mW ved prøven). For å samkjøre formål, bruk en sterkt svekket del av denne laserstråle (<0,1 mW).
1. Første oppsett av Fiber og EMCCD (Electron multiplisert Charge Coupled Device) Kamera
- Identifisere omtrent 1600 mm fri innrettings plass for spektrometeret på et optisk bord.
- Monter EMCCD kamera på slutten av gratis samkjøre plass.
- Bruk justeringsskruene for å feste kameraet til innlegg. Stram innleggene i stillingsinnehavere på den optiske aksen høyde. Stram til stillingsinnehavere på optisk tabellen ved hjelp bordfester.
- Slå på EMCCD kameraet. Vær oppmerksom på å unngå kamera metning.
- Installere kamera programvare på lab og koble kameraet til datamaskinen.
- Deaktiver gevinst og satt lavt integrering tid (~ 0,01 sek). Begynn å anskaffe EMCCD bilder. Observere kamerabildets på dataskjermen.
- Monter fiber kollimatoren om 1.600 mm foran kameraet.
- Plasser fiber kollimatoren i fiber kollimatoren adapter.
- Monter adapteren på et innlegg. Stram innlegget inn i en stolpe holder på den omtrentlige høyden av den optiske aksen (høyden på kameraet). Stram post holder på optisk tabellen ved hjelp bordfester.
- Justere utgangsstrålen langs den optiske aksen.
- Bruke et sett skrue for å koble en standard iris til et innlegg. Stram innlegget inn i en stolpe holderen.
- Plasser iris foran fiberen kollimatoren (<50 mm). Juster høyden av iris til bjelken. Flytt iris langs den optiske aksen, som skal peke rett inn i kameraet.
- Sett inn en optisk tetthet filter rett etter laserutskrifter hvis kamera mettet fett. Bruk justeringsskruer av fiber kollimatoren montere å justere strålen langs den optiske aksen. Når dette er oppnådd,Strålen vil rent passere gjennom iris langs hele strålebanen.
- Montere en matchet akromatisk linse par (f = 30 mm) foran kameraet.
2. Horisontal Stage av Spectrometer
- Monter den horisontale maske.
- Bruk justeringsskruene for å feste den horisontale masken på et innlegg. Stram innlegget inn i en stolpe holderen. Montering av stolpen holder på et translatorisk stadium, slik at masken kan gli horisontalt inn og ut av strålebanen. (Figur 1)
- Bruk hodeskruene til å stramme den translatoriske fasen på det optiske bordet slik at masken avbildes skarpt på CCD-kameraet ved brennvidde (f = 30 mm) av den akromatisk linse paret.
- Montere og justere sfærisk linse S1 (f = 200 mm) 600 mm foran den horisontale maske.
- Bruk justeringsskruene til å montere S1 på et innlegg holder. Stram innlegget inn i en stolpe holderen.
- Monter to iriser som beskrevet i 1.5.1. Før pLacIng S1 i strålebanen, setter en iris før og en iris etter ønsket S1 stilling (600 mm foran den horisontale maske). Justere høyden på iris slik at strålen ren passerer gjennom dem begge.
- Plasser S1 600 mm foran den horisontale masken (figur 1). Justere høyde og vinkel på S1 til begge, baksiden refleksjon av av linsen og ut-coming bjelke, rent passere gjennom iris. Stram post holderen holder S1 på optisk tabellen ved hjelp bordfester.
- Mount VIPA2 i fokalplanet for sfærisk linse (200 mm foran S1).
- Monter VIPA holderen på en post med skruene som følger med holderen. Stram innlegget inn i en stolpe holderen. Stram post holderen på en horisontal oversettelse scenen. (Figur 1)
- Plasser VIPA2 nøye i VIPA holderen med inngang slit orientert vertikalt. (Figur 1)
- Finjustere posisjonen of VIPA montere å være nøyaktig i fokalplanet av S1. (Sjekk ved å spore strålen midjen med et hvitt kort.)
- Bruk hodeskruene for å stramme translasjonsforskning scenen på den optiske bordet og skyv VIPA2 ut av strålen med graden av frihet av translasjonsforskning scenen.
- Montere og justere den sfæriske linsen S2 (f = 200 mm) 200 mm etter VIPA og 200 mm foran den horisontale masken. Følg fremgangsmåten som er beskrevet i 2.2.1-2.2.3. I stedet for å feste stolpen holderen på den optiske bordet, montere den på en translatorisk scene med sin frihetsgrad orientert langs den optiske aksen. (Figur 1) Bruk hodeskruene for å stramme translasjonsforskning scenen på den optiske bordet.
- Bruk liggende translatoriske trinn (2.3.4) for å skyve VIPA2 inngangen i strålegangen. Observere vertikale linjer på kamerabildet.
- Finjustere S2 bruker translasjonsforskning scenen montert i 2,4 inntil de vertikale linjene på kamerabildet visesskarp.
- Juster spektrum med horisontalen-tilt frihetsgrad på VIPA holderen og det translasjonelle trinnet. Bruk liggende oversettelse grad av frihet til å justere inngangs posisjonen til strålen inn i etalon. Bruk den horisontale-tilt grad av frihet til å tune inngangsvinkel strålen inn i etalon.
- Mål finesse og gjennomstrømming.
- Ta et bilde ved å trykke F5 eller alternativt ved å klikke på "oppkjøpet setup" i øvre venstre hjørne og velge alternativet "ta bilde" i kameraprogramvaren.
- Høyreklikk på bildet og velg "linjeplott". Dra markøren horisontalt over bildet for å generere en linje plot. Slipp markøren til å observere den genererte linjeplott.
- Bruk linjeplott for å måle finesse. Fordel avstanden mellom to topper ved sin fulle bredde ved halv maksimum (FWHM). Målet for> 30.
- Bestem gjennomstrømningen av measuring kraften med en kraftmåler umiddelbart før og etter VIPA2. Målet for> 50%.
- Tune inngangsvinkel på strålen inn i etalon med graden av frihet på VIPA holderen (2.6) og observer trade-off mellom finesse og gjennomstrømming.
- Hvis finesse og gjennomstrømming er ikke tilfredsstill gå tilbake og finjustere justeringen. Sørg for VIPA2 er i fokalplanet av S1. Gjenta trinn 2.3.3 -2,7.
3. Vertikal Stage av Spectrometer
- Skyv VIPA (VIPA2), justert i del 2, ut av strålen med translasjonsforskning scenen (2.3.4). Den horisontale fasen av spektrometeret vil nå oppføre seg som en 1: 1 avbildningssystem.
- Monter den vertikale maske.
- Bruk justeringsskruene for å feste den vertikale masken på et innlegg. Stram et innlegg i en rett vinkel klemmen adapter. Stram en annen post i riktig vinkel adapter og sette den inn i en stolpe holderen. Monter post holderen på en vertikal translasjonell scenen, allowing masken for å gli vertikalt inn og ut av strålebanen. (Figur 1)
- Bruk hodeskruene for å stramme den vertikale translasjonsbevegelse fasen på det optiske bordet, slik at den vertikale masken avbildes skarpt på EMCCD kameraet 200 mm foran S1.
- Montere og justere sylindrisk linse C1 (f = 200 mm) 600 mm foran den vertikale masken.
- Skru sylindrisk linse holderen på et innlegg. Stram innlegget inn i en stolpe holderen. Plasser forsiktig C1 i linseholderen og stram til skruene for å feste den på plass.
- Monter to iriser som beskrevet i 1.5.1. Før du plasserer C1 i strålebanen, setter en iris før og en iris etter ønsket S1 stilling (600 mm foran den vertikale maske). Justere høyden på iris slik at strålen ren passerer gjennom dem begge.
- Sted C1 600 mm foran den vertikale mask (figur 1). Justere nøye høyden, tilt, og sideleie av C1 tilbegge deler, på baksiden av refleksjon av linsen og den out-strålen kommer, er sentrert på iriser. Stram post holderen holding C1 på optisk tabellen ved hjelp bordfester.
- Mount VIPA1 i fokalplanet til den sylindriske linsen (200 mm foran C1).
- Monter VIPA holderen på en post med skruen som følger med holderen. Stram innlegget inn i en stolpe holderen. Stram post holderen på en vertikal oversettelse scenen. (Figur 1)
- Plasser VIPA1 forsiktig inn i VIPA holderen med inngang slit orientert horisontalt. (Figur 1)
- Finjustere stillingen av VIPA festet til å plassere VIPA1 nøyaktig i fokalplanet til C1. (Sjekk ved å spore strålen midjen med et hvitt kort.)
- Bruk hodeskruene for å stramme den vertikale translasjonsforskning scenen på den optiske bordet og skyv VIPA1 ut av strålen med graden av frihet av translasjonsforskning scenen.
- Montere og justeresylindrisk linse C2 (f = 200 mm) 200 mm etter VIPA1 og 200 mm foran den vertikale masken, etter fremgangsmåten beskrevet i 3.3.1-3.3.3. I stedet for å feste stolpen holderen på den optiske bordet, montere den på en translatorisk scene med sin frihetsgrad orientert langs den optiske aksen. (Figur 1) Bruk hodeskruene for å stramme translasjonsforskning scenen på den optiske bordet.
- Bruker oversettelsestrinnet (3.4.4) for å skyve VIPA1 inngangen i strålegangen. Observere horisontale linjer på kamerabildet.
- Finjustere C2 med translasjonell scenen montert i 3,5 før de horisontale linjene på kamerabildet vises skarpt.
- Juster spekteret med vertikal-tilt grad av frihet på VIPA holderen og translasjonell scenen. Bruk vertikal-oversettelsen grad av frihet til å justere inngangs posisjonen til strålen inn i etalon. Bruk vertikal-tilt grad av frihet til å tune inngangsvinkel strålen inn i etalpå.
- Mål finesse og gjennomstrømming.
- Følg trinn 2.7.1 -2.7.2 å generere en linjeplott vertikalt over et bilde av kameraskjermen.
- Bruk linjeplott for å måle finesse ved å dividere avstanden mellom to horisontale linjer ved sin fulle bredde ved halv maksimum (FWHM). Målet for> 40.
- Mål gjennomstrømming ved å måle strøm med en kraftmåler umiddelbart før og etter VIPA1. Målet for> 30%.
- Tune den vertikale innspill vinkel på strålen inn i etalon med vertikal-tilt grad av frihet på VIPA holderen (3,7). Observer avveining mellom finesse og gjennomstrømming.
- Hvis finesse og gjennomstrømming er ikke tilfredsstill gå tilbake og finjustere justeringen. Sørg for VIPA1 er i fokalplanet av C1. Gjenta trinn 3.4.3-3.8.
4. Kombinasjon av de to etapper og finalen Alignment
- Skyv i VIPA2. Observere horisontalt og vertikalt atskilte prikker. Disse prikkene enre den spektrale signaturen til enkel frekvens laser. Juster translasjonsforskning stadier av VIPAs før prikkene er i skarp fokus.
- Mål finesse og gjennomstrømningen av spektrometeret.
- Følg trinn 2.7.1.-2.7.2 til å generere en linjeplott diagonalt over to av laser prikker.
- Bruk linjeplott å måle finesse ved å dele den diagonale avstanden mellom to punkter i sin fulle bredde ved halv maksimum (FWHM). Målet for> 30.
- Bygg en svart boks til å vedlegge spektrometeret.
- Bruk bygge rails å bygge boksen skjelett, som skal omslutte hele spektrometer fra fiber kollimatoren til CCD-kamera (63 x 9 x 15 tommer).
- Dekk boksen skjelett med Blackout Fabric og tape den fast i hjørnene. Sørg for at maskene og VIPAs er lett tilgjengelige.
- Koble fiber til en standard optisk sonde, slik som et reflektans konfokalt mikroskop 4. Standard optisk pkapper brukes til å samle tilbake-spredt lys vil bære en Brillouin signal.
5. Måling av Brillouin Shift
- Nære både vertikale og horisontale masker til laser signatur forsvinner. Flytt oversettings etapper tilsvarende.
- Muliggjøre forsterkning og øke integrasjonstiden til kameraet så mye som mulig uten å fukte EMCCD kameraet.
- Observere Brillouin skift av en prøve.
- Plassere en prøve i fokus for en konfokalmikroskop (eller annen optisk probe). Den romlige oppløsning vil avhenge av objektivlinsen som brukes i konfokalt mikroskop. Bruk en plastskål eller en skål for væsker. Bruk Metanol for den første målingen.
- For å optimalisere spektrometer gjennomstrømning, åpne en maske av gangen og skanne gjennom spektrometer ordre ved å vippe VIPA og justere sin oversettelse scenen. Finne rekkefølgen i hvilken signalet vises den sterkeste. Lukk maske igjen før the laser signal forsvinner. Gjenta med den andre masken og VIPA (beskrevet i 2.6 og 3.7).
- Ta en måling av prøven.
- Ta et bilde av spekteret følgende trinn 2.7.1.
- Utføre målinger kalibrerings ved å ta et bilde av spekteret av vann og glass (eller annen prøve med kjent Brillouin-skift). Lagre bildet ved å klikke på "fil" i øvre venstre hjørne og velge alternativet "lagre som". Lagre bildet i ".sif" format hvis dataanalyse blir utført i kameraet programvaren. Lagre bildet i "TIF" format hvis dataanalyse er utført i en annen beregnings programmet.
6. Kalibrering og analyse av Brillouin Spectrum
- Bestem gratis spektralområde (FSR) og EMCCD pixel til optisk frekvens konvertering ratio (PR) i Brillouin spektrometer.
- Laste inn data i kameraprogramvaren eller annen computaelle programmet.
- Følg trinn 2.7.2 til å generere en linje plott over hele spekteret av vannet kalibreringsbildet.
- Monter de to toppene i spekteret med Lorentzian kurver for å avgjøre toppstillinger i form av pikselposisjon (P Vann-S, P Vann AS). Alternativt lese ut topposisjonene manuelt ved å ta det høyeste punktet av toppene.
- Gjenta trinn 6.1.2-6.1.3 med spektrum av glasskalibreringsbildet.
- Alternativt til 6.1.1-6.1.4, legge både EMCCD rammer og passer alle fire toppene på en gang. (Figur 2)
- Beregn PR ved bruk av ligning 1. Plugg inn verdiene for P Vann AS og P Glass-fastsatt i 6.1.3 og 6.1.4. Ω Glass-AS er kjent for å være 29,3 GHz. I dette tilfelle, siden det frie spektralområdet er bare 20 GHz vil det vises overlappende med den frekvensforskyvning på 9,3 GHz. For enkelhets skyld bruker 9,3 GHz for Ω Glass-AS. Bruk 7.46 GHz for ΩVann-AS.
- Beregn FSR bruker ligning 2. Plugg inn verdiene for P Glass-S, P Glass-AS og PR, beregnet på 6.16. Bruke 9,3 GHz for Ω Glass-AS.
Figur 2. Spectrometer kalibrering. (A) EMCCD kamerarammen oppnådd fra kalibreringsprøven. (B) Lorentzian kurve (rød) til de målte data (blå). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Bestem Brillouin forskyvning aven prøve.
- Følg trinn 2.7.2 til å generere en linje scan over hele spekteret av prøven.
- Monter de to toppene i spekteret med Lorentzian kurver for å avgjøre toppstillinger i form av pikselposisjon. Alternativt lese ut topposisjonene manuelt ved å ta det høyeste punktet av toppene.
- Bruk følgende ligninger 4 og 5 og de tidligere beregnede verdier for FSR og PR for å beregne Brillouin forskyvning av prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser representative Brillouin-spektra og de passer for forskjellige materialer. De VIPAs begge har en tykkelse på 5 mm som resulterer i en FSR på omtrent 20 GHz. Integrasjonstiden for disse målingene var 100 msek. 100 målinger ble tatt og et gjennomsnitt av. En kalibrering målingen ble tatt før anskaffe spektra.
Figur 3. Brillouin Spectra av forskjellige materialer. Lorentzian kurvetilpasning (rød) til de målte data (blå). (A) Brillouin spektrum av metanol. Den målte Brillouin skiftet er 5.59 GHz. (B) Brillouin spektrum av etanol. Den målte Brillouin skiftet er 5,85 GHz. (C) Brillouin spektrum av polystyren. Den målte Brillouin skiftet er 14,12 GHz.ad / 53468 / 53468fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De oppnådde Brillouin skift enig med tidligere publiserte data 3,6,7. For å bestemme om justeringen av spektrometeret er optimale, kan mange spektrale målinger av det samme materiale som tas i rekkefølge, og standardavviket av de topposisjonene kan beregnes. Figur 4A viser en tids-spor 250 Brillouin målinger av metanol tatt sekvensielt ; et histogram av de evaluerte Brillouin skift er vist i figur 4B. Et godt justert spektrometer med 5 mW av lys i prøven og en integrasjonstid på 100 millisekunder vil ha et standardavvik på σ ~ 10 MHz. Endringer i Brillouin skifte innen hornhinnen og linsen vev har blitt målt til å være i størrelsesorden 1 GHz 9,10,11. Derfor vil Brillouin skift målinger med variasjon av ≤10 MHz muliggjøre måling av relevantemekaniske variasjoner i vevet.
Figur 4. Avvik i Brillouin forskyvning over 250 metanol-målinger. (A) Tid-spor 250 Brillouin målinger av metanol. (B) Histogram av Brillouin skift avvik over 250 målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et viktig konstruksjonstrekk ved dette spektrometer konfigurasjonen er at de to trinn kan justeres uavhengig av hverandre. Når en VIPA etalon skyves ut av den optiske bane, de resterende linser av spektrometeret trinnet danner et 1: 1-avbildningssystem, slik at den spektrale mønster fra hvert trinn avbildes på CCD-kamera. Derfor er det enkelt å gå tilbake til enten ett av trinnene for å forbedre ytelsen uten at dette påvirker innrettingen av den andre fasen. Settet av translasjonelle stadier og frihetsgrader som foreslås i følge denne protokoll filosofien for å opprettholde evnen til uavhengig å optimalisere begge trinn av spektrometeret.
Det er vanskelig å montere VIPA etalons slik at vippe grad av frihet roterer rundt inngangsvinduet akse. Deretter når de opererer med kommersielt tilgjengelige opto mekaniske komponenter, vippe etalon introduserer uunngåelig en liten oversettelse av inntastingsvinduet. Den translation langs den optiske stråleaksen bør ikke forårsake negative effekter på grunn av det store spekter av Rayleigh inngangslinse (~ 3 mm). På den annen side kan oversettelsen på aksen vinkelrett til bjelken forplantning betydelig redusere gjennomstrømningen av spektrometeret. Dette er grunnen til den translatoriske og vippefrihetsgrader på VIPA holderen må opereres i tandem for å maksimere finesse, og gjennomstrømningen. Det er foreslått å starte justeringsprosedyren med relativt høy vinkel (~ 3-5 grader) slik at koplingen lys inn i VIPA etalon er nesten lossless. Som innretting bedre, kan hellingsvinkelen reduseres for å forbedre finesse. Optimalisering av finesse og gjennomstrømningen er en viktig del av justeringen protokollen, spesielt for applikasjoner i biologisk materiale der integrering tid og laser makt må holdes så lavt som mulig.
I protokollen, er det blitt foreslått å ekstrahere Brillouin skiftet fra tHan analyse av to spektraltopper, nemlig Stokes og anti-Stokes topper fra to tilstøtende diffraksjon bestillinger. Dette er en egen robust prosedyre som minimerer artefakter grunnet laserfrekvens fonner, eller endringer etalon temperatur. Men måling topper med vesentlig forskjellig spektral skift kan ha ulemper. Faktisk er det gitt prosedyre for spektral kalibrering basert på en forutsetning om konstant spektral spredning over spektrale mønster. I virkeligheten øker spektral spredning i de lavere bestillinger av diffraksjon. Som et resultat av de områder av spekteret som blir analysert (dvs. Stokes og anti-Stokes topper fra to tilstøtende diffraksjon ordrer) kan ha ulike spektrale dispersjoner. I dette tilfellet vil den spektrale kalibreringsprosedyren skrevet her gir unøyaktige Brillouin skift. Det er foreslått at flere materialer av kjente Brillouin skift bør anvendes i en slik situasjon å bygge en spektral kalibreringskurve med eksakt tilpasning. Dette er spesielt viktig dersom den absolutte verdi av Brillouin skift må bli sammenlignet i stedet for den relative endring i Brillouin skift mellom to tilstander.
Vanligvis finesse av fri-plass etalons, inkludert VIPA beskrevet her, ikke overgå ~ 50. Som en følge av dette vil det være en avveining for å vurdere mellom høy spektral oppløsning og frie spektralområdet. I denne protokollen en gratis spektral rekkevidde på 20 GHz er foreslått for grønn (532 nm) laser operasjon siden de fleste biomaterialer har Brillouin skift på mindre enn 10 GHz. Bare halvparten av FSR er tilgjengelig for analyse Brillouin fordi Stokes og anti-Stokes frekvensforskyvninger som er større enn halvparten FSR kommer til syne etter overlappet i spekteret.
Dersom problemer oppstår i observere Brillouin signal, er det viktig å kjenne om problemene er relatert til overdreven bruk av strølys, eller til et lavt antall Brillouin fotoner. Overdreven bortkommen light bør være effektivt eliminert. Sørg for at den svarte boksen kabinettet er lystett. Uten prøven, slå på rommet lys eller slå av laseren skal ikke vesentlig endre EMCCD kamera bakgrunnen foton teller. For å eliminere laserlys reflekteres fra prøvens overflate, for svakt skrå prøven, og starte med observasjon romlige masker lukket så mye som mulig uten å blokkere signalet. Disse to fremgangsmåter gjør det mulig å øke integreringstiden for å tillate observasjon av en meget svak Brillouin-signal. Hvis det fortsatt er det ingen signal, er det sannsynlig at Brillouin signalet er for svakt. Bruk en annen prøve med sterk Brillouin signal som Metanol, eller sjekk justeringen av samlingen optikk i konfokal mikroskop. Etter vellykket observere et signal, optimalisere den ytterligere ved å følge trinn 5.4 som er beskrevet i protokollen.
Tap av innfallende lys på grunn av absorpsjon eller spredning vil øke innsamlingstiden required for analyse av prøver. Som et resultat, er de beste resultater oppnås vanligvis i gjennomsiktige eller tynne materialer. En godt justert spektrometer skal kunne få en høy foton count (> 1000 på toppen) med 5 mW av lys på prøven og 100ms integrering tid for flytende materialer eller klar plast prøver. Dette er betydelig raskere enn tradisjonelle skanning spektrometre. På grunn av sin lave anskaffelses- tid og belysning makt, har en slik spektrometer aktiveres ved hjelp av Brillouin spektroskopi for in vivo -mechanical bildebehandling 3,10,11,12. Ved hjelp av denne type spektrometer, har flere grupper vist en rekke applikasjoner som for eksempel måling av de reologiske egenskaper for øyet linsen 13, detektering av bakteriell meningitt i spinalvæske 4, og analysering av hornhinnen elastisitetsmodul 14.
Ytterligere forbedringer i spektrometeret er ventet i den nærmeste fremtid, spesielt hvis lave tap ultra-smalbåndpass og / eller hakk filter kan innlemmes å slappe av utryddelse krav på VIPA spektral spredning. Siden spektrometer kan benyttes i kombinasjon med en rekke standard optiske sonder, for eksempel konfokale mikroskop 3,4,5, endoskoper, og spaltelampe Oftalmoskoper, kan VIPA spektrometeret være en medvirkende komponent i mange biomedisinske anvendelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
