Summary
هنا نقدم بروتوكول لبناء مطياف Brillouin السريع. المتتالية تصوير تقريبا مجموعة مرحلة (VIPA) etalons تحقيق سرعة قياس أكثر من 1000 مرة أسرع من المسح التقليدي الطيف فابري بيرو. يوفر هذا التحسن وسيلة لتحليل Brillouin من الأنسجة والمواد الحيوية عند مستويات منخفضة الطاقة في الجسم الحي.
Abstract
والهدف من هذا البروتوكول هو بناء مواز عالية الانقراض وعالية الدقة Brillouin البصرية مطياف. Brillouin الطيفي هو وسيلة قياس عدم الاتصال التي يمكن استخدامها للحصول على قراءات مباشرة لخصائص المواد اللزجة. فقد كان أداة مفيدة في توصيف المواد، ورصد الهيكلي والاستشعار البيئي. في الماضي، وقد Brillouin الطيفي عادة المستخدمة المسح etalons فابري بيرو لأداء التحليل الطيفي. هذه العملية تتطلب طاقة عالية الإضاءة وأوقات اكتساب طويلة، مما يجعل هذه التقنية غير مناسبة للتطبيقات الطبية الحيوية. A مطياف رواية أدخلت مؤخرا يتغلب على هذا التحدي من خلال توظيف اثنين VIPAs في تكوين محور عرضي. هذا الابتكار يمكن (غيغاهرتز) التحليل الطيفي الدقة جيجاهيرتز من الباطن مع اكتساب الوقت الفرعي الثاني وقوة الإضاءة في حدود سلامة الأنسجة البيولوجية. تطبيقات جديدة متعددة سهلت هذا التحسن هي مكعبrrently التي يجري استكشافها في الأبحاث البيولوجية والتطبيق السريري.
Introduction
نثر Brillouin، وصف لأول مرة من قبل ليون برويون 1 في عام 1922، هو نثر غير مرن الضوء من وسائط الصوتية الحرارية في الحالة الصلبة ومن تقلبات الكثافة الحرارية في سائل أو غاز. التحول الطيفي للضوء متناثرة، وعادة في شبه غيغاهرتز المدى، يوفر المعلومات حول التفاعل بين الضوء الساقط والفونونات الصوتية في العينة. ونتيجة لذلك، يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن الخصائص اللزجة من المواد التي تم فحصها.
في نسخته عفوية، Brillouin نثر له عموما المقاطع العرضية في ترتيب رامان نثر، مما أدى في إشارة ضعيفة جدا. بالإضافة إلى ذلك، والتحولات تردد Brillouin هي أوامر من حجم أصغر من التحولات رامان. ونتيجة لذلك، منتشرة مطاطيا ضوء (من رايلي أو مي نثر)، الضوء الشارد، والخلفية انعكاسات الخروج من عينة يمكن بكل يسر وسهولة تلقي بظلالها على البصمة الطيفية Brillouin. لذلك السببيحتاج مطياف Brillouin ليس فقط لتحقيق غيغاهرتز الفرعي قرار الطيفي ولكن أيضا على النقيض طيفية عالية أو الانقراض.
في الطيف Brillouin التقليدية يتم الوفاء بهذه المتطلبات التي كتبها monochromators-صريف المسح الضوئي، وأساليب الضرب البصرية، والأكثر شعبيا، تداخل متعددة تمريرة مسح فابري بيرو 2. هذه الأساليب تقيس كل بالتتابع المكون الطيفي. هذا النهج يؤدي إلى اكتساب مرات لطيف Brillouin واحد تتراوح بين بضع دقائق إلى عدة ساعات، اعتمادا على الصك وعلى العينة. وVIPA مطياف مرحلتين، تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول، لديه القدرة على جمع كافة المكونات الطيفية في أقل من ثانية مع توفير ما يكفي من الانقراض (> 60 ديسيبل) لقمع فعالية إشارات زائفة أخرى 2.
دمج etalons VIPA هو العنصر الرئيسي لهذا الطيف. A VIPA هو ETALON متينة مع ثلاثة ج مختلفةoating المناطق: في السطح الأمامي، ضيق الشريط المضادة للانعكاس طلاء يسمح للضوء بالدخول إلى VIPA، في حين أن بقية السطح تحتوي على عاكس للغاية (HR) الطلاء؛ في السطح الخلفي، طلاء عاكسة جزئيا يسمح جزء صغير (~ 5٪) من الضوء لإرسالها. عندما تركز على المدخل الضيق للVIPA يميل قليلا، ويحصل ينعكس شعاع الضوء إلى مكونات فرعية مع فرق الطور ثابت داخل VIPA 2. التداخل بين المكونات الفرعية يحقق المنشود تشتت طيفية عالية. التوفيق بين اثنين VIPAs بالتتابع في تكوين محور عبر يدخل تشتت الطيفي في الاتجاهات المتعامدة 3. تشتت الطيفي في الاتجاهات المتعامدة يفصل مكانيا القمم Brillouin من الحديث المتبادل غير المرغوب فيها، الأمر الذي يجعل من الممكن لالتقاط سوى إشارة Brillouin الشكل 1 يعرض التخطيطي لVIPA مطياف مرحلتين. الأسهم أقل من العناصر البصرية تشير إلى درجةري الحرية التي ينبغي أن تكون موجهة المراحل متعدية.
الشكل 1. الإعداد دور فعال. يسلم الألياف البصرية تناثر Brillouin في مطياف. عدسة أسطوانية C1 (و = 200 مم) وتركز الضوء إلى مدخل VIPA الأول (VIPA1). آخر عدسة اسطوانية C2 (و = 200 مم) خرائط تشتت الزاوي الطيفي إلى الانفصال المكاني في المستوى البؤري من C2. في هذه الطائرة، ويستخدم قناع العمودي لتحديد الجزء المطلوب من الطيف. يتبع تكوين مماثل، مائلا بزاوية 90 درجة. شعاع يمر من خلال عدسة كروية S1 (و = 200 مم) ويتركز في فتحة مدخل VIPA الثاني (VIPA2). عدسة كروية S2 (و = 200 مم) يخلق ثنائي الأبعاد نمط فصل طيفيا في طائرتها التنسيق، حيث يتم وضع قناع آخر أفقي. في هورتم تصوير قناع izontal على الكاميرا EMCCD باستخدام زوج عدسة مصاب بعمى الألوان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
طالب الجامعي مع بعض الدورات الدراسية البصريات والخبرة التوفيق الأساسية يجب أن يكون قادرا على بناء واستخدام هذا مرحلتين مطياف. وقد تم مؤخرا أظهرت مطياف لتكون متوافقة مع مجموعة متنوعة من تحقيقات البصرية القياسية 3،4،5 (على سبيل المثال، المجهر متحد البؤر، المنظار، شق مصباح منظار العين). هنا، يتم توصيل مطياف لالمجهر متحد البؤر. يتم محاذاة ضوء الليزر إلى بحث مقلوب المجهر نظام موحد بعد دمج الخائن 90:10 شعاع. ويقترن ضوء ارتداد مبعثر من العينة إلى الألياف وضع واحد، مما يجعل متحد البؤر المجهر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يتطلب تحليل Brillouin الطيفية وضع الليزر أحادية طولية (~ 10 ميغاواط في العينة). لأغراض مواءمة، استخدام جزء الموهن بقوة هذا شعاع ليزر (<0.1 ميغاواط).
1. الإعداد الأولي من الألياف وEMCCD (الكترون ضرب المسؤول إلى جانب جهاز) كاميرا
- تحديد حوالي 1600 ملم مساحة التوفيق مجانا لطيف على طاولة البصري.
- تركيب كاميرا EMCCD في نهاية الفضاء التوفيق مجانا.
- استخدام مسامير تعيين إرفاق الكاميرا على المشاركات. تشديد المشاركات في حملة وظيفة في ذروة المحور البصري المطلوب. تشديد حاملي آخر على الطاولة البصرية باستخدام المشابك الجدول.
- تشغيل الكاميرا EMCCD. أن تضع في اعتبارها لتجنب الكاميرا التشبع.
- تثبيت برنامج الكاميرا على جهاز الكمبيوتر المختبر وتوصيل الكاميرا إلى الكمبيوتر.
- تعطيل تحقيق مكاسب ووضع منخفض الوقت التكامل (~ 0.01 ثانية). بدء الحصول على الصور EMCCD. مراقبة صورة الكاميراالصورة على شاشة الكمبيوتر.
- جبل ميزاء الألياف حوالي 1600 ملم أمام الكاميرا.
- وضع تلسكوب الموازاة الألياف في محول الألياف الموازاة.
- تركيب محول على وظيفة. تشديد آخر في شاغل هذه الوظيفة في ذروة التقريبي للمحور البصري (ارتفاع الكاميرا). تشديد شاغل هذه الوظيفة على طاولة البصرية باستخدام المشابك الجدول.
- محاذاة شعاع الناتج على طول المحور البصري.
- استخدام المسمار مجموعة للاتصال قزحية القياسية إلى آخر. تشديد آخر إلى صاحب المنصب.
- وضع القزحية أمام ميزاء الألياف (<50 مم). ضبط ارتفاع القزحية لشعاع. نقل القزحية على طول المحور البصري المرجوة، والتي ينبغي أن تشير مباشرة الى الكاميرا.
- إدراج مرشح الكثافة الضوئية مباشرة بعد إخراج ليزر إذا كان يشبع الكاميرا. استخدام مسامير تعديل الموازاة الألياف جبل لمحاذاة شعاع على طول المحور البصري. وعندما يتحقق هذا،سوف شعاع تمرير نظيفة من خلال القزحية على طول مسار الشعاع بأكمله.
- جبل زوج متطابق الوني عدسة (F = 30 مم) أمام الكاميرا.
2. أفقي مرحلة مطياف
- جبل القناع الأفقي.
- استخدام مسامير تعيين إرفاق قناع أفقي على وظيفة. تشديد آخر إلى صاحب المنصب. جبل حامل آخر على مرحلة متعدية، والسماح للقناع لتنزلق أفقيا داخل وخارج مسار الشعاع. (الشكل 1)
- استخدام البراغي لتشديد مرحلة متعدية على الطاولة البصرية بحيث يتم تصوير القناع بشكل حاد على كاميرا CCD في المسافة البؤرية (و = 30 مم) لزوج عدسة مصاب بعمى الألوان.
- جبل ومحاذاة عدسة كروية S1 (و = 200 مم) 600 ملم أمام القناع الأفقي.
- استخدام مسامير تعيين لجبل S1 على حامل آخر. تشديد آخر إلى صاحب المنصب.
- جبل اثنين قزحية العين كما هو موضح في 1.5.1. قبل placiنانوغرام S1 في مسار الشعاع، إدراج واحدة قبل قزحية العين والقزحية واحدة بعد موقف S1 المطلوب (600 ملم أمام القناع الأفقي). ضبط ارتفاع قزحية العين بحيث يمر شعاع نظيفة من خلال كل منهما.
- وضع S1 600 ملم أمام القناع الأفقي (الشكل 1). ضبط الارتفاع وزاوية S1 حتى على حد سواء، وانعكاس الخلفي الخروج من العدسة والحزم الخروج، وتمرير نظيفة من خلال قزحية العين. تشديد حامل آخر عقد S1 على الطاولة البصرية باستخدام المشابك الجدول.
- جبل VIPA2 في المستوى البؤري للعدسة كروية (200 ملم أمام S1).
- جبل حامل VIPA على وظيفة باستخدام مسامير المقدمة مع حامل. تشديد آخر إلى صاحب المنصب. تشديد شاغل هذه الوظيفة على مرحلة الترجمة الأفقية. (الشكل 1)
- وضع VIPA2 بعناية في حامل VIPA مع فتحة مدخل موجه عموديا. (الشكل 1)
- غرامة ضبط الموقف سو جبل VIPA أن تكون بالضبط في المستوى البؤري من S1. (تحقق عن طريق تتبع الخصر شعاع مع بطاقة بيضاء).
- استخدام البراغي لتشديد مرحلة متعدية على الطاولة والشرائح VIPA2 البصرية من شعاع باستخدام درجة من الحرية للمرحلة متعدية.
- جبل ومحاذاة عدسة كروية S2 (و = 200 مم) 200 ملم بعد VIPA و 200 ملم أمام القناع الأفقي. اتبع الإجراء الموضح في 2.2.1-2.2.3. بدلا من ربط شاغل هذه الوظيفة على الطاولة البصرية، تركيبها على مرحلة متعدية مع درجة في الحرية الموجهة على طول المحور البصري. (الشكل 1) استخدام البراغي لتشديد مرحلة متعدية على الطاولة البصرية.
- استخدام المرحلة متعدية الأفقية (2.3.4) إلى الشريحة مدخل VIPA2 في مسار الشعاع. مراقبة خطوط عمودية على صورة الكاميرا.
- غرامة ضبط S2 باستخدام مرحلة متعدية التي شنت في 2.4 حتى تظهر خطوط عمودية على صورة الكاميراحاد.
- ضبط الطيف مع درجة الميل الأفقي للحرية على حامل VIPA والمرحلة متعدية. استخدام درجة أفقية الترجمة الحرية لضبط الموقف مدخل شعاع في ETALON. استخدام درجة الميل الأفقي للحرية لضبط زاوية المدخلات من الحزم في ETALON.
- قياس الجودة والإنتاجية.
- التقاط صورة عن طريق الضغط على F5 أو بدلا من ذلك بالنقر على "الإعداد الاستحواذ" في الزاوية اليسرى العليا واختيار الخيار "تأخذ صورة" في برنامج الكاميرا.
- انقر بزر الماوس الأيمن على الصورة واختر الخيار "خط المؤامرة". اسحب المؤشر أفقيا عبر الصورة لتوليد مؤامرة الخط. الافراج عن المؤشر لمراقبة خط المؤامرة التي تم إنشاؤها.
- استخدام مؤامرة خط لقياس الجودة. تقسيم المسافة بين قمتين من جانب العرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM). تهدف ل> 30.
- تحديد مرت بها measurinز السلطة مع السلطة متر على الفور قبل وبعد VIPA2. تهدف ل> 50٪.
- ضبط زاوية المدخلات من الحزم في ETALON مع درجة من الحرية على حامل VIPA (2.6) ومراعاة المفاضلة بين الجودة والإنتاجية.
- إذا الجودة والإنتاجية ليست مرضية العودة وغرامة ضبط المحاذاة. جعل VIPA2 بالتأكيد هو في المستوى البؤري من S1. كرر الخطوات من 2.3.3 -2.7.
3. عمودي مرحلة مطياف
- حرك VIPA (VIPA2)، الانحياز في الجزء 2، للخروج من شعاع باستخدام مرحلة متعدية (2.3.4). فإن المرحلة الأفقية للمطياف تتصرف الآن كما 1: نظام التصوير 1.
- جبل قناع العمودي.
- استخدام مسامير تعيين إرفاق قناع العمودي على وظيفة. تشديد آخر في الزاوية اليمنى محول آخر المشبك. تشديد وظيفة ثانية في حق محول زاوية ووضعها في حامل آخر. جبل حامل آخر على عمودي متعدية المرحلة، allowiنانوغرام القناع إلى الشريحة عموديا داخل وخارج مسار الشعاع. (الشكل 1)
- مسامير استخدام الحد الأقصى لتشديد المرحلة متعدية العمودية على الطاولة البصرية بحيث يتم تصوير القناع الرأسي بشكل حاد على الكاميرا EMCCD 200 ملم أمام S1.
- جبل ومحاذاة عدسة اسطوانية C1 (و = 200 مم) 600 ملم أمام القناع الرأسي.
- المسمار حامل عدسة أسطواني على وظيفة. تشديد آخر إلى صاحب المنصب. وضع بعناية C1 في حامل العدسة وتضييق الخناق على إصلاحه في المكان.
- جبل اثنين قزحية العين كما هو موضح في 1.5.1. قبل وضع C1 في مسار الشعاع، إدراج واحدة قبل قزحية العين والقزحية واحدة بعد موقف S1 المطلوب (600 ملم أمام قناع العمودي). ضبط ارتفاع قزحية العين بحيث يمر شعاع نظيفة من خلال كل منهما.
- مكان C1 600 ملم أمام قناع العمودي (الشكل 1). ضبط دقيق للارتفاع والإمالة والموقف الجانبي من C1 حتىعلى حد سواء، وانعكاس الخلفي الخروج من العدسة والحزم الخروج، وتتركز على قزحية العين. تشديد حامل آخر عقد C1 على الطاولة البصرية باستخدام المشابك الجدول.
- جبل VIPA1 في المستوى البؤري للعدسة الاسطوانية (200 ملم أمام C1).
- جبل حامل VIPA على وظيفة باستخدام المسمار المتوفرة مع حامل. تشديد آخر إلى صاحب المنصب. تشديد شاغل هذه الوظيفة على مرحلة الترجمة العمودية. (الشكل 1)
- وضع VIPA1 بعناية في حامل VIPA مع فتحة مدخل الموجهة أفقيا. (الشكل 1)
- غرامة ضبط الموقف من VIPA جبل لوضع VIPA1 بالضبط في المستوى البؤري من C1. (تحقق عن طريق تتبع الخصر شعاع مع بطاقة بيضاء).
- مسامير استخدام الحد الأقصى لتشديد المرحلة متعدية العمودية على الطاولة الضوئية والشرائح VIPA1 من شعاع باستخدام درجة من الحرية للمرحلة متعدية.
- جبل ومحاذاةعدسة أسطوانية C2 (و = 200 مم) 200 ملم بعد VIPA1 و 200 ملم أمام القناع الرأسي، في أعقاب إجراءات المنصوص عليها في 3.3.1-3.3.3. بدلا من ربط شاغل هذه الوظيفة على الطاولة البصرية، تركيبها على مرحلة متعدية مع درجة في الحرية الموجهة على طول المحور البصري. (الشكل 1) استخدام البراغي لتشديد مرحلة متعدية على الطاولة البصرية.
- استخدم مرحلة الترجمة (3.4.4) إلى الشريحة مدخل VIPA1 في مسار الشعاع. مراقبة خطوط أفقية على الصورة الكاميرا.
- غرامة ضبط C2 باستخدام مرحلة متعدية التي شنت في 3.5 حتى خطوط أفقية على الصورة الكاميرا تظهر حادة.
- ضبط الطيف مع درجة الميل الرأسي للحرية على حامل VIPA والمرحلة متعدية. استخدام درجة عمودية الترجمة الحرية لضبط الموقف مدخل شعاع في ETALON. استخدام درجة الميل الرأسي للحرية لضبط زاوية المدخلات من الحزم في ETALعلى.
- قياس الجودة والإنتاجية.
- اتبع الخطوات 2.7.1 -2.7.2 لتوليد مؤامرة خط عموديا عبر صورة لشاشة الكاميرا.
- استخدام مؤامرة خط لقياس الجودة بقسمة المسافة بين اثنين من خطوط أفقية من جانب العرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM). تهدف ل> 40.
- قياس الإنتاجية عن طريق قياس قوة مع السلطة متر على الفور قبل وبعد VIPA1. تهدف ل> 30٪.
- ضبط زاوية عمودية المدخلات من الحزم في ETALON مع درجة الميل الرأسي للحرية على حامل VIPA (3.7). مراقبة المفاضلة بين الجودة والإنتاجية.
- إذا الجودة والإنتاجية ليست مرضية العودة وغرامة ضبط المحاذاة. جعل VIPA1 بالتأكيد هو في المستوى البؤري من C1. كرر الخطوة 3.4.3-3.8.
4. الجمع بين مرحلتي والمواءمة النهائية
- الانزلاق في VIPA2. مراقبة النقاط متباعدة أفقيا ورأسيا. هذه النقاط لإعادة التوقيع الطيفي لليزر تردد واحد. ضبط مراحل متعدية من VIPAs حتى النقاط هي في التركيز الحاد.
- قياس الجودة والإنتاجية لطيف.
- اتبع الخطوات 2.7.1.-2.7.2 لتوليد مؤامرة خط قطريا عبر اثنين من نقاط ليزر.
- استخدام مؤامرة خط لقياس الجودة بقسمة المسافة قطري بين اثنين من النقاط عن طريق العرض الكامل في نصف كحد أقصى (FWHM). تهدف ل> 30.
- بناء الصندوق الأسود لإحاطة مطياف.
- استخدام القضبان البناء لبناء الهيكل العظمي مربع، والتي يجب أن ترفق مطياف كامل من الموازاة الألياف إلى كاميرا CCD (63 في العاشر 9 في × 15 في).
- تغطية الهيكل العظمي مربع مع تعتيم النسيج والشريط مشددة في زوايا. تأكد من أن الأقنعة وVIPAs يمكن الوصول إليها بسهولة.
- توصيل الألياف الضوئية إلى التحقيق القياسية، مثل الانعكاس متحد البؤر المجهر 4. ص معيار بصريوالجلباب المستخدمة في جمع الضوء المتناثرة العودة تحمل إشارة Brillouin.
5. قياس التحول Brillouin
- إغلاق كل من الرأسي والأفقي الأقنعة حتى يختفي التوقيع الليزر. نقل مراحل الترجمة وفقا لذلك.
- تمكين الربح وزيادة الوقت دمج الكاميرا قدر الإمكان دون تشبع الكاميرا EMCCD.
- مراقبة التحول Brillouin لعينة.
- وضع العينة في تركيز المجهر متحد البؤر (أو غيرها من مسبار بصري). فإن القرار المكانية تعتمد على العدسة الشيئية المستخدمة في المجهر متحد البؤر. استخدام طبق من البلاستيك أو كفيت للسوائل. استخدام الميثانول لقياس الأولى.
- لتحسين الإنتاجية مطياف، مفتوحة قناع واحد في وقت والمسح الضوئي من خلال أوامر مطياف عن طريق إمالة VIPA وتعديل مرحلة ترجمته. العثور على الترتيب الذي تظهر إشارة أقوى. انهيار قناع مرة أخرى حتى عشريختفي ه إشارة الليزر. كرر مع قناع وVIPA (الموصوفة في 2.6 و 3.7) آخرين.
- خذ قياس العينة.
- التقاط صورة من الطيف التالية خطوة 2.7.1.
- الحصول على معايرة بأخذ صورة من الطيف من الماء والزجاج (أو عينة أخرى مع تحول Brillouin معروف). حفظ الصورة بالنقر على "ملف" في الزاوية اليسرى العليا واختيار خيار "حفظ باسم". حفظ الصور في شكل ".sif" إذا تم إجراء تحليل البيانات في برنامج الكاميرا. حفظ الصور في شكل ". TIF" إذا تم إجراء تحليل البيانات في برنامج آخر البرامج الحاسوبية.
6. المعايرة وتحليل Brillouin الطيف
- تحديد نطاق مجانا الطيفي (FSR) وبكسل EMCCD إلى نسبة تحويل التردد البصرية (PR) في مطياف Brillouin.
- تحميل البيانات في برنامج الكاميرا أو computa أخرىبرنامج حاسوبي tional.
- اتبع الخطوة 2.7.2 لتوليد مؤامرة خط مختلف ألوان الطيف للصورة معايرة الماء.
- تناسب اثنين من قمم لطيف مع منحنيات Lorentzian لتحديد مواقع الذروة من حيث موقف بكسل (P المياه-S، P المياه-AS). بدلا من ذلك، تلا مواقف الذروة يدويا من خلال اتخاذ أعلى نقطة من قمم.
- كرر الخطوة 6.1.2-6.1.3 مع طائفة من الصورة زجاج المعايرة.
- بدلا من ذلك إلى 6.1.1-6.1.4، إضافة كل الأطر EMCCD وتناسب جميع القمم الأربع في وقت واحد. (الشكل 2)
- حساب PR باستخدام المعادلة 1. سد العجز في قيم P-AS المياه وP زجاج-AS العزم في 6.1.3 و6.1.4. ومن المعروف Ω الزجاج-AS أن 29.3 غيغاهرتز. في هذه الحالة، لأن النطاق الطيفي الحر هو فقط 20 غيغاهرتز أنها ستظهر مستعارة مع التحول تردد 9.3 غيغاهرتز. لبساطة استخدام 9.3 غيغاهرتز لΩ الزجاج-AS. استخدام 7.46 غيغاهرتز لΩالماء-AS.
- حساب FSR باستخدام المعادلة 2. سد العجز في قيم P زجاج-S، P-AS الزجاج والعلاقات العامة، وتحسب في 6.16. استخدام 9.3 غيغاهرتز لΩ الزجاج-AS.
الشكل 2. مطياف المعايرة. إطار (A) وكاميرا EMCCD الحصول عليها من عينة المعايرة. (B) Lorentzian منحنى صالح (الأحمر) لقياس البيانات (الأزرق). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تحديد التحول من Brillouinعينة.
- اتبع الخطوة 2.7.2 لتوليد الاشعة خط مختلف ألوان الطيف من العينة.
- تناسب اثنين من قمم لطيف مع منحنيات Lorentzian لتحديد مواقع الذروة من حيث موقف بكسل. بدلا من ذلك، تلا مواقف الذروة يدويا من خلال اتخاذ أعلى نقطة من قمم.
- استخدام المعادلات التالية 4 و 5 والقيم المحسوبة سابقا لFSR والعلاقات العامة لحساب التحول Brillouin من العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويبين الشكل 3 ممثل أطياف Brillouin ونوبات بهم لمواد مختلفة. وVIPAs حد سواء لديها سمك 5 ملم مما يؤدي الى FSR ما يقرب من 20 غيغاهيرتز. كانت المرة التكامل لهذه القياسات 100 مللي ثانية. أخذت 100 القياسات وبلغ متوسط. وقد اتخذ واحدة قياس المعايرة قبل الحصول على الأطياف.
الشكل 3. Brillouin الأطياف من مواد مختلفة. تناسب منحنى Lorentzian (أحمر) لقياس البيانات (الأزرق). (أ) الطيف Brillouin من الميثانول. التحول Brillouin قياسه هو 5.59 غيغاهيرتز. (ب) Brillouin الطيف من الإيثانول. التحول Brillouin قياسه هو 5.85 غيغاهيرتز. (ج) Brillouin الطيف من البوليستيرين. التحول Brillouin قياسه هو 14.12 غيغاهيرتز.إعلان / 53468 / 53468fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التحولات Brillouin الحصول تتفق مع 3،6،7 البيانات المنشورة سابقا. لتحديد ما إذا محاذاة مطياف هو الأمثل، العديد من القياسات الطيفية من نفس المادة التي يمكن اتخاذها بشكل متسلسل، ويمكن حساب الانحراف المعياري للمواقف الذروة. يبين الشكل 4A على التتبع وقت 250 القياسات Brillouin من الميثانول اتخذت بالتتابع ؛ ويظهر الرسم البياني للتحولات Brillouin تقييمها في الشكل 4B. وهناك مطياف متماشية بشكل جيد مع 5 ميغاواط الضوء على عينة والوقت التكامل من 100 ميللي ثانية يكون الانحراف المعياري σ ~ 10 ميغاهرتز. وقد تم قياس التغيرات في التحول Brillouin داخل القرنية وعدسة الأنسجة لتكون بناء على أمر من 1 غيغاهيرتز 9،10،11. ولذلك، فإن القراءات التحول Brillouin مع تقلب ≤10 ميغاهيرتز تمكين قياس ذات صلةالاختلافات الميكانيكية في الأنسجة.
الرقم 4. الانحراف في التحول Brillouin أكثر من 250 القياسات الميثانول. (A) الوقت التتبع من 250 القياسات Brillouin من الميثانول. (B) الرسم البياني لتحول Brillouin الانحراف أكثر من 250 القياسات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك ميزة التصميم الأساسية لهذا التكوين مطياف هي أن المرحلتين يمكن محاذاة بشكل مستقل. عندما انزلق على ETALON VIPA من مسار بصري، والعدسات المتبقية من المرحلة مطياف تشكل 1: نظام التصوير 1، بحيث يتم تصوير نمط الأطياف من كل مرحلة على كاميرا CCD. وبالتالي، فإنه واضح وصريح للذهاب إلى أي واحد من المراحل لتحسين أدائها دون التأثير على محاذاة مرحلة أخرى. مجموعة مراحل ودرجات حرية متعدية المقترحة في بروتوكول متابعة هذه فلسفة الحفاظ على القدرة على تحسين مستقلة على كل مراحل مطياف.
فمن الصعب لتركيب etalons VIPA مثل أن درجة الميل الحرية تدور حول محور نافذة الإدخال. وفي وقت لاحق، عندما تعمل مع مكونات علم البصريات الميكانيكية المتاحة تجاريا، إمالة ETALON يدخل حتما ترجمة صغيرة من نافذة الإدخال. وtranslatأيون على طول محور الحزمة الضوئية لا ينبغي أن تحفز الآثار السلبية بسبب مجموعة رايلي كبير من عدسة المدخلات (~ 3 مم). من ناحية أخرى، فإن الترجمة على متعامد محور لنشر شعاع قد يقلل بشكل كبير من سرعة نقل مطياف. هذا هو السبب في أن متعدية ودرجة الميل الحرية على حامل VIPA يجب أن تعمل جنبا إلى جنب لتحقيق أقصى قدر من الجودة والإنتاجية. ويقترح لبدء إجراء المواءمة مع مرتفعة نسبيا زاوية الميل (~ 3-5 درجة) بحيث ضوء اقتران في ETALON VIPA ما يقرب من ضياع. كما يحسن محاذاة، يمكن انخفض زاوية الميل لتحسين الجودة. الاستفادة المثلى من الجودة والإنتاجية هو جزء مهم من بروتوكول المحاذاة، خاصة بالنسبة للتطبيقات في المواد البيولوجية حيث يجب أن تبقى الوقت التكامل وقوة الليزر عند أدنى مستوى ممكن.
في البروتوكول، فقد قيل لاستخراج التحول Brillouin من رانه تحليل اثنين من قمم الطيفية، وهي ستوكس ومكافحة ستوكس قمم من أمرين الحيود المجاورة. وهذا هو الإجراء القوي في جوهرها أن يقلل من التحف بسبب الانجرافات تردد الليزر، أو التغيرات في درجات الحرارة ETALON. ومع ذلك، وقياس قمم مع مختلف إلى حد كبير التحول الطيفي قد يكون عيوب. في الواقع، يستند الإجراء المنصوص عليه المعايرة الطيفية على افتراض التشتت الطيفي المستمر عبر نمط الطيفي. في الواقع، ويزيد من تشتت الطيفي في أوامر أقل من الحيود. ونتيجة لذلك، فإن مناطق الطيف التي يتم تحليلها (أي ستوكس ومكافحة ستوكس قمم من أمرين الحيود المجاورة) قد يكون التفرق الطيفية المختلفة. في هذه الحالة، فإن إجراء معايرة الطيفي مكتوب هنا تقدم التحولات Brillouin غير دقيقة. ويشار إلى أن أكثر المواد المعروفة التحول Brillouin ينبغي أن تستخدم في هذه الحالة لبناء منحنى معايرة الطيفي مع تناسب متعدد الحدود. هذا مهم بشكل خاص إذا كانت القيمة المطلقة للتحول Brillouin لابد من مقارنة بدلا من التغير النسبي في التحول Brillouin بين شرطين.
عادة، وصفت الجودة من etalons في الفضاء الحر، بما في ذلك VIPA هنا، لا تتجاوز 50 ~. ونتيجة لذلك، سيكون هناك مفاضلة للنظر بين قرار طيفية عالية والمدى الطيفي مجانا. في هذا البروتوكول ويقترح مجموعة الطيفي الحر لل20 غيغاهيرتز للأخضر (532 نانومتر) عملية الليزر لأن معظم المواد الحيوية لها تحولات Brillouin أقل من 10 غيغاهيرتز. نصف فقط من FSR متاح للتحليل Brillouin لأن ستوكس ومكافحة ستوكس تردد تحولات أكبر من نصف FSR ستظهر مستعارة في الطيف.
إذا واجهت صعوبات في مراقبة إشارة Brillouin، فمن المهم أن ندرك ما إذا كانت ترتبط القضايا إلى كمية زائدة من الضوء الشارد، أو إلى انخفاض عدد الفوتونات Brillouin. المفرط ل طائشةآيت ينبغي القضاء على نحو فعال. تأكد من أن مربع الضميمة سوداء خفيفة محكم. بدون عينة، وتحول على أضواء الغرفة أو إطفاء الليزر لا ينبغي إحداث تغيير كبير في الكاميرا EMCCD العد الفوتون الخلفية. للقضاء على ضوء الليزر المنعكس من سطح العينة، قليلا إمالة عينة، وبدء مراقبة بأقنعة المكانية أغلقت قدر الإمكان دون عرقلة الإشارة. وستمكن هذه الإجراءات اثنين من زيادة الوقت التكامل للسماح للمراقبة إشارة Brillouin قاتمة جدا. إذا كان لا يزال هناك أي إشارة، فمن المحتمل أن إشارة Brillouin ضعيفة جدا. استخدام عينة مختلفة مع إشارة Brillouin قوية مثل الميثانول، أو تحقق من محاذاة البصريات جمع في المجهر متحد البؤر. بعد أن لاحظت إشارة بنجاح، وتحسين أكثر من ذلك باتباع الخطوة 5.4 موضح في البروتوكول.
وفقدان ضوء الحادث يرجع إلى امتصاص أو نثر زيادة اكتساب الوقت صequired لتحليل العينات. ونتيجة لذلك، يتم عادة الحصول على أفضل النتائج في مواد شفافة أو رقيقة. وينبغي أن يكون مطياف الانحياز جيدا قادرا على الحصول على ارتفاع عدد الفوتون (> 1000 في ذروة) مع 5 ميغاواط من الضوء في العينة و100MS من الوقت التكامل للمواد السائلة أو عينات من البلاستيك الشفاف. هذا هو أسرع بكثير من الطيف الضوئي التقليدية. بسبب انخفاض اكتساب الوقت والإضاءة قوتها، وقد مكن هذا مطياف باستخدام Brillouin الطيفي في الجسم الحي والميكانيكية التصوير 3،10،11،12. استخدام هذا النوع من مطياف، وقد أثبتت عدة مجموعات مجموعة متنوعة من التطبيقات مثل قياس خصائص الانسيابية للعدسة العين 13، الكشف عن التهاب السحايا الجرثومي في السائل الشوكي 4، وتحليل معامل مرونة القرنية 14.
ومن المتوقع في المستقبل القريب المزيد من التحسينات لطيف، خصوصا إذا المنخفضة خسارة الفرقة فائقة الضيقةتمرير و / أو يمكن إدراجها تصفية الشق للاسترخاء متطلبات الانقراض على تشتت الطيفي VIPA. منذ مطياف يمكن أن تستخدم في تركيبة مع مجموعة متنوعة من تحقيقات البصرية القياسية، لالمجاهر سبيل المثال متحد البؤر 3،4،5، المناظير، وناظور العيون مصباح طولية، يمكن مطياف VIPA عنصرا أساسيا في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
