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Bioengineering

ブリルアン散乱分析用高速サブGHzの分光

Published: December 22, 2015 doi: 10.3791/53468

Summary

ここでは、迅速なブリルアン分光計を構築するためのプロトコルを提示します。事実上、画像化された位相配列をカスケード(VIPA)エタロンは、1,000以上の倍高速伝統的なスキャニングファブリペロー分光計より測定速度を実現。この改善 、インビボで、低電力レベルで組織と生体材料のブリルアン分析のための手段を提供します。

Abstract

このプロトコルの目的は、並列高絶滅と高解像度光学ブリルアン分光計を構築することです。ブリルアン分光法は、粘弾性材料特性の直接読み出しを得るために使用することができる非接触測定方法です。これは、材料特性評価、構造的なモニタリングと環境センシングに有用なツールとなっています。過去には、ブリルアン分光法は、通常、スペクトル解析を実行するためのスキャンファブリペローエタロンを用いています。このプロセスは、生物医学的用途に適さない技術を作り、高い照射パワーと長い取得時間を必要とします。最近導入された新規な分光計は、交差軸構成の2つのVIPAsを用いることにより、この課題を克服します。この技術革新は、生体組織の安全限界内のサブ第2の取得時間と照明電力でサブGHz(ギガヘルツ)の分解能スペクトル解析を可能にします。この改良することによって容易に複数の新しいアプリケーションは、Cuですrrently生物学的研究および臨床応用で検討されています。

Introduction

最初の1922年にレオンブリルアン1で説明したブリルアン散乱は、固体及び液体や気体の熱密度の変動からの熱音響モードからの光の非弾性散乱です。通常、サブGHzの範囲で散乱光のスペクトルシフトは、入射光と、試料中の音響フォノンとの相互作用に関する情報を提供します。結果として、それが検査材料の粘弾性特性に関する有用な情報を提供することができます。

その自発的なバージョンでは、ブリルアン散乱は、一般的に非常に弱い信号を生じる、ラマン散乱のために、断面を有しています。また、ブリルアン周波数シフトは、ラマンシフトよりも小さい大きさのオーダーです。その結果、弾性(レイリーやミー散乱からの)散乱光、迷光、およびサンプルのオフ後方反射は、すべて簡単にブリルアンスペクトル特性を曇らせることができます。したがって、、ブリルアン分光計は、サブGHzのスペクトル分解能も高いスペクトルコントラストや絶滅を達成するだけでなく、必要があります。

伝統的なブリルアン分光器では、これらの要件は、最も一般走査格子モノクロメータ、光ビーティング法、および、マルチパススキャニングファブリペロー干渉計2によって満たされます。これらの方法は、各スペクトル成分を順次測定します。このアプローチは、機器上で、サンプルに応じて、数分から数時間に及ぶ単一のブリルアンスペクトルを取得時間につながります。二段VIPA分析計、このプロトコルを使用して構築され、効果的に他のスプリアス信号2を抑制するために十分な消光(> 60 dB)を提供しながら秒未満内のスペクトル成分のすべてを収集する能力を有します。

VIPAエタロンの統合は、この分光計の重要な要素です。 VIPAは、3つの異なるCと固体エタロンであります浮動領域は:表面の残りの部分は、高反射性(HR)コーティングを備えていながら、前面には、狭い反射防止コーティングストリップは、光がVIPAを入力することができます。裏面に、部分的に反射コーティングは、光の小さな部分(約5%)が送信されることを可能にします。少し傾いVIPAの狭い入り口上に集光すると、光ビームは、VIPA 2内の固定位相差でサブコンポーネントに反映されます。サブコンポーネント間の干渉が熱望高いスペクトル分散を実現しています。交差軸構成で順次2 VIPAsを整列させること直交方向3のスペクトル分散を紹介します。直交する方向のスペクトル分散は、空間的にのみブリルアン信号をピックアップすることが可能となり、不要なクロストークからブリルアンピークを分離します。1ディスプレイを2段VIPA分光計の模式 。光学素子の下にある矢印は、度を示します並進ステージが指向されるべき自由のREE。

図1
図1.インストゥルメンタルセットアップ。光ファイバは、分光計にブリルアン散乱を提供しています。円柱レンズC1(F = 200ミリメートル)は、第一VIPA(VIPA1)の入り口に光を集光します。別のシリンドリカルレンズC2(F = 200ミリメートル)はC2の焦点面で空間的に分離するにスペクトル角度分散をマッピングします。この面では、垂直マスクは、スペクトルの所望の部分を選択するために使用されます。類似の構成は、90度に傾け、次の。ビームは球面レンズS1(F = 200ミリメートル)を通過し、第二VIPA(VIPA2)の入射スリットに集光されます。球面レンズS2(F = 200 mm)を、別の水平方向のマスクが配置され、その焦点面、2次元スペクトル分離パターンを作成します。 HORizontalマスクは色消しレンズ対を用いEMCCDカメラ上に結像される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

いくつかの光学コースと基本的な位置合わせの経験を持つ学部学生は、この二段階の分光器を構築し、使用することができるはずです。分光計は、最近、標準的な光学プローブ3,4,5(例えば共焦点顕微鏡、内視鏡、細隙灯検眼鏡)の様々な互換性のあることが示されています。ここで、分光器は、共焦点顕微鏡に接続されています。レーザ光を90:10ビームスプリッタを統合した後、標準的な研究システム倒立顕微鏡に整列されます。サンプルからの後方散乱光は、共焦点顕微鏡を作る、単一モード光ファイバに結合されます。

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Protocol

注:ブリルアン分光分析は、単一縦モードレーザ(〜サンプルでは10mW)を必要とします。目的を整列させるため、このレーザービーム(<0.1 ​​MW)の強く減衰部分を使用。

1.初期繊維のセットアップとEMCCD(電子逓倍電荷結合素子)カメラ

  1. 光学テーブル上の分光計約1600ミリメートル自由整合スペースを特定します。
  2. 無料の整合スペースの最後にEMCCDカメラをマウントします。
    1. ポストにカメラを取り付けるためのセットネジを使用してください。希望の光軸の高さでポストホルダーでポストを締めます。テーブルクランプを使用して光学テーブル上にポストホルダーを締めます。
  3. EMCCDカメラの電源をオンにします。カメラの飽和を避けるために注意して下さい。
    1. ラボのコンピュータ上でカメラのソフトウェアをインストールし、カメラとパソコンを接続してください。
    2. ゲインを無効にし、低積分時間(〜0.01秒)を設定します。 EMCCD画像の取得を開始。カメラ画像を観察コンピュータ画面上の。
  4. カメラの前で1600ミリメートル程度ファイバコリメータをマウントします。
    1. ファイバコリメータアダプタにファイバコリメータを配置します。
    2. ポストの上にアダプターを取り付けます。光軸(カメラの高さ)のおおよその高さでポストホルダーにポストを締めます。テーブルクランプを使用して光学テーブル上にポストホルダーを締めます。
  5. 光軸に沿って出力ビームの位置を合わせます。
    1. ポストへの標準アイリスを接続するための止めねじを使用します。ポストホルダーにポストを締めます。
    2. ファイバコリメータ(<50ミリメートル)の前に絞りを配置します。ビームの虹彩の高さを調整します。カメラに直接指している必要があります希望の光軸に沿って絞りを、移動します。
    3. カメラが飽和する場合、レーザ出力の直後に、光学濃度フィルタを挿入します。光軸に沿ってビームを整列させるためにマウントファイバコリメータの調整ネジを使用してください。これが達成されると、ビームは、きれいに全体のビーム経路に沿って絞りを通過することになります。
  6. カメラの前で一致した色消しレンズ対(F = 30 mm)を取り付けます。

分光器の2水平ステージ

  1. 水平マスクをマウントします。
    1. ポストの上に水平マスクを添付する止めねじを使用します。ポストホルダーにポストを締めます。マスクはビーム経路の内外を水平にスライドすることができ、翻訳ステージ上のポストホルダーを取り付けます。 ( 図1)
    2. マスクは色消しレンズ対の焦点距離(F = 30ミリメートル)で、CCDカメラ上に鮮明に結像されるように、光学テーブル上の並進ステージを締めキャップネジを使用してください。
  2. マウントとは、球面レンズS1(F = 200ミリメートル)、水平マスクの前の600ミリメートルの位置を合わせます。
    1. ポストホルダーにS1をマウントするセットネジを使用してください。ポストホルダーにポストを締めます。
    2. 1.5.1で説明したように、2つの虹彩をマウントします。 placi前NG S1は、ビーム経路に、一つ前の虹彩と希望S1位置の後に1アイリス(水平マスクの前の600ミリメートル)を挿入します。ビームがきれいにそれらの両方を通過するように虹彩の高さを調整します。
    3. 水平マスクの前に置き、S1 600ミリメートル( 図1)。両方、レンズとアウトく​​るビームのバックオフ反射までS1の高さと角度を調整し、きれいに菖蒲を通過します。テーブルクランプを使用して光学テーブル上に、S1を保持するポストホルダーを締めます。
  3. 球面レンズの焦点面でのマウントVIPA2(S1の前の200ミリメートル)。
    1. ホルダーを付属のネジを使用してポストにVIPAホルダーを取り付けます。ポストホルダーにポストを締めます。水平移動ステージ上にポストホルダーを締めます。 ( 図1)
    2. 垂直に配向された入射スリットとVIPAホルダーに慎重にVIPA2を置きます。 ( 図1)
    3. 位置Oを微調整しますVIPA fを正確にS1の焦点面にあるようにマウントします。 (白いカードでビームウエストをトレースすることにより確認してください。)
    4. 並進ステージの自由度を用いて、ビームから光学テーブルやスライドVIPA2に並進ステージを締めキャップネジを使用してください。
  4. マウントとは、球面レンズS2(F = 200ミリメートル)VIPA後の200ミリメートル、横マスクの前の200ミリメートルの位置を合わせます。 2.2.1-2.2.3に記載されている手順に従ってください。代わりに、光学テーブル上にポストホルダーを取り付けると、光軸に沿って配向自由の程度との翻訳ステージ上にマウントします。 ( 図1)光学テーブル上に並進ステージを締めキャップネジを使用してください。
  5. ビーム経路にVIPA2の入り口をスライドさせ、水平並進ステージ(2.3.4)を使用します。カメラ画像上の垂直線を観察します。
    1. カメラ画像上の縦線が表示されるまで2.4に搭載された並進ステージを使用して、S2を微調整しますシャープ。
  6. VIPAホルダーおよび翻訳ステージ上の自由の水平方向の傾斜度のスペクトルを調整します。エタロンにビームの入射位置調整するために自由の水平並進度を使用してください。エタロンに同調するように、ビームの入力角度を自由水平傾斜度を使用してください。
  7. フィネスとスループットを測定します。
    1. 左上隅にある「取得の設定」をクリックし、オプションのカメラソフトウェアの「イメージを取得」を選択することで、代わりに、F5キーを押すかによって、画像を取ります。
    2. 右の画像をクリックし、オプションの "ラインプロット」を選択します。折れ線グラフを生成するために、画像を横切って水平カーソルをドラッグします。生成されたラインプロットを観察するためにカーソルを離します。
    3. フィネスを測定するためにラインプロットを使用してください。半値(FWHM)で、完全な幅で2つのピークの間の距離を分割します。 > 30を目指します。
    4. measurinことで、スループットを決定しますG直前およびVIPA2後のパワーメータとパワー。 > 50%を目指します。
    5. チューンVIPAホルダーの自由度とエタロンへの光の入力角度(2.6)とフィネスとスループットの間のトレードオフを確認します。
  8. フィネスとスループットは満足できるものではない場合は戻って、アライメントを微調整します。 VIPA2はS1の焦点面にあることを確認します。繰り返し2.3.3 -2.7ステップ。

分光器の3垂直ステージ

  1. VIPA(VIPA2)をスライドさせ、並進ステージ(2.3.4)を使用して、ビームのうち、第2部に整列。 1イメージングシステム:分光計の水平ステージは今1として動作します。
  2. 垂直マスクをマウントします。
    1. ポストの上に垂直マスクを添付する止めねじを使用します。直角ポストクランプアダプタにポストを締めます。直角アダプタに第二のポストを締め、ポストホルダーにそれを置きます。垂直平行移動ステージ上のポストホルダーをマウントし、allowiおよびビーム経路の外に垂直にスライドするようにマスクをngの。 ( 図1)
    2. 垂直マスクはEMCCDカメラに急激S1の前で200ミリメートルをイメージされるような光学テーブル上に垂直並進ステージを締めキャップネジを使用してください。
  3. マウントは、シリンドリカルレンズC1(F = 200ミリメートル)垂直マスクの前の600ミリメートルの位置を合わせます。
    1. ポストの上に円柱レンズホルダーをねじ込みます。ポストホルダーにポストを締めます。慎重にレンズホルダーにC1を配置し、所定の位置にそれを修正するネジを締めます。
    2. 1.5.1で説明したように、2つの虹彩をマウントします。ビーム経路のC1を配置する前に、希望のS1の位置(垂直マスクの前の600ミリメートル)の後に1虹彩前と1絞りを挿入します。ビームがきれいにそれらの両方を通過するように虹彩の高さを調整します。
    3. 場所C1垂直マスクの前の600ミリメートル( 図1)。までC1の高さ、チルト、横方向の位置を慎重に調整両方、レンズとアウトく​​るビームのオフ後方反射は、虹彩上に集中しています。テーブルクランプを使用して光学テーブル上にポストホルダ保持C1を締めます。
  4. シリンドリカルレンズの焦点面にマウントVIPA1(C1の前の200ミリメートル)。
    1. ホルダーに設けられたネジを使用してポストにVIPAホルダーを取り付けます。ポストホルダーにポストを締めます。垂直平行移動ステージ上にポストホルダーを締めます。 ( 図1)
    2. 水平方向の入射スリットとVIPAホルダーに慎重VIPA1を置きます。 ( 図1)
    3. 正確にC1の焦点面にVIPA1を配置するマウントVIPAの位置を微調整します。 (白いカードでビームウエストをトレースすることにより確認してください。)
    4. 光学テーブル上に垂直並進ステージを締めおよび翻訳段階の自由度を用いて、ビームからVIPA1をスライドするキャップネジを使用してください。
  5. マウントと揃えます円柱レンズC2(= 200ミリメートルF)VIPA1と3.3.1-3.3.3に記載の手順に従って垂直マスクの前の200ミリメートル、後に200ミリメートル。代わりに、光学テーブル上にポストホルダーを取り付けると、光軸に沿って配向自由の程度との翻訳ステージ上にマウントします。 ( 図1)光学テーブル上に並進ステージを締めキャップネジを使用してください。
  6. ビーム経路にVIPA1の入り口をスライドする移動ステージ(3.4.4)を使用します。カメラ画像上の水平線を観察します。
    1. カメラ画像上の水平線がシャープに表示されるまで3.5に搭載された並進ステージを使用して、C2を微調整します。
  7. VIPAホルダーおよび翻訳ステージ上の自由の垂直傾斜度のスペクトルを調整します。エタロンにビームの入射位置調整するために自由の垂直翻訳の学位を使用してください。エタル島への光の入力角度調整するために自由の垂直傾斜度を使用しますに。
  8. フィネスとスループットを測定します。
    1. カメラ画面のイメージ全体に垂直方向にラインプロットを生成するための手順2.7.1 -2.7.2に従ってください。
    2. 半値(FWHM)で、完全な幅で2つの水平線の間の距離を割ることによってフィネスを測定するためにラインプロットを使用してください。 > 40を目指します。
    3. すぐVIPA1前後のパワーメータとパワーを測定することにより、スループットを測定します。 > 30%を目指します。
    4. チューンVIPAホルダー(3.7)上の自由の垂直傾斜度とエタロンにビームの垂直方向の入力角度。フィネスとスループットの間のトレードオフを確認します。
  9. フィネスとスループットは満足できるものではない場合は戻って、アライメントを微調整します。 VIPA1はC1の焦点面にあることを確認します。手順を繰り返し3.4.3-3.8。

4.二段階の組み合わせと最終アライメント

  1. VIPA2にスライドさせます。水平方向および垂直方向に間隔をあけドットを観察します。これらのドット単一周波数レーザのスペクトルシグネチャ再。ドットが鮮明になるまでVIPAsの並進ステージを調整します。
  2. 分光器のフィネスとスループットを測定します。
    1. 手順に従ってください2.7.1.-2.7.2を斜めにレーザードットの2全体にラインプロットを生成します。
    2. 半値(FWHM)で、完全な幅で2つのドット間の対角線の距離を割ることによってフィネスを測定するためにラインプロットを使用してください。 > 30を目指します。
  3. 分光器を囲むようにブラックボックスを作成します。
    1. (中×15×9で63)CCDカメラにファイバコリメータから全体分光器を囲む必要がありますボックスの骨格を構築するために建設レールを使用してください。
    2. ブラックアウトファブリック箱骨格を覆い、コーナーにタイトな、それをテープで固定します。マスクとVIPAsは簡単にアクセス可能であることを確認してください。
  4. このような反射率共焦点顕微鏡4などの標準的な光プローブに光ファイバを接続します。標準的な光学P後方散乱光を収集するために使用ローブは、ブリルアン信号を搬送します。

5.ブリルアンシフトを測定

  1. レーザー署名が消えるまで垂直方向と水平方向のマスクの両方を閉じます。それに応じて並進ステージを移動します。
  2. ゲインを有効にして、EMCCDカメラを飽和させることなく、できるだけ多くのカメラの積分時間を増やします。
  3. サンプルのブリルアンシフトを観察します。
    1. 共焦点顕微鏡(または他の光学プローブ)の焦点にサンプルを置きます。空間分解能は、共焦点顕微鏡に用いられる対物レンズに依存するであろう。プラスチック皿や液体のためのキュベットを使用してください。最初の測定のためにメタノールを使用してください。
  4. 分光器のスループットを最適化するには、開いているものが一度にマスクとVIPAを傾け、その並進ステージを調整することにより、分光器の受注をスキャン。信号が最強表示される順序を検索します。閉じる番目まで再びマスク電子レーザ信号が消えます。 (2.6および3.7に記載されている)他のマスクとVIPAを繰り返します。
  5. サンプルの測定を行います。
    1. ステップ2.7.1以下のスペクトルの画像を取ります。
    2. 水ガラス(または既知のブリルアンシフトを有する他のサンプル)のスペクトルの画像を撮影することにより、校正測定値を得ます。左上隅にある「ファイル」をクリックし、オプション "として保存」を選択して画像を保存します。データ分析は、カメラのソフトウェアで実行されている場合は、「の.sif」形式で画像を保存します。データ分析は、別の計算ソフトウェアプログラムで実行されている場合は、「.TIF」形式で画像を保存します。

6.キャリブレーションと分析ブリルアンスペクトルの

  1. ブリルアン分光計の光周波数変換率(PR)の自由スペクトル範囲(FSR)とEMCCDピクセルを決定します。
    1. カメラのソフトウェアや他のcomputaにデータをロードします的なソフトウェアプログラム。
    2. 水校正画像のスペクトル全体のラインプロットを生成するために、ステップ2.7.2に従ってください。
    3. 画素位置(P 水S、P 水AS)の観点からピーク位置を決定するために、ローレンツ曲線を有するスペクトルの2つのピークを適合。また、ピークの最高点を取ることによって、手動でピーク位置を読み出します。
    4. ガラスキャリブレーション画像のスペクトルとステップ6.1.2-6.1.3を繰り返します。
    5. 代わり6.1.1-6.1.4に、両方のEMCCDのフレームを追加し、一度にすべての4つのピークに合います。 ( 図2)
    6. P 水-ASおよびP ガラス-AS 6.1.3と6.1.4で決定するための値に式(1)プラグインを使用してPRを計算します。 Ω ガラス-ASは 29.3 GHz帯であることが知られています。自由スペクトル範囲は、唯一の20 GHz帯であるため、この場合には、9.3 GHz帯の周波数シフトとエイリアスが表示されます。簡単にするためにΩ ガラス-AS 9.3 GHz帯を使用します。 Ωのための7.46ギガヘルツを使用水-AS。
      式(1)
    7. P ガラス-Sの値が式2プラグインを使用して、FSRを計算し、P ガラス-ASとPR、6.16で計算。 Ω ガラス-AS用の9.3 GHzのを使用してください
      式(2)

図2

2.分光計の校正図(A)校正サンプルから得られたEMCCDカメラフレーム。 (B)を測定したデータ(青)のローレンツ曲線当てはめ(赤)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

  1. のブリルアンシフトを決定しますサンプル。
    1. サンプルのスペクトル全体のラインスキャンを生成するステップ2.7.2に従ってください。
    2. ピクセル位置の点でピーク位置を決定するために、ローレンツ曲線とスペクトルの2つのピークを合わせます。また、ピークの最高点を取ることによって、手動でピーク位置を読み出します。
    3. サンプルのブリルアンシフトを計算するために、次の式4と5とFSRとPRのために以前に計算された値を使用してください。
      式3

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Representative Results

図3は、代表的なブリルアンスペクトルと異なる材料のための彼らのフィットを示しています。 VIPAs両方が約20ギガヘルツのFSRになり5mmの厚さを有します。これらの測定のための積分時間は100ミリ秒でした。 100測定値を採取し、平均しました。 1つの較正測定は、スペクトルを取得する前に採取しました。

図3
異なる材料の3ブリルアンスペクトル図 測定されたデータへのローレンツ曲線当てはめ(赤)(青)。 (a)は、メタノールのブリルアンスペクトル。測定されたブリルアンシフトは5.59 GHzのです。 (b)は、エタノールのブリルアンスペクトル。測定されたブリルアンシフトは5.85 GHzのです。ポリスチレンの(c)のブリルアンスペクトル。測定されたブリルアンシフトは14.12 GHzのです。広告/ 53468 / 53468fig3large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

得られブリルアンシフトは、以前に公開されたデータ3,6,7に同意します。分光計の位置合わせが最適であるかどうかを決定するために、同じ材料の多数のスペクトル測定を順次撮影することができ、ピーク位置の標準偏差を計算することができる。 図4(a)は、順次撮影し、メタノール250ブリルアン測定の時間トレースを示しています;評価ブリルアンシフトのヒストグラムは、 図4Bに示されています。サンプルでの光の5 mWのとよく整列分光器と100ミリ秒の積分時間はσ〜10 MHzの標準偏差を持つことになります。角膜及び水晶体組織内のブリルアンシフトの変化は、1ギガヘルツ9,10,11のオーダーであることが測定されています。したがって、≤10メガヘルツの変動とブリルアンシフトの測定値は、関連の測定を可能にします組織における機械的変動。

図4
250メタノールの測定値を超えるブリルアンシフト図4.偏差。(A)をメタノール250ブリルアン計測の時間トレース。 (B)250の測定値を超えるブリルアンシフト偏差のヒストグラム。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

この分光計の構成の重要な設計上の特徴は、二つのステージが独立して整列させることができるということです。各段階からのスペクトルパターンは、CCDカメラ上に結像されるように、1イメージングシステム:VIPAエタロンは、光路の外にスライドさせると、分光計ステージの残りのレンズは、1を形成します。したがって、他のステージの配置に影響を与えることなく、その性能を向上させるための段階のいずれかに戻ることは簡単です。プロトコルで提案されている並進ステージと自由度のセットは、独立して、分光計の両段階を最適化する能力を維持するこの哲学に従ってください。

それは自由の傾斜度は、入力窓軸周りに回転するようにVIPAエタロンを実装することは困難です。エタロンを傾け、市販の光学機械部品で動作している場合その後、必然的に入力ウィンドウの小さな翻訳を紹介します。 translat光ビーム軸に沿ってイオンがあるため、入力レンズ(〜3ミリメートル)の大きなレイリー範囲の負の効果を誘発するべきではありません。一方、ビーム伝搬軸に直交変換を大幅に分光器のスループットを減少させることができます。 VIPAホルダーの並進自由度のチルトがフィネスとスループットを最大にするために連携して動作しなければならない理由です。なお、VIPAエタロンに光を結合することは、ほぼ無損失であるように、比較的高い傾斜角(〜3-5度)と位置合わせ手順を開始することが提案されています。位置合わせが改善されるように、傾斜角は、フィネスを改善するために低下させることができます。フィネスとスループットの最適化は、特に積分時間とレーザパワーが可能な限り低く維持しなければならない生物学的物質への応用のために、位置合わせプロトコルの重要な部分です。

プロトコルでは、Tからブリルアンシフトを抽出するために提案されています彼2つのスペクトルピークの分析、すなわちストークスとアンチストークスは、隣接する2つの回折次数からのピーク。これは、レーザ周波数ドリフト、またはエタロン温度の変化に起因するアーチファクトを最小限に本質的に堅固な手順です。しかし、著しく異なるスペクトルシフトを有するピークを測定することの欠点を有していてもよいです。実際には、スペクトルキャリブレーションの提供手順は、スペクトルパターンにわたって一定のスペクトル分散の仮定に基づいています。実際には、スペクトル分散は、回折の低い順序で増大します。その結果、分析されたスペクトルの領域すなわち隣接する回折次数からストークスおよび反ストークスピーク)は、異なるスペクトル分散体を有していてもよいです。この場合には、ここに記述されたスペクトル較正手順は、不正確なブリルアンシフトを提供します。これは、既知のブリルアンシフトの複数の材料が、多項式フィット分光較正曲線を構築するためにこのような状況で使用されるべきであることが示唆されています。ブリルアンシフトの絶対値は、2つの条件の間のブリルアンシフトの相対的な変化ではなく、比較する必要がある場合、これは特に重要です。

一般的に、VIPAを含む自由空間エタロンのフィネスは、〜50を超えない、ここで説明します。その結果、高スペクトル分解能と自由スペクトル範囲との間で検討するトレードオフが存在することになります。ほとんどの生体材料が10未満ギガヘルツのブリルアンシフトを持っているので、このプロトコルでは20 GHz帯の自由スペクトル範囲は、緑色(532nm)をレーザ動作のために提案されています。ストークスとアンチストークス周波数が半分FSRはスペクトルにエイリアスされて表示されますより大きくシフトしているため、FSRの半分だけはブリルアン分析に利用可能です。

困難は、ブリルアン信号を観測する際に遭遇する場合は、問題が迷光の過剰量に、またはブリルアン光子の低い数に関連しているかどうかを認識することが重要です。過度の浮遊LIGHTを効果的に除去する必要があります。ブラックボックスエンクロージャは光を通さないであることを確認してください。サンプルがなければ、部屋の照明をオンにするか、レーザーをオフにすると、大幅にEMCCDカメラ背景光子数を変更しないでください。レーザー光は、試料の表面から反射除去するために、わずかにサンプルを傾け、空間マスクで観測を開始し、信号を遮断することなく、可能な限り閉じました。これらの2つの手順は、非常に薄暗いブリルアン信号の観測を可能にするために、積分時間を増やすことが可能になります。それでも信号がない場合には、ブリルアン信号が弱すぎる可能性が高いです。メタノールなどの強いブリルアン信号と異なるサンプルを使用するか、または共焦点顕微鏡での集光光学系のアライメントをチェックしてください。正常に信号を観測した後、プロトコルに記載のステップ5.4に従うことによって、さらにそれを最適化します。

吸収又は散乱に起因する入射光の損失は、取得時間Rを増加させますサンプル分析のためにequired。その結果、最良の結果は、通常、透明または薄い材料で得られます。よく整列分光計は、液体材料や透明なプラスチックサンプルの積分時間のサンプルと100ミリ秒での光の5ミリワットで高い光子数(ピーク時> 1000)を取得することができる必要があります。これは、従来の走査型分光計よりも大幅に高速です。その低い取得時間と照射パワーに、このような分光計 、in vivoイメージング-機械3,10,11,12ためブリルアン分光法を用いて可能にしました。分析計のこのタイプを使用して、いくつかのグループは、脊髄液4の細菌性髄膜炎を検出し、アイレンズ13のレオロジー特性測定し、角膜の弾性係数14を分析などの様々な用途を実証しています。

分光器へのさらなる改良は、特に低損失の超狭帯域ならば、近い将来に期待されています通過および/またはノッチフィルタは、VIPAスペクトル分散に消光要件を緩和するために組み込むことができます。分光計は、標準的な光プローブの様々な組み合わせで使用することができるので、例えば、共焦点顕微鏡3,4,5、内視鏡、および細隙灯ophthalmoscopesため、VIPA分析計は、いくつかの生物医学的用途に尽力コンポーネントとすることができます。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
OPTICS
VIPA (virtual image phase array) LIGH MACHINERY Quantity: 2
Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers NEWPORT 423-MIC  Quantity: 1
SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 NEWPORT 9066-X Quantity: 1
Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI NEWPORT SM-13 Quantity: 1
Adjustable Width Slit NEWPORT SV-0.5 Quantity: 2
Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. NEWPORT DS40-Z Quantity: 2
Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range NEWPORT B-2B Quantity: 2
Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack THORLABS TR2-P5 Quantity: 2
Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack THORLABS PH2-P5 Quantity: 1
Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack THORLABS PH3-P5 Quantity: 1
Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap THORLABS LMR2 Quantity: 2
f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm THORLABS AC254-200-A Quantity: 2
Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed THORLABS KM100C Quantity: 2
Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) THORLABS CH1A Quantity: 2
f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm THORLABS L1653L1-A Quantity: 2
Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter THORLABS RA90 Quantity: 1
Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads THORLABS SM1A9 Quantity: 1
Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread THORLABS PB4 Quantity: 2
Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick THORLABS Ba2S7 Quantity: 2
543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. THORLABS F260APC-A Quantity: 1
SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators THORLABS Ad11F Quantity: 1
Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included THORLABS LM1XY Quantity: 1
Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long THORLABS P3-460B-FC-2 Quantity: 1
1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm THORLABS MAP103030-A Quantity: 1
SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches THORLABS SM1LXX Quantity: 1
Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts THORLABS BE1 Quantity: 8
Clamping Forks for  Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts THORLABS CF125 Quantity: 8
HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series  THORLABS HW-KIT5 Quantity: 1
D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture  THORLABS D20S Quantity: 2
FOR ENCLOSURE
25 mm Construction Rail, L = 21" THORLABS XE25L21 Quantity: 6
1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes THORLABS RM1G Quantity: 8
Right-Angle Bracket for 25 mm Rails THORLABS XE25A90 Quantity: 12
25 mm Construction Rail, L = 15" THORLABS XE25L15 Quantity: 4 
25 mm Construction Rail, L = 9" THORLABS XE25L09 Quantity: 8
High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll THORLABS T743-2.0 Quantity: 1
Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 THORLABS XE25T3 Quantity: 1
1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) THORLABS SH25LP38 Quantity: 1
60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric THORLABS BK5 Quantity: 1
CAMERA, LASER and MICROSCOPE
EMCCD camera ANDOR iXon Ultra 897 Quantity: 1
400 mW single mode green laser LASER QUANTUM torus 532 Quantity: 1
Research Inverted System Microscope  OLYMPUS IX71 Quantity: 1

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References

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バイオエンジニアリング、問題106、分光計、散乱、ブリルアン、バイオマテリアル、共焦点顕微鏡、機械イメージング
ブリルアン散乱分析用高速サブGHzの分光
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Berghaus, K. V., Yun, S. H.,More

Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis. J. Vis. Exp. (106), e53468, doi:10.3791/53468 (2015).

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