Summary
Здесь мы приводим протокол для создания быстрого Бриллюэна спектрометра. Каскадные практически изображенную фаз массив (VIPA) эталоны достигнуть скорости измерения более чем 1000 раз быстрее, чем традиционные сканирования Фабри-Перо спектрометров. Это улучшение предоставляет средства для Бриллюэна анализа ткани и биоматериалов при низких уровнях мощности в естественных условиях.
Abstract
Цель этого протокола заключается в создании параллельного высокого вымирание и высокого разрешения оптического спектрометра Бриллюэна. Бриллюэна спектроскопии является способ измерения бесконтактный, которые могут быть использованы для получения прямых показаний свойств вязкоупругого материала. Это был полезный инструмент в материальном характеристики, структурного мониторинга и зондирования окружающей среды. В прошлом Бриллюэна спектроскопии обычно используется сканирование Фабри-Перо эталонов для выполнения спектрального анализа. Этот процесс требует высокой мощности освещения и долгие времена приобретения, что делает технику непригодной для биомедицинских применений. Недавно введены роман спектрометр преодолевает эту проблему путем использования двух VIPAs в конфигурации поперечного оси. Это нововведение позволяет суб-гигагерц (ГГц) разрешение спектрального анализа с суб-второй раз приобретения и освещения власти в пределах безопасности биологической ткани. Многочисленные новые приложения при содействии этого улучшения являются у.е.rrently изучаются в биологических исследованиях и клинической практике.
Introduction
Бриллюэна, впервые описанный Leon Бриллюэна 1 в 1922 году, это рассеяние света от тепловых акустических мод в виде твердого вещества и от колебаний тепловых плотности в жидкости или газе. Спектральный сдвиг рассеянного света, как правило, в суб-ГГц диапазоне, предоставляет информацию о взаимодействии между падающего света и акустических фононов в образце. В результате, это может дать полезную информацию о вязкоупругих свойств исследуемого материала.
В своей спонтанной версии, Бриллюэна обычно имеет поперечное сечение в том порядке, комбинационного рассеяния, что приводит к очень слабым сигналом. Кроме того, частота Бриллюэна сдвиги порядков меньше, чем комбинационного рассеяния сдвигов. Как следствие, упруго рассеянного света (от Рэлея или рассеяния Ми), рассеянного света, и бэк-отражения от образца, может легко затмить Бриллюэна спектральной подпись. Следовательно, А Бриллюэна спектрометр должен не только достичь суб-ГГц спектральное разрешение, но и высокую спектральную контраст или вымирание.
В традиционных Бриллюэна спектрометров эти требования удовлетворяются сканирования решеткой монохроматорами, оптических методов избиение, и, наиболее широко, несколько частот сканирования Фабри-Перо 2. Эти методы измерения каждого спектрального компонента последовательно. Этот подход приводит к время обнаружения для одного Бриллюэна спектре от нескольких минут до нескольких часов, в зависимости от инструмента и на образце. VIPA спектрометр два этапа, построенный с помощью этого протокола, имеет способность собирать все спектральных компонентов в менее чем за секунду, обеспечивая достаточную вымирание (> 60 дБ) для эффективного подавления других паразитных сигналов 2.
Интеграция эталонов VIPA является ключевым элементом этого спектрометра. VIPA является твердой эталон с тремя различными Cплавающей области: на передней поверхности, узкая полоска антибликовое покрытие позволяет свету проникать в VIPA, в то время как остальная поверхность имеет высокой отражательной (HR) покрытие; В задней поверхности, частично отражающее покрытие обеспечивает небольшая часть (~ 5%) света должны быть переданы. При фокусировке на узком входе в слегка наклонена VIPA, луч света отражается в получает подкомпонентов с разницей фиксированной фазы в VIPA 2. Помехи между суб компонентов достигает стремился высокую спектральную дисперсию. Выравнивание два VIPAs последовательно в конфигурации поперечного оси вводит спектральную дисперсию в ортогональных направлениях 3. Спектральный дисперсия в ортогональных направлениях пространственно разделяет Бриллюэна пики от нежелательных помех, что позволяет подобрать только сигнал Бриллюэна. На рисунке 1 показан схематический вид VIPA спектрометра два этапа. Стрелки ниже оптических элементов указывают градРЗЭ свободы, в котором поступательные этапы должны быть ориентированы.
1. Инструментальная установки Рисунок. Оптическое волокно обеспечивает Бриллюэна в спектрометре. Цилиндрическая линза С1 (F = 200 мм) фокусирует свет во вход первой VIPA (VIPA1). Другой цилиндрической линзы С2 (F = 200 мм) отображает спектральный угловой дисперсии в пространственном разделении в фокальной плоскости С2. В этой плоскости, вертикальная маска используется, чтобы выбрать нужный участок спектра. Аналогичный конфигурации следующим образом, наклонена под углом 90 градусов. Луч проходит через сферическую линзу S1 (F = 200 мм) и ориентирована на входную щель второго VIPA (VIPA2). Сферической линзы S2 (F = 200 мм) создает двумерный спектрально разделенных образец в его фокальной плоскости, где горизонтальная другой маски находится. Хорзонтальная маска изображается на EMCCD камеры с помощью ахроматический объектив пару. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Студентом с некоторым оптики курсовых и основной опыт выравнивания должны быть в состоянии создавать и использовать этот двухступенчатый спектрометра. Спектрометр Недавно было показано, чтобы быть совместимым с различными оптическими датчиками стандартных 3,4,5 (например, конфокальный микроскоп, эндоскоп, щелевой лампы офтальмоскопа). Здесь спектрометр подключен к конфокальной микроскопии. Лазерный свет выравнивается в стандартный исследований инвертированной системы микроскопа после интегрирования разветвитель 90:10 луча. Свет обратного рассеяния от образца соединен в одномодовом волокне, что делает микроскопа конфокальной.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Бриллюэна спектральный анализ требует лазер одного-продольная мода (~ 10 мВт на образец). Для целей согласования, использовать сильно ослабленный часть этого лазерного луча (<0.1 мВт).
1. Начальная настройка волокна и EMCCD (Электрон Multiplied прибор с зарядовой связью) камеры
- Определить около 1600 мм свободного пространства для выравнивания спектрометра на оптическом столе.
- Установите камеру EMCCD в конце свободного пространства выравнивания.
- Используйте установочные винты, чтобы прикрепить камеру к сообщениям. Затянуть сообщения в почтовых владельцев на нужные оптические высотой оси. Затянуть держатели пост на оптическом столе, используя таблицы зажимов.
- Включите EMCCD камеры. Будьте внимательны, чтобы избежать насыщения камеры.
- Установите программное обеспечение камеры на лабораторном компьютере и подключить камеру к компьютеру.
- Отключить усиление и установить время интегрирования (~ 0.01 сек). Начните приобретения EMCCD изображения. Соблюдайте изображение с камерыс на экране компьютера.
- Установите волокна коллиматор о 1600 мм в передней части камеры.
- Поместите волокна коллиматор в адаптере волокна коллиматора.
- Установите адаптер на должность. Затянуть пост в держатель сообщению на приблизительной высоте оптической оси (высота камеры). Затянуть сообщению держатель на оптическом столе, используя таблицы зажимов.
- Выравнивание выходного пучка вдоль оптической оси.
- Используйте винт для подключения стандартные диафрагмы на должность. Затянуть пост в держатель после.
- Поместите диафрагму перед коллиматором волокна (<50 мм). Отрегулируйте высоту радужной оболочки до луча. Перемещение диафрагмы вдоль желаемой оптической оси, которые должны указывать непосредственно в камеру.
- Вставьте фильтр оптической плотности непосредственно после выхода лазерного если камера насыщения. Используйте регулировочные винты волокна коллиматора крепление для выравнивания луч вдоль оптической оси. Как только это будет достигнуто,луч чисто пройти через радужной оболочки вдоль всего пути луча.
- Установите согласованный ахроматический объектив пару (F = 30 мм) в передней части камеры.
2. Горизонтальное Стадия спектрометр
- Установите горизонтальную маску.
- Используйте установочные винты, чтобы прикрепить горизонтальную маску на должность. Затянуть пост в держатель после. Установите держатель сообщению на поступательного стадии, что позволяет маска скользить по горизонтали и из пути луча. (Рисунок 1)
- Используйте винты затянуть поступательное этап на оптическом столе, так что маска резко изображенную на ПЗС-камеры на фокусном расстоянии (F = 30 мм) ахроматической линзы пары.
- Горы и выровнять сферическую линзу S1 (F = 200 мм) 600 мм перед горизонтальной маски.
- Используйте установочные винты для крепления S1 на владельца почтового. Затянуть пост в держатель после.
- Установите два ирисы, как описано в 1.5.1. Перед placiнг S1 на пути луча, вставьте один диафрагмы до и после диафрагмы один в нужное положение S1 (600 мм в передней части горизонтальной маски). Высоту радужных оболочек, так что луч проходит через чисто них обоих.
- Поместите S1 600 мм перед горизонтальной маски (рис 1). Отрегулируйте высоту и угол S1, пока оба, задняя отражение от объектива и перекладины из-идет, чисто пройти через ирисов. Затянуть держатель сообщению холдинга S1 на оптическом столе с помощью таблицы зажимов.
- Гора VIPA2 в фокальной плоскости сферической линзы (200 мм в передней части S1).
- Установите держатель VIPA на должность, используя винты, поставляемые с держателем. Затянуть пост в держатель после. Затянуть держатель сообщению на горизонтальной стадии перевода. (Рисунок 1)
- Осторожно положите VIPA2 в держателе VIPA с входной щелью, ориентированной вертикально. (Рисунок 1)
- Точно отрегулируйте положение Ое VIPA монтировать быть точно в фокальной плоскости S1. (Проверьте трассировки перетяжки с белой карты.)
- Используйте винты затянуть поступательное этап на оптический стол и слайд VIPA2 из пучка с помощью степень свободы поступательного стадии.
- Горы и выровнять сферическую линзу S2 (F = 200 мм) 200 мм после того, VIPA и 200 мм в передней части горизонтальной маски. Выполните процедуру, описанную в 2.2.1-2.2.3. Вместо того, чтобы установка держателя сообщению на оптическом столе, смонтировать его на поступательного сцене с его степенью свободы, ориентированного вдоль оптической оси. (Рисунок 1) Используйте винты затянуть поступательное этап на оптическом столе.
- Используйте горизонтальную этап поступательного (2.3.4), чтобы скользить вход в VIPA2 в пути луча. Соблюдайте вертикальные линии на изображении с камеры.
- Точно отрегулируйте S2 с помощью поступательного этап установленный в 2.4, пока вертикальные линии на изображении с камеры не появляетсяострые.
- Отрегулируйте спектр со степенью горизонтальной наклона свободы на держателе VIPA и поступательного стадии. Используйте степень горизонтальной перевода свободы для настройки вход положение луча в эталоне. Используйте степень горизонтальной наклона свободы для настройки входного угла луча в эталоне.
- Измерьте утонченность и пропускную способность.
- Возьмите изображение, нажав F5 или, альтернативно, нажав кнопку "Настройка" приобретения в левом верхнем углу и выбрав опцию "принять образ" в программном обеспечении камеры.
- Щелкните правой кнопкой мыши на изображение и выберите опцию "сюжетной линии". Перетащите курсор по горизонтали изображение, чтобы генерировать сюжетной линии. Отпустите курсор, чтобы наблюдать созданный сюжетной линии.
- Используйте участок линии для измерения утонченность. Разделите расстояние между двумя пиками их полной шириной на половине максимума (FWHM). Стремитесь к> 30.
- Определить пропускную способность по measurinг мощность с измерителя мощности непосредственно до и после VIPA2. Стремитесь к> 50%.
- Настройте вход угол луча в эталона со степенью свободы на держателе VIPA (2.6) и соблюдать компромисс между изяществом и пропускной способности.
- Если утонченность и пропускная не являются удовлетворительными вернуться и тонкой настройки выравнивания. Убедитесь VIPA2 находится в фокальной плоскости S1. Повторите шаги 2.3.3 -2.7.
3. Вертикальная Стадия спектрометр
- Слайд VIPA (VIPA2), выравнивается в части 2, из пучка с помощью поступательного этап (2.3.4). Горизонтальная этап спектрометра теперь будет вести себя как 1: 1 системы формирования изображения.
- Установите вертикальную маску.
- Используйте установочные винты, чтобы прикрепить вертикальную маску на должность. Затянуть пост в адаптер после зажима прямым углом. Затянуть второй пост в правой угловой адаптер и поместить его в держатель после. Установите держатель сообщению на вертикальной поступательного стадии, allowiнг маску, чтобы скользить вертикально и из траектории луча. (Рисунок 1)
- Использование болты затянуть вертикальной этап поступательного на оптическом столе так, что вертикальное маска резко изображаемого на EMCCD камеры 200 мм перед S1.
- Гора и выровнять цилиндрическая линза C1 (F = 200 мм) 600 мм спереди от вертикальной маски.
- Винт с цилиндрической линзы держатель на должность. Затянуть пост в держатель после. Осторожно положите C1 в держатель объектива и затяните винты, чтобы зафиксировать его на месте.
- Установите два ирисы, как описано в 1.5.1. Перед размещением С1 на пути луча, вставьте один диафрагмы до и после диафрагмы один в нужное положение S1 (600 мм в передней части вертикальной маски). Высоту радужных оболочек, так что луч проходит через чисто них обоих.
- Место С1 600 мм в передней части вертикальной маски (Рисунок 1). Тщательно отрегулируйте высоту, наклон и боковое положение С1 дои, обратно отражение от объектива и перекладины из-идет, сосредоточены на ирисы. Затянуть пост держатель, удерживающий С1 на оптическом столе, используя таблицы зажимов.
- Крепление VIPA1 в фокальной плоскости цилиндрической линзы (200 мм перед C1).
- Установите держатель VIPA на должность, используя предоставленный винт с держателем. Затянуть пост в держатель после. Затянуть держатель сообщению на вертикальной стадии перевода. (Рисунок 1)
- Осторожно положите VIPA1 в держатель VIPA с входной щелью, ориентированной горизонтально. (Рисунок 1)
- Точно отрегулируйте положение VIPA смонтировать на место VIPA1 именно в фокальной плоскости С1. (Проверьте трассировки перетяжки с белой карты.)
- Использование болты затянуть вертикальной этап поступательного на оптическом столе и сдвиньте VIPA1 из пучка с помощью степень свободы поступательного стадии.
- Горы и выровнятьЦилиндрическая линза С2 (F = 200 мм) 200 мм после VIPA1 и 200 мм перед вертикальной маской, в соответствии с процедурой, описанной в 3.3.1-3.3.3. Вместо того, чтобы установка держателя сообщению на оптическом столе, смонтировать его на поступательного сцене с его степенью свободы, ориентированного вдоль оптической оси. (Рисунок 1) Используйте винты затянуть поступательное этап на оптическом столе.
- Используйте этап перевода (3.4.4), чтобы скользить вход в VIPA1 в пути луча. Соблюдайте горизонтальные линии на изображении с камеры.
- Точно отрегулируйте С2 с помощью поступательного этап установленный в 3,5 до горизонтальные линии на изображении с камеры не резким.
- Отрегулируйте спектр со степенью вертикальной наклона свободы на держателе VIPA и поступательного стадии. Используйте степень вертикальной перевода свободы для настройки вход положение луча в эталоне. Используйте степень вертикальной наклона свободы для настройки входного угла луча в Этална.
- Измерьте утонченность и пропускную способность.
- Выполните шаги 2.7.1 -2.7.2 для создания сюжетной линии вертикально поперек изображения на экране камеры.
- Используйте участок линии для измерения утонченность путем деления расстояния между двумя горизонтальными линиями их полная ширина на половине максимума (FWHM). Стремитесь к> 40.
- Измерить пропускную путем измерения мощности с помощью измерителя мощности непосредственно до и после VIPA1. Стремитесь к> 30%.
- Настройте вертикальный вход угол луча в эталона со степенью вертикальной наклона свободы на держателе VIPA (3.7). Соблюдайте компромисс между изяществом и пропускной способности.
- Если утонченность и пропускная не являются удовлетворительными вернуться и тонкой настройки выравнивания. Убедитесь VIPA1 находится в фокальной плоскости С1. Повторите шаг 3.4.3-3.8.
4. Сочетание двух этапов и окончательное согласование
- Слайд в VIPA2. Отметим, по горизонтали и вертикали расположенных точек. Эти точкиRe спектральной сигнатуры лазера одночастотной. Отрегулируйте поступательные этапы VIPAs тех пор пока точки не находятся в фокусе.
- Измерьте утонченность и пропускную способность спектрометра.
- Выполните шаги 2.7.1.-2.7.2 для создания сюжетной линии по диагонали двух лазерных точек.
- Используйте участок линии для измерения утонченность путем деления диагональной расстояние между двумя точками по их ширине на половине максимума (FWHM). Стремитесь к> 30.
- Построить черный ящик вложить спектрометра.
- Используйте строительства рельсы, чтобы построить коробки скелет, который должен приложить все спектрометр с волоконно коллиматора ПЗС-камеры (63 х 9 х 15 в в).
- Накройте ящик скелет с Blackout Fabric и ленты играй в углах. Убедитесь, что маски и VIPAs легко доступны.
- Волокно подключено к стандартным оптическим зондом, таких как отражения конфокальной микроскопии 4. Стандартный оптический рхалаты, используемые для сбора обратно рассеянного света будет нести сигнал Бриллюэна.
5. Измерение Бриллюэна клавишу Shift
- Закрыть вертикальной и горизонтальной маски до тех пор, лазерная подпись не исчезает. Перемещение этапы перевода соответственно.
- Включить усиления и увеличения времени интеграции камеры как можно больше, не насыщая EMCCD камеру.
- Соблюдайте Бриллюэна смещение образца.
- Поместите образец в фокусе конфокальной микроскопии (или другого оптического зонда). Пространственное разрешение будет зависеть от используемого объектива в конфокальной микроскопии. Использование пластиковую чашку или кювету для жидкостей. Использование метанола в течение первого измерения.
- Для оптимизации пропускной способности спектрометра, открытый одну маску на время и сканировать спектрометра заказов, наклоняя VIPA и регулируя его этап перевода. Найти порядок, в котором сигнал появляется сильнейший. Закрыть маска снова до го-лазера сигнал исчезает. Повторите с другой маской и VIPA (описано в 2.6 и 3.7).
- Выполните измерение образца.
- Возьмите изображение спектра следующим шагом 2.7.1.
- Получение калибровочных измерений путем фотографирования спектра воды и стекла (или другого образца с известной сдвига Бриллюэна). Сохранить изображение, нажав кнопку "Файл" в верхнем левом углу и выбрав опцию "Сохранить как". Сохранить изображение в формате ".sif", если анализ данных выполняется в программном обеспечении камеры. Сохранить изображение в формате .tif "," если анализ данных производится в другом вычислительной программы.
6. Калибровка и анализ спектра Бриллюэна
- Определить бесплатный спектральный диапазон (FSR) и EMCCD пиксель оптического коэффициента преобразования частоты (PR) в Бриллюэна спектрометра.
- Загрузите данные в программном обеспечении камеры или другого computaных программа.
- Следуйте шаг 2.7.2 для создания сюжетной линии по всему спектру калибровки изображением воды.
- Установите два пика спектра с лоренцевых кривых, чтобы определить пиковые позиции по позиции пикселя (P-водных S, P-Вода AS). В качестве альтернативы, зачитал пиковые позиции вручную, взяв самую высокую точку пиков.
- Повторите шаг 6.1.2-6.1.3 со спектром калибровочной стекла изображения.
- В качестве альтернативы 6.1.1-6.1.4, добавить обе EMCCD кадров и подходят все четыре вершины сразу. (Рисунок 2)
- Рассчитайте PR, используя уравнение 1. Подключите значений для Р-AS воды и P-стекла, как определено в 6.1.3 и 6.1.4. Ω стекла, как известно, чтобы быть 29,3 ГГц. В этом случае, так как в свободной спектральный диапазон находится всего в 20 ГГц будет выглядеть псевдонимов с частотой смены 9,3 ГГц. Для простоты использования 9,3 ГГц для стекла Ом-AS. Используйте 7,46 ГГц для ПВода-как.
- Рассчитайте FSR, используя уравнение 2. Подключите значений для Р-стекла S, P Glass-AS и PR, рассчитанных в 6.16. Используйте 9,3 ГГц для стекла Ом-AS.
Рисунок 2. калибровку спектрометра. (А) EMCCD камеры кадр получается из калибровочного образца. (B), кривая нужным лоренцевы (красный), чтобы измеренных данных (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- Определить Бриллюэна смещениеобразец.
- Последующие шаги 2.7.2 для генерации строки развертки по всему спектру образца.
- Установите два пика спектра с лоренцевых кривых, чтобы определить пиковые позиции по позиции пикселя. В качестве альтернативы, зачитал пиковые позиции вручную, взяв самую высокую точку пиков.
- Используйте следующие уравнения 4 и 5 и ранее вычисленные значения для FSR и PR для расчета Бриллюэна смещение образца.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 3 показывает представительный спектры Бриллюэна и их приспосабливает для различных материалов. В VIPAs оба имеют толщину 5 мм, что приводит к FSR приблизительно 20 ГГц. Время интегрирования для этих измерений была 100 мс. 100 измерений были приняты, и в среднем. Одно измерение калибровки было принято до приобретения спектров.
Рисунок 3. Бриллюэна спектров различных материалов. Лоренцевы кривая нужным (красный), чтобы измеренных данных (синий). (А) Бриллюэна спектр метанола. Измеренная Бриллюэна сдвиг 5,59 ГГц. (Б) Бриллюэна спектр этанола. Измеренная Бриллюэна сдвиг 5,85 ГГц. (С) Бриллюэна спектр полистирола. Измеренная Бриллюэна смещение 14.12 ГГц.объявления / 53468 / 53468fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Полученные Бриллюэна сдвиги согласен с ранее опубликованной 3,6,7 данных. Чтобы определить, если выравнивание спектрометра является оптимальным, многие спектральные измерения одного и того же материала могут быть приняты последовательно, а стандартное отклонение положения пиков может быть рассчитана. 4А показывает временную след 250 Бриллюэна измерений метанола принимать последовательно ; гистограмма оцененных Бриллюэна сдвигов показано на рисунке 4В. Хорошо выровнены спектрометр с 5 мВт света на образец и время интегрирования 100 мс будет иметь стандартное отклонение сг ~ 10 МГц. Изменения в Бриллюэна сдвига в роговицы и хрусталика ткани были измерены, чтобы быть на порядка 1 ГГц 9,10,11. Таким образом, показания Бриллюэна сдвига с изменчивостью ≤10 МГц позволит измерение актуальнымеханические колебания в ткани.
Рисунок 4. Отклонение Бриллюэна смену более 250 измерений метанола. (А) Время след 250 Бриллюэна измерений метанола. (Б) Гистограмма Бриллюэна сдвига отклонения более 250 измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ключевая особенность данной конфигурации спектрометра является то, что два этапа могут быть выровнены самостоятельно. При эталон VIPA скользит из оптического пути, остальные линзы стадии спектрометра образуют 1: 1 системы визуализации, так что спектральная образец из каждой ступени отображается на ПЗС-камеры. Таким образом, это просто вернуться к одному из этапов, чтобы улучшить его производительность, не влияя на выравнивание другой стадии. Набор трансляционных ступеней и степеней свободы, предложенных в протоколе выполните эту философию сохранении способности самостоятельно оптимизировать оба этапа спектрометра.
Трудно монтировать эталонов VIPA например, что степень наклона свободы вращается вокруг оси входного окна. Впоследствии, при работе с имеющимися в продаже оптико-механических компонентов, наклоняя эталон неизбежно вносит небольшой перевод входного окна. Translatионный вдоль оси оптического луча не должно вызывать отрицательные эффекты из-за большого диапазона Рэлея входного объектива (~ 3 мм). С другой стороны, перевод на оси, ортогональной к распространения луча может значительно снизить пропускную способность спектрометра. Поэтому поступательное и наклона степеней свободы на держателе VIPA должны работать в тандеме, чтобы максимизировать утонченность и пропускную способность. Он предложил начать процедуру выравнивания с относительно высокой угла наклона (~ 3-5 градусов), так что связи света в эталоне VIPA почти без потерь. Как выравнивание улучшается, угол наклона может быть уменьшено, чтобы улучшить утонченность. Оптимизация изяществом и пропускной является важной частью протокола выравнивания, особенно для применения в биологических материалах, где время интеграции и мощность лазера должна быть настолько низкой, насколько это возможно.
В протоколе, было высказано предположение, чтобы извлечь Бриллюэна переход от тон анализ двух спектральных пиков, а именно Стокса и анти-Стокса пиков от двух соседних порядков дифракции. Это неразрывно прочная процедура, которая сводит к минимуму артефакты из-за частоты лазера заносов, или изменения температуры эталоном. Тем не менее, измерения пиков с существенно отличается спектрального сдвига может иметь недостатки. В самом деле, при условии, процедура спектральной калибровки основаны на предположении одинаковой спектральной дисперсии через спектральной рисунком. В действительности, спектральная дисперсия увеличивается в нижних порядков дифракции. В результате регионы спектра, которые анализируемого (т.е. Стокса и анти-Стокса пики двух соседних порядков дифракции) может иметь различные спектральные дисперсий. В этом случае спектральное процедура калибровки здесь написано обеспечит неточные Бриллюэна сдвиги. Он предположил, что больше материалов известного Бриллюэна сдвига следует использовать в этой ситуации, чтобы построить спектральную калибровочную кривую с полиномиальной подгонки, Это особенно важно, если абсолютное значение сдвига Бриллюэна имеет в сравнении, а не относительного изменения Бриллюэна сдвига между двумя условиями.
Как правило, утонченность в свободном пространстве эталонов, в том числе VIPA описывается здесь, не превышает ~ 50. Как следствие, будет компромисс между учитывать высоким спектральным разрешением и свободной области спектра. В этом протоколе бесплатный спектральный диапазон 20 ГГц предложил для зеленого (532 нм) лазера, так как большинство биоматериалов есть Бриллюэна сдвиги менее 10 ГГц. Только половина FSR доступна для анализа Бриллюэна, потому что Стокса и анти-Стокса частота смещается больше, чем половина FSR будет выглядеть псевдоним в спектре.
Если возникают трудности в наблюдении сигнала Бриллюэна, важно признать ли вопросы, связанные с чрезмерным количеством постороннего света, или низким числом фотонов Бриллюэна. Чрезмерное бродячих лIGHT должны быть эффективно устранены. Убедитесь, что корпус черный ящик светонепроницаемого. Без образца, включение огней номеров или выключения лазера не должен существенно изменить EMCCD камеры подсчет фон фотонов. Для устранения лазерный свет отражается от поверхности образца, слегка наклонить образец, и начать наблюдение с пространственным масок закрыты, насколько это возможно без блокировки сигнала. Эти две процедуры позволит увеличить время интеграции, чтобы позволить наблюдение при очень тусклом сигнала Бриллюэна. Если до сих пор нет сигнала, есть вероятность, что сигнал Бриллюэна слишком слаб. Использование другого образца с сильным сигналом Бриллюэна, таком как метанол, или проверить выравнивание сбора оптики в конфокальной микроскопии. После успешного наблюдения сигнала, оптимизировать его дальше, следующим шагом 5,4, описанной в протоколе.
Потеря падающего света из-за поглощения или рассеяния увеличит приобретения времени тequired для анализа проб. В результате лучшие результаты обычно получают в прозрачных или тонких материалов. Хорошо выравнивается спектрометр должен иметь возможность получить высокий счет фотонов (> 1000 на пике) с 5 мВт света на образце и 100 мс времени интеграции для жидких материалов или прозрачных пластмассовых образцов. Это значительно быстрее, чем традиционные спектрометров сканирования. Из-за своей низкой времени приобретения и освещения власти, такой спектрометр включена с помощью спектроскопии Бриллюэна для в естественных условиях Механический изображений 3,10,11,12. Используя этот тип спектрометра, несколько групп продемонстрировали различные приложения, такие как измерения реологических свойств хрусталика глаза 13, обнаружение бактериального менингита в спинномозговой жидкости 4, и анализа роговицы упругости 14.
Дальнейшие улучшения в спектрометре, как ожидается, в ближайшем будущем, особенно если с низкими потерями ультра-узкая полосапройти и / или режекторный фильтр может быть включен, чтобы расслабиться требования вымирание на VIPA спектральной дисперсии. Поскольку спектрометр может быть использован в сочетании с различными оптическими датчиками стандартных, например конфокального микроскопа 3,4,5, эндоскопов и щелевой лампы офтальмоскопы спектрометр VIPA может быть инструментальной составляющей в нескольких биомедицинских применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
