Summary
Burada hızlı bir Brillouin spektrometresi inşa etmek için bir protokol mevcut. Neredeyse görüntülü faz dizi Basamaklı (VIPA) etalonları 1000'den fazla kat daha hızlı geleneksel tarama Fabry-Perot spektrometresi daha ölçüm hızına erişmek. Bu gelişme in vivo düşük güç seviyelerinde doku ve biyomalzemelerin Brillouin analizi için araçlar sağlar.
Abstract
Bu protokolün amacı, bir paralel yüksek sönme ve yüksek çözünürlüklü optik Brillouin spektrometresi inşa etmektir. Brillouin spektroskopisi viskoelâstik malzeme özelliklerinin doğrudan okunabilmesi için kullanılabilecek bir temassız ölçüm yöntemidir. Bu malzeme karakterizasyonu, yapısal izleme ve çevre algılama yararlı bir araç olmuştur. Geçmişte, Brillouin spektroskopisi genellikle spektral analizi gerçekleştirmek için tarama Fabry-Perot etalonları istihdam vardır. Bu süreç biyomedikal uygulamalar için uygun tekniği yapım, yüksek aydınlatma gücü ve uzun edinme süreleri gerektirmektedir. Geçtiğimiz günlerde tanıtılan yeni spektrometre çapraz eksen yapılandırmasında iki VIPAs kullanılarak bu sorunu üstesinden gelir. Bu yenilik biyolojik doku güvenlik sınırları içinde alt ikinci edinimi süresi ve aydınlatma gücüne sahip alt gigahertz (GHz) çözünürlük spektral analiz sağlar. Bu gelişme kolaylaştırdı birden yeni uygulamalar cu vardırrrently biyolojik araştırma ve klinik uygulamada araştırılmaktadır.
Introduction
1922 yılında Leon Brillouin 1 tarafından tarif Brillouin saçılması, bir katı ve bir sıvı ya da gaz termal yoğunluk dalgalanmalarına termal, akustik modları ışık inelastik dağılımıdır. Genellikle alt GHz-aralığında dağınık ışık spektral kayması, olay ışık ve örnek akustik fononların arasındaki etkileşim hakkında bilgi sağlar. Bunun bir sonucu olarak, incelenen malzemenin viskoelastik özelliklerinin ilgili faydalı bilgiler sağlayabilir.
Onun kendiliğinden versiyonunda, Brillouin saçılması genellikle çok zayıf bir sinyal sonuçlanan Raman saçılması sırasına göre kesitlerini vardır. Ayrıca, Brillouin frekans kaymaları Raman vardiya daha küçük büyüklük kararlarıdır. Bunun bir sonucu olarak, elastik, kaçak ışık ve arka yansımalar (Rayleigh veya Mie saçılımı itibaren) tüm kolayca Brillouin spektral imza gölgeleyebilir örnek kapalı ışık saçtı. Bundan dolayıBir Brillouin spektrometre alt GHz spektral çözünürlüğü değil, aynı zamanda yüksek spektral kontrast veya nesli elde etmek için değil sadece ihtiyaç duyar.
Geleneksel Brillouin spektrometre Bu zorunluluklara en popüler tarama-ızgara monokromatörler, optik dayak yöntemleri ve, çok geçişli tarama Fabry-Perot interferometreler 2 tarafından karşılanmaktadır. Bu yöntemler, her spektral komponent sekans ölçer. Bu yaklaşım, aracı ile numuneye bağlı olarak, birkaç saate kadar, birkaç dakika arasında değişen tek bir Brillouin spektrumu için elde etme sürelerine yol açar. Bu protokolü kullanılarak inşa iki aşamalı VIPA spektrometre, etkili bir diğer sahte sinyaller 2 bastırmak için yeterli sönme (> 60 dB) sağlarken daha az bir saniye içinde spektral bileşenlerin tüm toplamak için yeteneği vardır.
VIPA etalonu entegrasyonu bu spektrometre temel unsurudur. Bir VIPA üç farklı c sağlam bir etalon olduğunualanları oating: yüzeyin geri kalanı oldukça yansıtıcı (HR) kaplama sahipken ön yüzeyinde, dar bir yansıma önleyici kaplama şeridi, ışık VIPA girmek için izin verir; arka yüzeyine bir kısmen yansıtıcı kaplama ışık küçük bir kısmı (~% 5) iletilmesini sağlar. Hafif eğimli VIPA dar girişinde üzerine odaklanmış, ışık demeti VIPA 2 içinde sabit faz farkı ile alt bileşenlerine yansır. Alt bileşenleri arasındaki Girişim hedeflenen yüksek spektral dağılımını ulaşır. Çapraz eksen konfigürasyonda ardışık iki VIPAs hizalama ortogonal istikamette 3 spektral dispersiyon getirmektedir. Dik yönlerde spektral dağılım mekansal mümkün sadece Brillouin sinyal almaya kılan istenmeyen karışma, gelen Brillouin doruklarına ayırır. 1 görüntüler iki aşamalı VIPA spektrometresi bir şemasını Şekil. Optik elemanlar aşağıda oklar ° işaretöteleme aşamaları odaklı gereken özgürlük ree.
Şekil 1. Enstrümantal kurulum. Bir fiber optik spektrometresi içine Brillouin saçılması sunar. Silindirik mercek C1 (f = 200 mm), ilk VIPA (VIPA1) girişinde içine ışık odaklanır. Başka bir silindir lens C2 (f = 200 mm) C2 odak düzleminde lokal ayırma spektral açısal dispersiyon eşleştirir. Bu düzlemde, dikey bir maske spektrum istenilen bölümünün seçilmesi için kullanılır. Benzer bir yapılandırma 90 derecede eğik, izler. Kiriş küresel lens S1 (f = 200 mm) içinden geçer ve ikinci VIPA (VIPA2) giriş açıklığına odaklanmıştır. Bir küresel lens S2 (f = 200 mm) başka bir yatay maske yerleştirilir odak düzlemi, iki boyutlu spektral olarak ayrılmış bir desen oluşturur. Horizontal maske bir akromatik objektif çifti kullanılarak EMCCD kamera üzerine görüntülü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bazı optik kurs ve temel hizalama deneyimi ile bir lisans öğrencisi oluşturmak ve bu iki aşamalı spektrometresi kullanmak gerekir. Spektrometre son standart optik prob çeşitli 3,4,5 (örneğin, konfokal mikroskop, endoskop, slit-lamp oftalmoskop) ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiştir. Burada, spektrometre konfokal mikroskop bağlanır. Lazer ışığı 90:10 ışın ayırıcı entegre sonra standart bir araştırma ters sistem mikroskop içine hizalanmış. Örnekten ince filmlerden ışık mikroskobu konfokal yapma, tek modlu fiber içine birleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Not: Brillouin spektral analizi tek boyuna mod lazer (~ numune 10 mW) gerektirir. Amaçları hizalanması için, bu lazer ışınının (<0.1 mW) bir kuvvetle zayıflatılmış bir kısmını kullanır.
1. İlk Fiber Kurulum ve EMCCD (Elektron çarpınız Charge Coupled Device) Kamera
- Bir optik masaya spektrometre için yaklaşık 1.600 mm boş hizalama alanı belirleyin.
- Ücretsiz hizalama alanı sonunda EMCCD kamera monte edin.
- Mesajlarý kamerayı bağlamak için ayar vidalarını kullanın. Istenen optik eksen yüksekliğinde sonrası tutuculara mesajları sıkın. Masa kelepçeler kullanılarak optik masanın üzerine yazılan sahipleri sıkın.
- EMCCD Kamerayı açın. Kamera doygunluk önlemek için dikkatli olun.
- Laboratuar bilgisayarda kamera yazılımı yükleyin ve fotoğraf makinesini bilgisayara bağlayın.
- Kazanç devre dışı bırakın ve düşük entegrasyon süresi (~ 0.01 sn) ayarlayın. EMCCD görüntüleri elde başlayın. Kamera görüntüyü gözlemleyinBilgisayar ekranında s.
- Kamera önünde 1600 mm ilgili lif kolimatör monte edin.
- Lif kolimatör adaptörü elyaf kolimatör yerleştirin.
- Bir yazı üzerine montaj adaptörü. Optik eksen (kamera yükseklik) yaklaşık yükseklikte bir post tutucu içine yazı sıkın. Masa kelepçeler kullanılarak optik masanın üzerine yazılan tutucu sıkın.
- Optik eksen boyunca çıkış ışınını aynı hizaya getirin.
- Bir mesaja standart iris bağlamak için bir ayar vidasını kullanın. Sonrası tutucu içine yazı sıkın.
- Lif kolimatör (<50 mm) önünde iris yerleştirin. Işınına iris yüksekliğini ayarlayın. Kameraya doğrudan işaret etmelidir istenen optik eksen boyunca iris, hareket ettirin.
- Kamera Doymuş eğer lazer çıkışı sonrasında doğrudan bir optik yoğunluk filtresi takın. Optik eksen boyunca ışın hizalamak için monte fiber kolimatör ayar vidalarını kullanın. Bu elde edilir,kiriş temiz tüm ışın yolu boyunca iris geçecek.
- Kamera önünde bir eşleştirilmiş akromatik objektif çifti (f = 30 mm) monte edin.
Spektrometre 2. Yatay Sahne
- Yatay maske takın.
- Bir yazı üzerine yatay maske takmak için ayar vidalarını kullanın. Sonrası tutucu içine yazı sıkın. Maske ve ışın yolunun dışına yatay kaymasına izin veren bir öteleme sahneye yazılan tutucu monte edin. (Şekil 1)
- Maske akromatik objektif çiftinin odak uzaklığı (f = 30 mm) CCD kamera üzerine keskin görüntülü şekilde optik masa üzerinde translasyonel sahne sıkmak için kapak vidaları kullanın.
- Dağı ve küresel lensi S1 (f = 200 mm), yatay maske önünde 600 mm hizalayın.
- Sonrası tutucu üzerine S1 monte ayar vidalarını kullanın. Sonrası tutucu içine yazı sıkın.
- 1.5.1 de tarif edildiği gibi, iki süsen monte edin. Placi önceng S1 ışın yolu, önce bir iris ve istenilen S1 pozisyon sonra bir iris (yatay maske önünde 600 mm) yerleştirin. Kiriş temiz her ikisi geçer şekilde süsen yüksekliğini ayarlayın.
- S1 yatay maske önünde 600 mm (Şekil 1) yerleştirin. Hem kadar yükseklik ve S1 açısını ayarlayın, lens ve dışarı-gelen ışının kapalı arka yansıması, temiz süsen geçer. Masa kelepçeler kullanarak optik masa üzerine S1 tutan yazılan tutucu sıkın.
- Küresel lensin odak düzlemi Mount VIPA2 (S1 önünde 200 mm).
- Tutucu ile verilen vidaları kullanarak bir yazı üzerine VIPA tutucu monte edin. Sonrası tutucu içine yazı sıkın. Yatay çeviri sahneye yazılan tutucu sıkın. (Şekil 1)
- Dikey olarak yönlendirilmiş giriş açıklığının VIPA tutucu dikkatlice VIPA2 yerleştirin. (Şekil 1)
- Pozisyon o ince ayarlamaf VIPA S1 odak düzleminde tam olarak monte edilir. (Beyaz kart ile ışın bel izleyerek kontrol edin.)
- Öteleme aşamada serbestlik derecesi kullanılarak kiriş dışına optik masa ve slayt VIPA2 üzerine translasyonel sahne sıkmak için kapak vidaları kullanın.
- Dağı ve küresel lensi S2 (f = 200 mm) VIPA sonra 200 mm ve yatay maske önünde 200 mm hizalayın. 2.2.1-2.2.3 açıklanan prosedürü uygulayın. Bunun yerine, optik masaya sonrası tutucu bağlama, optik eksen boyunca yönlendirilmiş özgürlük derecesine sahip bir öteleme sahneye monte edin. (Şekil 1) Optik masanın üzerine translasyonel sahne sıkmak için kapak vidaları kullanın.
- Işın yoluna VIPA2 giriş kaydırmak için yatay öteleme sahne (2.3.4) kullanın. Kamera görüntüsünde dikey çizgiler dikkat edin.
- Kamera görüntüsünde dikey çizgiler görünür kadar 2.4 monte translasyonel sahne kullanarak S2 İnce ayarlamakkeskin.
- VIPA sahibinin özgürlük yatay-tilt derecesi ve translasyonel sahne ile spektrum ayarlayın. Etalon içine ayarlamak için ışının giriş pozisyonunu özgürlüğü yatay-çeviri derecesini kullanın. Etalon içine ayarlamak için kirişin giriş açısını özgürlüğü yatay-tilt derecesini kullanın.
- Incelik ve verimi ölçün.
- Sol üst köşedeki "satın alma kurulumu" tıklayıp seçeneği kamera yazılımı "görüntü çekmek" seçerek alternatif F5 tuşuna basarak veya bir görüntü almak.
- Sağ resmin üzerine tıklayınız ve seçenek "hat komplo" seçiniz. Bir çizgi arsa üretmek için resmi yatay imleci sürükleyin. Oluşturulan çizgi arsa gözlemlemek için imleci bırakın.
- Incelik ölçmek için hat arsa kullanın. Yarım maksimum (FWHM) onların tam genişliğinde iki tepe arasındaki mesafeyi bölün. > 30 hedefleyin.
- Measurin tarafından verimini belirlemekg hemen öncesi ve sonrasında VIPA2 bir güç ölçer güç. >% 50 hedefleyin.
- Dinle VIPA tutucu (2.6) üzerine serbestlik derecesi ile etalon içine ışının giriş açısı ve ticaret-off incelik ve hacmi arasında gözlemleyin.
- Incelik ve verimlilik tatmin edici değilse geri dönün ve hizalama ince ayarlayın. Emin VIPA2 S1 odak düzlemi içindedir. Yineleyin 2.3.3 -2.7 adımları.
Spektrometre 3. Dikey Sahne
- VIPA (VIPA2) kaydırın, translasyonel sahne (2.3.4) kullanılarak kiriş dışına, part 2 hizalanmış. 1 görüntüleme sistemi: spektrometresi yatay aşaması artık 1 olarak davranacaktır.
- Dikey maske takın.
- Bir yazı üzerine dikey maske takmak için ayar vidalarını kullanın. Bir dik açı sonrası kelepçe adaptörü içine bir yazı sıkın. Dik açı adaptörü içine ikinci bir yazı sıkın ve sonrası tutucu içine koydu. Dikey öteleme sahne, allowi üzerine yazılan tutucu monteMaskeyi ng ve ışın yolunun dışına dikey kaydırmak için. (Şekil 1)
- Kullanım kapak vidaları dikey maske EMCCD kamera üzerine keskin S1 önünde 200 mm görüntülü şekilde optik masanın üzerine dikey öteleme sahne sıkın.
- Dağı silindirik lens C1 (f = 200 mm), dikey maske önünde 600 mm hizalayın ve.
- Bir yazı üzerine silindirik lens tutucusu vidalayın. Sonrası tutucu içine yazı sıkın. Dikkatlice mercek tutucunun içine C1 yerleştirin ve yerine bunu düzeltmek için vidaları sıkın.
- 1.5.1 de tarif edildiği gibi, iki süsen monte edin. Işın yolu C1 yerleştirmeden önce, önce bir iris ve istenilen S1 pozisyon sonra bir iris (dikey maske önünde 600 mm) yerleştirin. Kiriş temiz her ikisi geçer şekilde süsen yüksekliğini ayarlayın.
- Talep C1 dikey maskesinin ön 600 mm (Şekil 1). Dikkatle yüksekliği, tilt ve C1 lateral pozisyon kadar ayarlayınhem objektif ve dışarı çıkan ışının kapalı arka yansıması, süsen üzerine ortalanır. Masa kelepçeler kullanılarak optik masanın üzerine yazılan tutucu tutma C1 sıkın.
- Silindirik lensin odak düzlemi Mount VIPA1 (C1 önünde 200 mm).
- Tutucu ile sağlanan vidayı kullanarak bir yazı üzerine VIPA tutucu monte edin. Sonrası tutucu içine yazı sıkın. Dikey çeviri sahneye yazılan tutucu sıkın. (Şekil 1)
- Yatay yönelimli giriş açıklığının VIPA tutucu içine dikkatlice VIPA1 yerleştirin. (Şekil 1)
- VIPA pozisyonu C1 odak düzleminde tam VIPA1 yerleştirmek için montaj İnce ayarlar. (Beyaz kart ile ışın bel izleyerek kontrol edin.)
- Kullanım kap vidaları, optik masanın üzerine dikey öteleme sahne sıkın ve translasyonel aşamada özgürlüğü derecesini kullanarak kiriş dışına VIPA1 kaydırın.
- Dağı ve hizalamasilindir lens C2 (f = 200 mm) 3.3.1-3.3.3 tarif edilen prosedür izlenerek VIPA1 sonra 200 mm ve düşey maske önünde 200 mm. Bunun yerine, optik masaya sonrası tutucu bağlama, optik eksen boyunca yönlendirilmiş özgürlük derecesine sahip bir öteleme sahneye monte edin. (Şekil 1) Optik masanın üzerine translasyonel sahne sıkmak için kapak vidaları kullanın.
- Işın yoluna VIPA1 giriş kaydırın çeviri aşamasında (3.4.4) kullanın. Kamera görüntüsünde yatay çizgiler dikkat edin.
- Kamera görüntüsünde yatay çizgiler keskin görünür kadar 3.5 monte translasyonel sahne kullanarak C2 Fine-ayarlayın.
- VIPA tutucu özgürlük dikey eğim derecesi ve translasyonel sahne ile spektrum ayarlayın. Etalon içine ayarlamak için ışının giriş pozisyonunu özgürlüğü dikey çeviri derecesini kullanın. Etal içine ayarlamak için kirişin giriş açısını özgürlüğü dikey eğim derecesi kullanınüzerinde.
- Incelik ve verimi ölçün.
- Kamera ekranında bir görüntü üzerinde dikey bir çizgi arsa oluşturmak için adımları 2.7.1 -2.7.2 izleyin.
- Yarım maksimum (FWHM) onların tam genişliğinde iki yatay çizgi arasındaki mesafeyi bölerek incelik ölçmek için hat arsa kullanın. > 40 hedefleyin.
- Hemen önce ve VIPA1 sonra güç ölçer ile güç ölçerek hacmini ölçün. >% 30 hedefleyin.
- Dinle VIPA tutucu (3.7) üzerine serbestlik dikey eğim derecesi ile etalon içine ışının dikey giriş açısı. Incelik ve verim arasındaki ticaret-off gözlemleyin.
- Incelik ve verimlilik tatmin edici değilse geri dönün ve hizalama ince ayarlayın. Emin VIPA1 C1 odak düzlemi içindedir. Adımı yineleyin 3.4.3-3.8.
İki Aşamaları ve Final Uyum 4. Kombinasyon
- VIPA2 içinde kaydırın. Yatay ve dikey aralıklı noktalar dikkate alınmalıdır. Bu noktalar, birtek frekanslı lazer spektral imza yeniden. Noktalar keskin odak kadar VIPAs translasyonel aşamalarını ayarlayın.
- Spektrometre incelik ve verimi ölçün.
- Adımları izleyin 2.7.1.-2.7.2 çapraz lazer nokta arasında iki çizgi arsa üretmek için.
- Yarım maksimum (FWHM) onların tam genişliğinde iki nokta arasındaki mesafeyi diyagonal bölerek incelik ölçmek için hat arsa kullanın. > 30 hedefleyin.
- Spektrometre içine bir kara kutu oluşturun.
- (In x 15 x 9 63) CCD kamera fiber kolimatör kadar tüm spektrometresi içine almalısınız kutu iskelet inşa etmek inşaat rayları kullanın.
- Blackout Kumaş ile kutu iskeleti örtün ve köşelerde sıkı bantlayın. Maskeler ve VIPAs kolayca erişilebilir olduğundan emin olun.
- Böyle bir yansıma konfokal mikroskop 4 olarak standart optik prob, fiber bağlayın. Standart optik pgeri saçılan ışık toplamak için kullanılan elbiseler Brillouin sinyalini taşıyacak.
5. Brillouin Shift Ölçme
- Yakın hem dikey hem de yatay maskeler lazer imza kaybolana kadar. Buna göre tercüme aşamalarını taşıyın.
- Kazanç etkinleştirin ve EMCCD kamera doyurarak olmadan mümkün olduğu kadar kamera entegrasyonu süresini artırın.
- Bir numunenin Brillouin kayması gözlemleyin.
- Konfokal mikroskobu (ya da diğer optik prob) odak bir örneğini yerleştirin. Uzaysal çözünürlük konfokal mikroskop kullanılır objektif lens bağlıdır. Plastik tabak veya sıvılar için bir küvet kullanın. Ilk ölçüm için Metanol kullanın.
- Bir seferde spektrometre hacmi, açık tek maske optimize etmek ve VIPA eğerek ve çeviri aşamasında ayarlayarak spektrometre emirleri ile taramak için. Sinyal güçlü görünen sırayı bulun. Inci kadar tekrar kapat maskee lazer sinyali kaybolur. Diğer maskesi ve VIPA (2.6 ve 3.7 'de açıklandığı) ile tekrarlayın.
- Örnek bir ölçüm alın.
- Adım 2.7.1 Aşağıdaki yelpazenin bir görüntü alın.
- Su ve cam (ya da bilinen Brillouin kayması diğer örnek) spektrumunun bir görüntü alarak kalibrasyon ölçümleri alın. Sol üst köşedeki "dosyasını" tıklayıp "seçeneği olarak kaydetmek" seçerek görüntüyü kaydedin. Veri analiz kamera yazılımı yapılırsa ".sif" biçiminde görüntü kaydetme. Veri analizi başka hesaplama yazılım programında yapılırsa "Tif" biçiminde görüntü kaydetme.
6. Kalibrasyon ve Analiz Brilluoin Spektrum
- Ücretsiz spektral aralığı (FR) ve Brillouin spektrometresi optik frekans dönüşüm oranı (PR) EMCCD piksel belirleyin.
- Kamera yazılımı veya başka bir COMPUTA verileri yükleyintional yazılım programı.
- Su kalibrasyon görüntünün yelpazesinde bir çizgi arsa üretmek için adım 2.7.2 izleyin.
- Piksel konumu (P Su-S, p Su-AS) cinsinden pik pozisyonları belirlemek için Lorentz eğrileri ile spektrumun iki tepe monte edin. Alternatif olarak, zirveleri en yüksek puan alarak elle zirve pozisyonlarını okudum.
- Cam kalibrasyon görüntü spektrumu ile adımı tekrarlayın 6.1.2-6.1.3.
- Alternatif 6.1.1-6.1.4 için, hem EMCCD çerçeve eklemek ve bir kerede tüm dört doruklarına uygun. (Şekil 2)
- P Su-AS P Cam-AS 6.1.3'e ve 6.1.4 kararlı değerlerini Denklem 1. Tak kullanarak PR hesaplayın. Ω Cam-AS 29.3 GHz olduğu bilinmektedir. Bu durumda, çünkü ücretsiz spektral aralığı 9.3 GHz frekans kayması ile takma ad görünür sadece 20 GHz. Kolaylık olması açısından Ω Cam AS 9.3 GHz kullanın. Ê için 7.46 GHz kullanınSu AS.
- 6,16 hesaplanan P Cam-S, P Cam-AS ve PR, değerlerini Denklem 2. Tak kullanarak FSR'ye hesaplayın. Ω Cam AS 9.3 GHz kullanın.
2. Spektrometre kalibrasyonu Şekil. (A) EMCCD kamera çerçeve kalibrasyonu numuneden elde. (B) ölçülen verilerin (mavi) Lorentz eğri fit (kırmızı). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
- Brillouin kayması belirleyinBir örnek.
- Numunenin yelpazesinde bir çizgi taraması oluşturmak için adım 2.7.2 izleyin.
- Piksel konumu açısından zirve pozisyonlarını belirlemek için Lorentz eğrileri ile spektrumun iki tepe takınız. Alternatif olarak, zirveleri en yüksek puan alarak elle zirve pozisyonlarını okudum.
- Numunenin Brillouin kayması hesaplamak için FSR'nin ve PR için aşağıdaki denklemleri 4 ve 5 ve daha önceden hesaplanan değerleri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3 temsilci Brillouin spektrumları ve farklı malzemeler için kendi uyuyor gösterir. VIPAs ikisi de yaklaşık 20 GHz FSR ile sonuçlanır 5 mm'lik bir kalınlığa sahiptir. Bu ölçümler için entegrasyon süresi 100 milisaniye idi. 100 ölçüm çıkarılmış ve ortalaması alınmıştır. Bir kalibrasyon ölçüm spektrumları elde öncesinde alınmıştır.
Farklı malzemelerin 3. Brilluoin Spectra Şekil. Ölçülen verilerin (mavi) Lorentz eğri fit (kırmızı). Metanol (a), Brillouin spektrumu. Ölçülen Brillouin vardiya 5.59 GHz. Etanol (b) Brillouin spektrum. Ölçülen Brillouin vardiya 5,85 GHz. Polistiren (c) Brillouin spektrum. Ölçülen Brillouin vardiya 14.12 GHz.reklam / 53468 / 53468fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Elde edilen Brillouin kaymalar önceden yayınlanmış veriler 3,6,7 katılıyorum. Spektrometrenin hizalanmasının optimal, aynı malzemeden yapılmış bir çok spektral ölçümler ardışık olarak alınabilir, ve pik pozisyonları standart sapma hesaplanır olup olmadığını belirlemek. Şekil 4A, metanol alınan sırasıyla 250 Brillouin ölçümlerinin bir zaman izini gösteren ; değerlendirilmiştir Brillouin vardiya bir histogramıdır Şekil 4B'de gösterilmiştir. Örnek ışığın 5 mW ile iyi hizalanmış spektrometre ve 100 milisaniye arasında bir entegrasyon süresi σ ~ 10 MHz'lik bir standart sapma sahip olacaktır. Kornea ve lens doku içinde Brillouin kayması değişiklikler 1 GHz 9,10,11 sırasına olduğu ölçülmüştür. Bu nedenle, ≤10 MHz değişkenliği ile Brillouin vardiya okumaları ilgili ölçümünü sağlayacakdokuda mekanik varyasyonları.
250 metanol ölçümlerin üzerinde Brillouin vardiyada Şekil 4. Sapma. (A) metanol 250 Brillouin ölçümlerinin Zaman iz. 250 ölçümlerin üzerinde Brillouin kaydırma sapmasının (B) Histogram. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu spektrometre konfigürasyonunun önemli bir tasarım özelliği, iki kademeli, bağımsız olarak hizalanmış olmasıdır. Her aşamada spektral desen CCD kamera üzerine görüntülü şekilde, 1 görüntüleme sistemi, bir VIPA etalonu optik yol üzerinden kaydırılır zaman spektrometre aşamasında geri kalan lensler 1 oluşturmaktadır. Bu nedenle, diğer aşamanın uyum etkilemeden kendi performansını artırmak için aşamalarında ikisinden biri geri dönmek basittir. Protokolde önerilen çeviri aşamaları ve serbestlik derecesi kümesi bağımsız spektrometre iki aşamalarını optimize yeteneğini sürdürmek bu felsefeyi takip edin.
Bu özgürlük eğim derecesi giriş penceresi ekseni etrafında döner şekilde VIPA etalonları monte etmek zordur. Etalonu eğerek, piyasada mevcut opto-mekanik bileşenleri ile çalışırken Daha sonra, kaçınılmaz olarak giriş penceresinin küçük bir çevirisini tanıttı. Translatoptik ışın ekseni boyunca iyon için giriş lens (~ 3 mm) büyük Rayleigh aralığında negatif etkilere neden olmamalıdır. Öte yandan, kiriş yayılma eksen dik olarak çeviri anlamlı spektrometrenin hacmini azaltabilir. Öteleme ve VIPA tutucuya serbestlik eğim dereceleri incelik ve verimi en üst düzeye çıkarmak için tandem ameliyat olmak zorunda nedeni budur. Bu nispeten yüksek eğim açısı (~ 3-5 derece) böylece VIPA etalon içine bağlama ışık hizalama işlemini başlatmak için önerilir neredeyse kayıpsız olduğunu. Hizalama geliştikçe, eğim açısı incelik geliştirmek için azaltılabilir. Incelik ve verim optimizasyonu, özellikle entegral süresi ve lazer gücü mümkün olduğu kadar düşük tutulmalıdır biyolojik malzemelerin uygulamalar için, hizalama protokolünün önemli bir parçasıdır.
Protokolde, bu t Brillouin kayması çıkarmak için ileri sürülmüştürİki spektral zirveleri, iki komşu kırınım siparişleri yani Stokes ve Anti-Stokes zirvelerinden o analizi. Bu durum, lazer frekans sürüklenir, ya da etalon sıcaklık değişimlerine eserler en aza indiren özünde güçlü bir işlemdir. Ancak, önemli ölçüde farklı spektral vardiya ile zirveleri ölçüm sakıncaları olabilir. Aslında, spektral kalibrasyon için verilen prosedür spektral desen genelinde sabit spektral dağılım varsayımına dayanmaktadır. Gerçekte, spektral dağılım kırınım alt siparişleri artar. Bunun bir sonucu olarak, analiz edilir spektrum bölgelerinin (yani, iki bitişik difraksiyon siparişlerinden Stokes ve Anti-Stokes zirveler) farklı tayf dispersiyonlar sahip olabilir. Bu durumda, burada yazılı spektral kalibrasyon prosedürü yanlış Brillouin vardiya sağlayacaktır. Bilinen Brillouin vardiya fazla malzemeler polinom uyum ile bir spektral kalibrasyon eğrisi oluşturmak için bu durumda kullanılması gerektiğini önerilmektedir. Brillouin kayması mutlak değeri, iki durum arasında Brillouin kayması göreceli değişim yerine göre edilmesi gerektiğinde bu özellikle önemlidir.
Tipik olarak, VIPA dahil serbest alan etalonu incelik, ~ 50 aşmak değil, burada açıklanan. Sonuç olarak, yüksek spektral çözünürlükte ve ücretsiz spektral aralığında düşünün bir ticaret-off olacak. En biyomalzemeler az 10 GHz Brillouin vardiya beri bu protokol 20 GHz ücretsiz spektral aralık yeşil (532 nm) lazer işlemi için önerilmektedir. Stokes ve anti-Stokes frekans yarım FSR spektrumunda başka ad görünür daha büyük vardiya çünkü FSR'nin sadece yarısı Brillouin analizi için kullanılabilir.
Zorluklar Brillouin sinyalini gözlemleyerek tespit edilmesi hâlinde, bu konuların, ya da Brillouin fotonların düşük sayıda kaçak ışık aşırı miktarda ilişkili olup olmadığını tanımak önemlidir. Aşırı sokak light etkili bir şekilde ortadan kaldırılmalıdır. Kara kutu muhafaza ışık geçirmez olduğundan emin olun. Numune olmadan, oda ışıkları açma ya da lazer kapatma anlamlı EMCCD kamera arka plan foton sayısını değiştirmeniz gerekir. Hafif, lazer ışık numunenin yüzeyinden yansıyan ortadan kaldırmak örneği eğin ve sinyal bloke etmeden mekansal maskeleri ile gözlem mümkün olduğunca kapalı başlatmak için. Bu iki prosedür bir çok loş Brilluoin sinyalinin gözlem izin entegrasyon süresini artırarak sağlayacaktır. Hala hiçbir sinyal yok ise, Brillouin sinyal çok zayıf olması muhtemeldir. Böyle Metanol gibi güçlü Brilluoin sinyali ile farklı bir örneği kullanmak veya konfokal mikroskop toplama optik hizasını kontrol edin. Başarılı bir sinyalin gözlemlenmesi sonra, protokol açıklanan adımı 5.4 izleyerek daha da optimize.
Emilim veya saçılma nedeniyle gelen ışığın Kaybı edinimi süresi r artacakNumune analizi için equired. Bunun bir sonucu olarak, en iyi sonuçlar genellikle saydam ya da ince malzemelerin elde edilmektedir. İyi hizalanmış spektrometre sıvı malzeme veya şeffaf plastik örnekleri için yüksek bir foton örneğinin ışığın 5 mW ile sayımı (zirvesinde> 1000) ve entegrasyon süresi 100ms almak mümkün olmalıdır. Bu geleneksel tarama spektrometre çok daha hızlı olduğunu. Nedeniyle, düşük toplama süresi ve aydınlatma gücü, böyle bir spektrometre, in vivo görüntüleme -makina 3,10,11,12 için Brillouin spektroskopisi kullanılarak sağladı. Spektrometre bu türünü kullanarak, çeşitli gruplar gibi omurilik sıvısı 4 bakteriyel menenjit tespit, göz merceğinin 13 reolojik özelliklerinin ölçülmesi ve kornea elastik modülü 14 analiz olarak çeşitli uygulamalar göstermiştir.
Spektrometresi daha da geliştirilmesi, yakın gelecekte beklenen özellikle düşük kayıp ultra dar bant halindegeçmek ve / veya çentik filtresi VIPA spektral dağılım üzerinde nesli gereksinimlerini dinlenmek için dahil edilebilir. Spektrometresi örneğin konfokal mikroskobu 3,4,5, endoskoplar standart optik prob çeşitli ile kombinasyon halinde kullanılabilir, ve yarık lamba oftalmoskobun edilebildiğinden, VIPA spektrometresi birçok biyomedikal uygulamalarda enstrümantal bileşeni olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OPTICS | |||
| VIPA (virtual image phase array) | LIGH MACHINERY | Quantity: 2 | |
| Bundle of Three 423 Linear Stages with SM-25 Micrometers | NEWPORT | 423-MIC | Quantity: 1 |
| SS Crossed-Roller Bearing Translation Stage, 0.5 in., 8-32, 1/4-20 | NEWPORT | 9066-X | Quantity: 1 |
| Vernier Micrometer, 13 mm Travel, 9 lb Load Capacity, 50.8 TPI | NEWPORT | SM-13 | Quantity: 1 |
| Adjustable Width Slit | NEWPORT | SV-0.5 | Quantity: 2 |
| Compact Dovetail Linear Stage, 0.20 in. Z Travel, 1.57x1.57x1.38 in. | NEWPORT | DS40-Z | Quantity: 2 |
| Slotted Base Plate, 25 or 40 mm to 65 mm Stage, 1.1 in. Range | NEWPORT | B-2B | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Optical Post, 8-32 Setscrew, 1/4"-20 Tap, L = 2", 5 Pack | THORLABS | TR2-P5 | Quantity: 2 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrews, L = 2", 5 Pack | THORLABS | PH2-P5 | Quantity: 1 |
| Ø1/2" Post Holders, Spring-Loaded Hex-Locking Thumbscrew, L = 3", 5 Pack | THORLABS | PH3-P5 | Quantity: 1 |
| Imperial Lens Mount For 2" Optics, 8-32 Tap | THORLABS | LMR2 | Quantity: 2 |
| f=200.0 mm, Ø2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm | THORLABS | AC254-200-A | Quantity: 2 |
| Kinematic Mount for up to 1.3" (33 mm) Tall Rectangular Optics, Right Handed | THORLABS | KM100C | Quantity: 2 |
| Fixed Cylindrical Lens Mount, Max Optic Height: 1.60" (40.6 mm) | THORLABS | CH1A | Quantity: 2 |
| f=200.00 mm, H=30.00 mm, L=32.0 mm, N-BK7 Plano-Convex Cylindrical Lens, Antireflection Coating: 350-700 nm | THORLABS | L1653L1-A | Quantity: 2 |
| Right-Angle Post Clamp, Fixed 90° Adapter | THORLABS | RA90 | Quantity: 1 |
| Adapter with External C-Mount Threads and Internal SM1 Threads | THORLABS | SM1A9 | Quantity: 1 |
| Studded Pedestal Base Adapter, 1/4"-20 Thread | THORLABS | PB4 | Quantity: 2 |
| Spacer, 2" x 3", 1.000" Thick | THORLABS | Ba2S7 | Quantity: 2 |
| 543 nm, f=15.01 mm, NA=0.17 FC/APC Fiber Collimation Pkg. | THORLABS | F260APC-A | Quantity: 1 |
| SM1-Threaded Adapter for Ø11 mm collimators | THORLABS | Ad11F | Quantity: 1 |
| Translating Lens Mount for Ø1" Optics, 1 Retaining Ring Included | THORLABS | LM1XY | Quantity: 1 |
| Single Mode Patch Cable, 450 - 600 nm, FC/APC, 2 m Long | THORLABS | P3-460B-FC-2 | Quantity: 1 |
| 1:1 Matched Achr. Pair, f1=30 mm, f2=30 mm, BBAR 400-700 nm | THORLABS | MAP103030-A | Quantity: 1 |
| SM1 Lens Tube…length to adjust depend on CCD, we have 3.5 inches | THORLABS | SM1LXX | Quantity: 1 |
| Base Adapters for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | BE1 | Quantity: 8 |
| Clamping Forks for Ø1/2" Post Holders and Ø1" Posts | THORLABS | CF125 | Quantity: 8 |
| HW-KIT5 - 4-40 Cap Screw and Hardware Kit for Mini-Series | THORLABS | HW-KIT5 | Quantity: 1 |
| D20S - Standard Iris, Ø20.0 mm Max Aperture | THORLABS | D20S | Quantity: 2 |
| FOR ENCLOSURE | |||
| 25 mm Construction Rail, L = 21" | THORLABS | XE25L21 | Quantity: 6 |
| 1" Construction Cube with Three 1/4" (M6) Counterbored Holes | THORLABS | RM1G | Quantity: 8 |
| Right-Angle Bracket for 25 mm Rails | THORLABS | XE25A90 | Quantity: 12 |
| 25 mm Construction Rail, L = 15" | THORLABS | XE25L15 | Quantity: 4 |
| 25 mm Construction Rail, L = 9" | THORLABS | XE25L09 | Quantity: 8 |
| High Performance Black Masking Tape, 2" x 60 yds. (50 mm x 55 m) Roll | THORLABS | T743-2.0 | Quantity: 1 |
| Low-Profile T-Nut, 1/4"-20 Tapped Hole, Qty: 10 | THORLABS | XE25T3 | Quantity: 1 |
| 1/4"-20 Low-Profile Channel Screws (100 Screws/Box) | THORLABS | SH25LP38 | Quantity: 1 |
| 60" (W) x 3 yds. (L) x 0.005" (T) (1.5 m x 2.7 m x 0.12 mm) Blackout Fabric | THORLABS | BK5 | Quantity: 1 |
| CAMERA, LASER and MICROSCOPE | |||
| EMCCD camera | ANDOR | iXon Ultra 897 | Quantity: 1 |
| 400 mW single mode green laser | LASER QUANTUM | torus 532 | Quantity: 1 |
| Research Inverted System Microscope | OLYMPUS | IX71 | Quantity: 1 |
References
- Brillouin, L. Diffusion de la lumiere et des rayonnes X par un corps transparent homogene; influence del'agitation thermique. Ann. Phys. (Paris) . 17, 88-122 (1922).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. Multistage VIPA etalons for high-extinction parallel Brillouin spectroscopy. Opt. Exp. 19 (11), 10913-10922 (2011).
- Scarcelli, G. Confocal Brillouin microscopy for three-dimensional mechanical imaging. Nat. Phot. 2 (1), 39-43 (2008).
- Nichols, A. J., Evans, C. L. Video-rate Scanning Confocal Microscopy and Microendoscopy. J. Vis. Exp. (56), e3252 (2011).
- Steelman, Z., Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. V. Brillouin spectroscopy as a new method of screening for increased CSF total protein during bacterial meningitis. J. Biophoton. 8 (5), 1-7 (2014).
- Koski, K. J., Yarger, J. L. Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 87 (6), 061903 (2005).
- Faris, G. W., Jusinski, L. E., Hickman, A. P. High-resolution stimulated Brillouin gain spectroscopy in glasses and crystals. J. Opt. Soc. Am. B. 10 (4), 587-599 (1993).
- Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt. Exp. 20 (8), 9197-9202 (2012).
- Scarcelli, G., Besner, S., Pineda, R., Kalout, P., Yun, S. H. In Vivo Biomechanical Mapping of Normal and Keratoconus Corneas. Jama Ophtalmol. , (2015).
- Scarcelli, G., Kim, P., Yun, S. H. In Vivo Measurement of Age-Related Stiffening in the Crystalline Lens by Brillouin Optical Microscopy. Biophys. J. 101 (6), 1539-1545 (2011).
- Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl. Phys. Lett. 103 (22), 221105 (2013).
- Meng, Z., Traverso, A. J., Yakovlev, V. Background clean-up in Brillouin microspectroscopy of scattering medium. Opt. Exp. 22 (5), 5410-5415 (2014).
- Reiss, S., Burau, G., Stachs, O., Guthoff, R., Stolz, H. Spatially resolved Brillouin spectroscopy to determine the rheological properties of the eye lens. Biomed. Opt. Exp. 2 (8), 2144-2159 (2011).
- Scarcelli, G., Kling, S., Quijano, E., Pineda, R., Marcos, S., Yun, S. H. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
