Abstract
التقاط كميا العمليات التنموية أمر بالغ الأهمية لاستخلاص النماذج الميكانيكية والمفتاح لتحديد ووصف الظواهر متحولة. هنا يتم عرض بروتوكولات لإعداد الأجنة وC. الكبار ايليجانس الحيوانات لقصيرة وطويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهر وطرق تتبع وتقدير من العمليات التنموية. الأساليب المقدمة تستند فقط على C. سلالات ايليجانس المتاحة من مركز علم الوراثة انواع معينة وعلى البرمجيات مفتوحة المصدر التي يمكن تنفيذها بسهولة في أي مختبر مستقل عن نظام المجهر المستخدمة. A إعادة بناء نموذج 3D خلية الشكل باستخدام IMOD نماذج البرمجيات، وتتبع اليدوي الهياكل التحت خلوية fluorescently المسمى باستخدام متعددة الأغراض برنامج تحليل الصور Endrov، وتحليل تدفق مقلص القشرية باستخدام PIVlab (حل الزمن الرقمي الجسيمات صورة Velocimetry وأظهرت أداة لMATLAB). تم مناقشته كيف يمكن أيضا أن يتم نشر هذه الأساليب رس التقاط كميا العمليات التنموية الأخرى في نماذج مختلفة، على سبيل المثال، تتبع الخلايا والنسب تتبع، تتبع تدفق الحويصلة.
Introduction
مع التحسن المطرد من البروتينات الفلورية، والهندسة الجينية، المجهر الضوئي، والبرنامج التشغيلى الكمبيوتر والأجهزة، أصبح من الممكن الآن لتسجيل تطوير العديد من الكائنات النموذجية في القرار المكانية والزمانية لم يسبق له مثيل. هذا يسمح للباحثين لطرح الأسئلة التي لا يمكن معالجتها سابقا أو لإعادة النظر في العمليات التنموية المعروفة من أجل البحث عن الجوانب تجاهلها. وأثار هذا التقدم في مجال البيولوجيا التطورية الكمي، الذي يهدف إلى تحويل، ونماذج رسمية النوعية في النماذج الكمية التي كتبها قياسات دقيقة والتحليلات الإحصائية.
جعلت خلايا تتبع والهياكل التحت خلوية من الممكن استخلاص النماذج الكمية من التطور الجنيني، نشاط الجهاز العصبي، أو انقسام الخلايا 12/01. من خلال تتبع بقايا انقسام الخلايا خلال التنمية في وقت مبكر من C. ايليجانس الجنين، يمكن أن تكشف مؤخرا أنها تتبع جهاز ستيريوعوامل كتبته مسار ويشكل الاستقطاب المهم 13،14.
هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تجعل النهج البيولوجيا التطورية الكمي للوصول لغير الخبراء. التركيز يكمن في ثلاث على التوالي إلى الأمام، والأدوات المتاحة بحرية التي يمكن أن تنفذها في أي مختبر لديه حق الوصول إلى معيار المجهري متحد البؤر وأجهزة الكمبيوتر. وتشمل هذه بروتوكول لتوليد الأشكال خلية 3D، وبروتوكول لتعقب فلول انقسام الخلايا، وبروتوكول لوصف كميا ديناميات أكتوميوزين القشرية. الديدان الخيطية C. يستخدم ايليجانس كحالة نموذجية، ومع ذلك، فإن أساليب وأدوات مناقشتها هنا هي مناسبة لمجموعة متنوعة من الأسئلة في النماذج البيولوجية الأخرى، على سبيل المثال، الخلايا المستزرعة، إإكسبلنتس الأنسجة، organoids أو الكروية والأجنة الأخرى، الخ
عموما، بعض التحليلات هو موضح هنا يمكن أيضا أن يؤديها مع شعبية مفتوحة المصدر أداة يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.أتش تي أم أل. أو في فيجي، "وشملت بطاريات" إصدار يماغيج، http://fiji.sc/Fiji) التي هي العديد من الإضافات للالتحليلات الكمية المختلفة المتاحة. ومع ذلك، فإن برامج مناقشتها هنا مصممة لمعالجة مشاكل محددة.
أولا، IMOD، ومعالجة الصور، والنمذجة وعرض جناح يمكن استخدامها لإعادة بناء 3D من مسلسل أقسام من الإلكترون المجهري أو ضوء 15. كما يحتوي IMOD أدوات للعرض البيانات 3D من أي اتجاه. ثانيا، Endrov، وهو برنامج جافا المصممة لإجراء تحليل الصورة، ومعالجة البيانات، والشرح الشبكات أو المسارات (وغيرهم) على أساس العمارة المساعد طويلة، مع يماغيج المساعد التوافق 16. أنه يحتوي على أكثر من 140 عمليات لمعالجة الصور واجهة المستخدم الموسعة التي يتم فيها عرض النماذج والبيانات الخام على حدة. ويمكن الاطلاع على شفرة المصدر في https://github.com/mahogny/Endrov. ثالثا، PIVlab، وMأداة ATLAB عن الجسيمات الصور الرقمية velocimetry التي تسمح للمستخدم لكميا ونوعيا تحليل حقول تدفق الجسيمات 17. استخدام هذه البرامج يتطلب ترخيص MATLAB الذي يتضمن أدوات معالجة الصور (http://mathworks.com). PIVlab هو برنامج مصمم لوصف تدفق كميا. وتحسب توزيع سرعة وحجم، الدردورية، الاختلاف، أو القص ضمن أزواج صورة أو سلسلة. لهذا، فإنه عبر يرتبط مناطق صغيرة من الصور (وتسمى 'يمر' في قسم البروتوكول) من الزوج الصورة لاشتقاق النزوح الجسيمات الأكثر احتمالا. هذا الارتباط عبر ينتج مصفوفة الارتباط التي يمكن تحليلها في مجال الفضاء أو التردد باستخدام إما مباشرة عبر ارتباط أو تحول فورييه السريع (الاتحاد الفرنسي للتنس)، على التوالي.
المعدات المستخدمة هنا هي مجهر مقلوب مجهزة نيبكو ('الغزل') القرص، وهو EMCCD، 488 و 561 نانومتر solid- القياسيةليزر الدولة، و20x والهواء أو 40X 60X أو خطة / امزيغ أهداف بالنفط أو الغمر بالمياه. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا أن أداء الوقت الفاصل بين التصوير مع طرائق التصوير الأخرى، على سبيل المثال، راهنا، line- أو القائم على الليزر المجهر رقة المسح الضوئي، متعدد الفوتون المجهري، وكذلك برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر جنبا إلى جنب مع deconvolution أو منظم إضاءة. وميزة استخدام نظام القرص نيبكو هي الحصول على الصور سريع للغاية، وخاصة إذا وضع تدفق (حركة مستمرة والمسح الضوئي للجسم في البعد ض) هو متاح. بالإضافة إلى ذلك، لتحسين القرار، مكبرة الموسع 1.5 أضعاف أمام EMCCD يمكن استخدامها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد C. ايليجانس الأجنة عن الوقت الفاصل بين المجهري باستخدام بلي
- نقل الديدان البالغة حامل باستخدام معول دودة (سلك البلاتين) إلى قطرة من العازلة M9 وتنظيف قبالة البكتيريا عن طريق أولا تهييج بقوة ومن ثم نقل كل الدودة إلى انخفاض المجاور M9 باستخدام السوط العين التي شنت على اختيار الأسنان / ماصة أو استخدام الزجاج الشعرية أشار.
- تمييع تشتت تحتوي على 20 ميكرومتر الخرز قطر البوليسترين 10 أضعاف في M9 العازلة (يحتوي على 1 L M9 عازلة 3 ز KH 2 PO 4 و 6 ز نا 2 هبو 4، 5 غرام كلوريد الصوديوم، وبعد التعقيم (20 دقيقة، 120 ° C)، إضافة 1 مل إضافية من 1 M MgSO 4 الحل).
- جعل ماصة الفم من أي نوع من أنواع رقيقة الزجاج الشعرية (على سبيل المثال، وذوبان نقطة أو الشعيرات الدموية الشعيرات الدموية تستخدم لسحب إبر الحقن)، وقطعة تقريبا 0.5 مترا من المطاط، سيليكون أو مواد مماثلة أنابيب (شفاف المثالية)، 200 ميكرولترغيض ماصة، وغطاء من 200 ميكرولتر PCR أنبوب، مرشح مسعور والمحاقن الصغيرة (على سبيل المثال، وهو ،2-،45 ميكرون حجم المسام و15-50 مم نايلون، PTFE أو تصفية المواد مماثلة)، وماصة 1000 ميكرولتر طرف . هذا النوع من الفم ماصة يضمن أن أي مادة بيولوجية يمكن الحصول على اتصال مع المجرب.
- تجميع ماصة عن طريق إدخال 200 ميكرولتر ماصة مع طرف لأول مرة في الأنابيب وتوصيله مع غطاء أنبوب PCR التي لديها ثقب المركزي الذي يطابق قطر الشعرية المستخدمة. وأشار جدا إبرة المخرز أو إعداد يمكن استخدامها لتوليد ثقب.
- رسم الشعرية رقيقة وأدخله في ثقب. إدراج مرشح في الطرف الآخر من الأنبوب وإدراج ماصة 1000 ميكرولتر كقطعة الفم (الشكل 1).
- تشريح البالغين حامل عن طريق قطع الديدان بشكل مستعرض في الفرج بشفرة حلاقة نظيفة أو مشرط.
ملاحظة: عادة، فإن العديد من الأجنة يكون هxpulsed بعد القطع. ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة الأجنة في وقت مبكر، في بعض الأحيان أن يتم الافراج عن الذبيحة باستخدام السوط العين أو إبرة مدببة. - ماصة قطرة واحدة من المخفف البوليسترين حبة التشتت (~ 4 ميكرولتر) في الصعود إلى 24x60 مم الغطاء الزجاجي ونقل الأجنة إلى هذا الانخفاض باستخدام ماصة الفم.
- وضع بعناية صغيرة (على سبيل المثال، 18x18 أو 20X20 مم) تغطية الزجاج على رأس قطرة والتأكد من انخفاض انتشر بشكل كامل.
ملاحظة: يجب أيضا أن يكون قطرة صغيرة بما يكفي كي لا تلمس حواف غطاء زجاجي صغير. - ختم جبل مع الفازلين المسال. إضافة قطرة من زيت الغمر على 24x60 مم الغطاء الجانبي زلة، والشروع في قسم "الوقت الفاصل بين الميكروسكوب.
2. إعداد الكبار C. ايليجانس الحيوانات في الوقت الفاصل بين المجهري تستخدم Nanobeads
ملاحظة: بشكل عام، وبروتوكول لتركيب الحيوانات الكبار هو التكيف للبروتوكول من المرجع. 18.مع هذا البروتوكول، فمن الممكن أن تؤدي على المدى الطويل المجهري الوقت الفاصل بين متحد البؤر من الحيوانات البالغة.
- إعداد 1.5٪ (ث / ت) حل الاغاروز في المخزن M9، يغلي (1 دقيقة، و 100 درجة مئوية في حمام مائي أو الميكروويف). لا ينصح استخدام تركيزات أعلى من الاغاروز لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى قذف من الأمعاء و / أو أجزاء من الغدد التناسلية.
- عصا أسفل 2-3 طبقات من الشريط على شريحتين المجهر لكل منهما. ضع شريحة من دون الشريط بين الشرائح اثنين مع الشريط.
- استخدام غيض ماصة ووضع قطرة واحدة من الحل الاغاروز الساخن في وسط الشريحة المتوسطة. المكان بسرعة شريحة أخرى على تراجع بحيث كانت مدعومة من قبل الطبقات الشريط على كل جانب. هذا سيخلق جولة وسادة أجار شقة حوالي 10 مم.
- وضعت قطرة من 100 حل حبة نانومتر (غير مخفف، وهو 2.6٪ (ث / ت)) على لوحة. نقل 1-10 الديدان البالغة تنظيفها في الانخفاض مع اختيار دودة. ختم مع 18x18 مم الغطاء الزجاجي والفازلين كما هو موضح في بروتocol 1.
3. الوقت الفاصل بين المجهري
- وضع قطرة من زيت الغمر على شريحة المجهر أو شطيرة غطاء زجاجي. استخدام brightfield في التكبير المنخفض (5X 10X أو العدسات) لتحديد العينة.
ملاحظة: الحد من التعرض للضوء الأزرق قدر الإمكان (ولا سيما بالنسبة للC. ايليجانس الأجنة)، على سبيل المثال، لا تستخدم برنامج التحصين الموسع ومضان المجهري للعثور / تركيز العينة ولكن استخدام brightfield بدلا من ذلك. - تغيير إلى أعلى التكبير (40X 60X أو أهداف)، وجلب العينة إلى التركيز (أي طائرة المركزية أو أعلى / أسفل طائرات من العينة، وهذا يتوقف على اقتناء البرمجيات).
- تعيين فترات أخذ العينات إلى 30 طائرة في 1 ميكرون تباعد سجلت كل 1min. في حالة ومرحلة XYZ الآلي xy- أو متاحة، يمكن تسجيل النقاط متعددة في دورة واحدة. التحول إلى التصوير مضان والتحقق من التركيز مرة أخرى.
ملاحظة: في محاولة لتجنب استخدام الصلاحيات ليزر عالية، وليس استخدام مرات التعرض أطول قليلافي كثافات منخفضة جدا. تدبير الحصول على الصور على الفور، إما في البرنامج الحصول على الصور أو في يماغيج لتجنب التشبع، المحاصيل التي تتراوح ديناميات ويعني أيضا التعرض للإشعاع الزائد. - بدء تسجيل سلسلة مرور الزمن.
ملاحظة: لاستبعاد تحليل الأعمال الفنية، تبدأ طويلة فترات (3-10 دقيقة) الوقت بين المسح عينة وتزيد تدريجيا أخذ العينات الزمنية لفترات المطلوب. توقيت التنموي وكذلك نقطة نهاية في كلتا الحالتين يجب أن تكون مماثلة عند إجراء التحليل الإحصائي. وعلاوة على ذلك، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لتقييم معدلات الضيائية والبقاء على قيد الحياة. لذلك، واستعادة عينة من الجبل بعد على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهر وتحقق ما إذا كانت مواصلة تطوير / على الهواء مباشرة.
4. إعادة بناء نموذج 3D خلية الشكل مع IMOD
ملاحظة: البرنامج IMOD متاح من صفحة الويب IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. تثبيت البرنامج هو وصفد هناك. عند استخدام نظام التشغيل ويندوز، مجموعة أدوات يونكس لديها ليتم تثبيتها، والتي يمكن أيضا أن تكون موجودة كحزمة واحدة على صفحة ويب IMOD. وعلاوة على ذلك، هناك مقدمة 3dmod جمعت ممتاز متوفرة على صفحة ويب IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- فتح قذيفة يونكس واكتب في "IMOD". سيتم فتح نافذة IMOD. حدد الملف مع البيانات الخام (مثالي لمعرض طرابلس مكدسة أو ما شابه ذلك) يمكن من خلالها توليد نموذج 3D.
- تحديد الجزء السفلي والعلوي من الكائنات في إطار انطلق باستخدام إطار المعلومات (ارتفاعا وانخفاضا التمرير أداة).
- بدء تتبع الخطوط العريضة الخلية. الأهم من ذلك، تأكد من أن كل خلية كائن واحد. تبدأ الطائرة العليا من كل خلية وخلق كفاف الأول هناك باستخدام إطار المعلومات. انتقل لأسفل في Z، وخلق محيط جديد لكل ض الطائرة.
- نفعل نفس الشيء بالنسبة العديد من الخلايا حسب الحاجة إلى نموذج في 3D. لا تنسى أن إنشاء كائن جديد عند بدء مع خلية جديدة.
NOTE: هناك العديد من الطرق المختلفة للبحث عن المفقودين كفاف والعديد من الإضافات المفيدة. يرجى زيارة صفحة ويب IMOD والبرامج التعليمية عبر الإنترنت للحصول على التفاصيل. في حالة المعروضة هنا، وقد استخدم الإعداد الافتراضي. - فتح "نموذج عرض" نافذة لتفقد الأشياء وملامح بها.
- في "نموذج عرض" شريط الأدوات اختر "تحرير" - "الأجسام". سيتم فتح نافذة التحرير المعنيين.
- لنموذج الخلايا كما الأجسام الممتلئة والمغلقة، اختر "شبكة" ك "رسم نوع البيانات" و "تعبئة" بأنه "نمط رسم". انقر على "تشبك" في اختيار تمرير في الجهة اليسرى السفلي من الإطار. حدد الخيار "كاب" في الاختيار في أسفل اليمين. تحقق العديد من الأشياء عند الضرورة وانقر على زر "مش الكل". سيقوم البرنامج توليد الأجسام الصلبة من أكوام من معالم. وعامل أخذ العينات ض يمكن تعديلها عن طريق تغيير "Z-مقياس" في "عرض" النافذة.
- نقل / تدوير objec 3Dر ("تحرير" - "عرض") وحفظ لقطات أو الأفلام ("ملف" - "التقط المشاجرة باسم ..." أو "فيلم / مونتاج").
5. تتبع Fluorescently الهياكل إعتبر مع Endrov
ملاحظة: من أجل تعقب فلول انقسام الخلايا، واستخدام الضغط مع علامة غشاء النووية أو البلازما لتحديد الخلية (على سبيل المثال، H2B، PH-PLC-D1)، وانقسام الخلايا علامة المتبقية (على سبيل المثال، NMY-2، ZEN-4 ). علامة غشاء النووية أو البلازما هي مهمة لتحديد الخلية التي يرث بقية انقسام الخلايا.
- لتحميل سريع وسهولة الاستخدام، البيانات الخام لابد من تحويلها إلى ملف شجار (على سبيل المثال، في يماغيج). بعد ذلك، فتح Endrov وتحميل الملف ليتم تحليلها عن طريق اختيار "ملف تحميل" خيار من القائمة ملف. انقر على "المشاهد 2D" أيقونة على شريط الأدوات.
- ضبط الرسم البياني عن طريق النقر على أيقونة "مجموعة صالح" (رمز الأزرق في أسفل الزاوية اليمنىمن الشاشة Endrov). تعيين XYZ دقة عن طريق الذهاب إلى "بيانات" - "اسم الملف" - "Imageset" - "قناة" - "تعيين XYZ-القرار". اكتب في قيم X، Y، Z و، على سبيل المثال، 5، 5، 1 إذا كان X و Y القرار هو 0.2 ميكرون وتذوق كل 1 ميكرون في Z.
- ليحشي نوى، والانتقال إلى الطائرة من الفائدة وانقر على "المشاهد 2D". حدد "النسب" من القائمة المنسدلة واختيار "النسب جديد".
- بالنقر والسحب على النواة، فإنه يمكن أن تكون علامة. على سبيل المثال النواة، انقر بزر الماوس الأيمن واختر "إعادة تسمية الجسيمات" من القائمة المنسدلة. لزيادة أو إنقاص قطر الدائرة، اسحب رمز السهم الذي يظهر على يسار دائرة ملحوظة. بمناسبة الطائرة المركزية للنواة، انقر على أيقونة الصحيح. عند استخدام علامة غشاء البلازما، يمكن استخلاص كرة كبيرة من شأنها أن تغطي معظم الخلية.
- المضي قدما في الوقت المناسب والطائرة، واختيار "الإطار" و "Z"الخيارات في شريط الأدوات السفلي. بعد الذهاب إلى نقطة زمنية المقبلة، وضبط الموقف أو حجم الدائرة الذي يمثل نواة وفقا لذلك. كرر هذا حتى تنقسم فيها الخلية تتبعها.
- عندما يكون هناك انقسام الخلايا، بمناسبة نوى ابنة والتحول إلى "المشاهد النسب". هذا يمكن اختيارها من قبل النقر على أيقونة "ويندوز" على شريط الأدوات العلوي. علامة كل نواة ثلاثة في وقت واحد، انتقل إلى "النسب" خيار في شريط الأدوات العلوي وحدد "الأم مشارك".
- عندما يتم الانتهاء من تتبع الخلية، والتحول إلى القناة بمناسبة بقايا انقسام الخلايا لتتبع. للتبديل القنوات، انقر على اسم الملف على الركن الأيسر السفلي من شريط الأدوات. يمكن تتبع بقية انقسام الخلايا (أو أي بنية أخرى) كما هو موضح أعلاه لنواة.
- عند عودته إلى البرنامج بعد إغلاق، فمن الضروري أن تذهب إلى "2D عارض" - "النسب" - "تحرير" والنقر على رقم النسب التي سيتم تحريرها.
6. تحليل القشرية أكتوميوزين تدفق مع PIVlab
ملاحظة: PIVlab هو البرمجيات المتاحة بحرية من: http://pivlab.blogspot.de/. يمكن استدعاؤها من داخل ماتلاب بيئة سطر الأوامر بكتابة PIVlab_GUI. عند العمل مع PIVlab، فمن المستحسن لانقاذ سلسلة صورة في مجلد منفصل.
- بدء دورة جديدة من "القائمة ملف". تحميل ملفات الصور من خلال النقر على "تحميل الصور" الزر.
- حدد نمط التسلسل 1-2، 2-3، ... وانتقل إلى الدليل الذي يحتوي على سلسلة من الصور المطلوبة. حدد الصور وانقر على زر "إضافة" والاستيراد.
- انتقل إلى "إعدادات تحليلات" وحدد "الاستثناءات (ROI، قناع)". بدلا من ذلك، اضغط على "السيطرة + E". استخدم زر "رسم قناع ل الإطار الحالي" لتعطيل الجزء غير مرغوب فيه من الصورة / الصورة (أي منطقة خارج الجنين).
- حدد "إعدادات التعريف الشخصي" الابOM قائمة "إعدادات تحليلات". بدلا من ذلك، اضغط على "السيطرة + S". اختيار "الاتحاد الفرنسي للتنس نافذة تشوه" كما الخوارزمية التعريف الشخصي المطلوب.
ملاحظة: وجبات سريعة التحول فورييه (الاتحاد الفرنسي للتنس) يقلل من تكلفة الحسابية ولكن ينصح فقط إشارة فوق ضجيج بشكل جيد وإذا تشريد الجزيئات درس لا يتجاوز نصف مساحة تمريرة تحليلها (انظر 6.5). - أدخل القيم التالية للممرات الثلاثة، التي هي مجال التحقيق لكثافة عبر الارتباط بين الصور التالية: تمرير 1: الاستجواب مساحة 64 بكسل مع خطوة 32. ممر 2: الاستجواب مساحة 32 بكسل مع خطوة من 16 اختر "خطية" من تشوه نافذة القائمة المنسدلة. اختيار طريقة جاوس 2 * 3 نقاط لالفرعي بكسل تقدير النزوح.
- حدد "تحليل"! من القائمة تحليل واستخدام زر "تحليل جميع الأطر" لبدء تحليل.
- لمرحلة ما بعد المعالجة حدد "التحقق من صحة ناقلات" من "؛ مرحلة ما بعد المعالجة "القائمة وتعيين عتبة تصفية الانحراف المعياري (STDEV) إلى 7 وتنطبق على جميع الأطر.
- اختيار "اشتقاق المعلمات / تعديل البيانات" من القائمة "مؤامرة". حدد "ناقلات [بكسل / الإطار]" من القائمة المنسدلة. ضبط نعومة النواقل وارتفاع تمرير مرشح وتنطبق على جميع الأطر.
- لحساب ناقلات يعني من جميع الأطر، تعيين "إطارات مستعملة" ل1: نهاية وانقر على زر "احسب ناقلات متوسط".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام بروتوكولات 2، 3، و 4، والتصوير الوقت الفاصل بين الغدد التناسلية في البرية من نوع C. ايليجانس يتم تنفيذ البالغين (سلالة OD58 (UNC-119 (ED3) الثالث؛ ltIs38 [pAA1؛ فطيرة-1 :: :: GFP PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)])، معربا عن علامة الغشاء من المروج سلالة الجرثومية ). التركيز على منعطف من الغدد التناسلية، يتم إنشاء نموذج 3D من الخلايا الجرثومية من البيانات المجهري (الشكل 2). هذا النموذج يسمح لتحليل التغيرات في حجم الخلية في حين عبور خلايا تشكل البعيدة إلى الذراع القريب، يكشف عن تنظيم فقري وحجم الاتصالات من الخلايا الفردية إلى فقري (انظر أيضا HTTP: //www.wormatlas. ORG / خنثى / الجرثومية٪ 20line / Germframeset.html).
وتستخدم القادمة والبروتوكولات 1 و 3 و 5 لأداء على المدى الطويل المجهري الوقت الفاصل بين C. ايليجانس الأجنة (CHP52 سلالة الذي هو خليط من سلالة RW10226 (UNC-119 (ED3) الثالث؛ itIs37 [فطيرة-1P :: :: mCherry H2B :: فطيرة-1 3'UTR + UNC-119 (+)]؛ stIs10226 [له-72 المروجHIS-24 :: mCherry الانصهار متعدية مع السماح-858 3 'UTR + UNC-119 (+)]) وLP162 سلالة (nmy 2 (cp13 [nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). في هذه السلالة، فمن الممكن أن يتبع كل من نوى (من خلال البروتينات الانصهار mCherry-هيستون) وبقايا انقسام الخلايا (من خلال تعديل genomically غير العضلات الميوسين II موضع حيث تم دمجها في GFP في إطار من خلال كريسبر / تكنولوجيا Cas9 19 ) وحات في وقت واحد عند استخدام اللونين الوقت الفاصل بين المجهري (الشكل 3، غادر). النماذج التي حصلت عليها lineaging كل الهياكل في Endrov تظهر نمط النمطية التي سبق وصفها من انقسام الخلايا الميراث بقايا 13،14. وعلاوة على ذلك، من البيانات lineaging، ومسارات لكل خلية وانقسام الخلايا بقايا (الشكل 3، لوحات اليمين) ووقت انقسام الخلايا استمرار بقايا (استنادا إلى GFP NMY-2 -signal) وكذلك ارتباط إلى الخلية ويمكن الحصول على توقيت التقسيم (<قوي الشكل 4>، كما هو موضح في النسب أبا فقط). عند استخدام علامة غشاء البلازما بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أيضا لمراقبة نقطة زمنية من انقسام الخلايا استيعاب بقايا.
وأخيرا، باستخدام بروتوكولات 1 و 3 و 6، على المدى القصير الوقت الفاصل بين المجهري لقرار زمنية عالية (فترات 5S بين تسجيل ض المكدس) من الميوسين القشرية غير عضلة-II (NMY-2 GFP) يتم تنفيذها. التركيز هنا يكمن في الاختلاف في ديناميكية تدفق استقطاب القشرية بمقارنة هذا التدفق بين نوع والأجنة رني المنضب لرو GTPase تفعيل البروتين RGA-3 20،21 البرية. على غرار الملاحظات الأخيرة 22، وتدفق في الأجنة نوع البرية هي في الغالب على طول المحور الطويل للجنين (الشكل 5، لوحات اليسار)، في حين تدفق في RGA-3 رني الجنين متعامد على هذا المحور. هذا واضح بسهولة من تتراكب نقاط زمنية متتالية أو من ANALYS التعريف الشخصيهو (الشكل 5، وحات أسفل).
مراعاة هذه الاختلافات، فمن المهم أن تختار فاصل أخذ العينات بحيث الجسيمات تدفق القشرية يمكن حلها بشكل لا لبس فيه عن تفسير دقيق للبيانات. ينصح فترات زمنية أصغر (≤5 ثانية) لتجنب النزوح الكبيرة وناقلات في عداد المفقودين. يجب أن يكون إطار التحقيق كبير بما يكفي لاستيعاب حجم الجزيئات ليتم تحليلها (حبيبات القشرية). التداخل بين النوافذ الاستجواب المجاورة يسمح للحد من التباعد النواقل وبالتالي يزيد عدد ناقلات في الشبكة.
الشكل 1. تجميع ماصة الفم اليسار: مطلوب قطع غيار لتجميع ماصة الفم مع مرشح. الصحيح: ماصة تجميعها من فضلكانقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم نموذج 2. 3D من المنطقة التناسلية بدوره أعلى اليسار: 3D الإسقاط من نقطة زمنية واحدة من البيانات المجهري الوقت الفاصل. أعلى الوسط واليمين: 3D نماذج من البيانات المجهري. أسفل: تفاصيل الاتصالات الخلوي فقري الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. تتبع من النوى وفلول انقسام الخلايا اليسار: توقعات 3D من البيانات المجهري الوقت الفاصل. الوسط: لقطات من طراز تم الحصول عليها من تتبع كل من نوى (المجالات ملونة) وبقايا انقسام الخلايا (المجالات الرمادية). الصحيح: لقطاتمن انقسام الخلايا تتبع بقايا. وترد أيضا مسارات للمخلفات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ويبين الشكل 4. خلية وانقسام الخلايا الأنساب بقايا لsublineage ابا. الأنساب من جنين تمثيلي. يتم وضع علامة الانقسامات الخلوية التي كتبها الساحات. كل علامة التجزئة يناظر 1 دقيقة. كان اسمه بقايا انقسام الخلايا بعد بنات التي تنشأ عن تقسيم خلالها يتم إنشاء بقية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. تحليل القشرية تدفق مقلص مع التعريف الشخصي الأعلى: اللقطات الإسقاط 3D من الوقت الفاصل بين المجهري التي تصور بداية (الصف الأول) ونهاية (الصف الثاني) من النافذة الزمنية المستخدمة لحساب الحقل متجه مع PIVlab. الصف الثالث من لوحات يظهر تراكب من كل نقطة زمنية من النافذة الوقت. أسفل: حقول المتجهات التي حصلت عليها PIVlab الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فيديو 1 - المتعلقة الشكل 2. نموذج A 3D المنطقة بدوره الغدد التناسلية يبدأ الفيديو مع التمرير من خلال كومة كاملة من الطائرات التي استخدمت لتقسيم الخلايا. بعد ذلك إسقاط الحد الأقصى 3D المكدس يظهر، تليها نموذج segementation 3D تدور حول x و y محاور (مع وبدون فقري والغدد التناسلية مجزأة و).
فيديو 2 - المتعلقة الشكل 3. تتبع من النوى وفلول انقسام الخلايا بقي من الزمن: توقعات 3D من البيانات المجهري الوقت الفاصل. الأوسط: نموذج تم الحصول عليها من تتبع كل من نوى (المجالات ملونة) وبقايا انقسام الخلايا (المجالات الرمادية). اليمين: بقايا الانقسام الخلوي ومساراتها. = شريط نطاق 10 ميكرون.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> فيديو 3 - المتعلقة الشكل 5. تحليل تدفق مقلص القشرية مع التعريف الشخصي الأقصى الإسقاط الوقت الفاصل بين التسجيلات 3D من نوع البرية تمثيلا وRGA-3 رني الجنين المستخدمة لحساب الحقل متجه مع PIVlab شريط مقياس. = 10 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من خلال تتبع الكائن في التنمية ولا سيما تتبع النووي، كان، فإنه من الممكن توضيح الآليات الزخرفة المركزية للC. ايليجانس مرحلة التطور الجنيني 1،23،24. توسيع هذه الاستراتيجية إلى ارتفاع الإنتاجية، فقد كان من الممكن مؤخرا للكشف عن قواعد الزخرفة إضافية واقتراح الأسلوب كيفية استخلاص قواعد الزخرفة دي نوفو 10. بالنسبة لكثير من المسوخ، ومع ذلك، فإن العيوب الزخرفة الدقيقة لا تزال غير معروفة. الأساليب المذكورة هنا هي الأدوات التي يمكن أن تكون مفيدة في توضيح لها. الأهم من ذلك، فقد أصبح واضحا في السنوات الأخيرة أنه على الرغم من العديد من أنظمة نموذجية أخرى لا تتبع تطور ثابتة مثل C. ايليجانس، تتبع الكائن وتحليل بيانات تتبع الكمي هو أداة حاسمة لتحديد الآليات وآليات المرض التنموية.
الأساليب المعروضة هنا هي خاصة مناسبة تماما في الحالة التي يكون فيها أنه سيكون إما جداتحديا لتنفيذ الحلول البرمجية أكثر تعقيدا و / أو المولدة ذاتيا، أو ببساطة مكلفة للغاية لتنفيذ أدوات البرمجيات التجارية، على التوالي. الأهم من ذلك أن أدوات مناقشتها هنا تمكن الباحث لتحميل وتحليل أي بيانات بشكل مستقل على أي أداة التي تم تسجيلها. وعلاوة على ذلك، إذا تم استخدام الملكية البرنامج الحصول على الصور، يقدم يماغيج البرنامج المساعد بيو تنسيقات التي يمكن تحميل البيانات في أشكال الملكية وحفظها في صيغ قياسية (JPEG، TIFF).
خطوة حاسمة في جميع البروتوكولات التي تعتمد على الوقت الفاصل بين المجهري هي اختيار شروط الحق في الحصول على النقيض من ذلك كافيا في صور المجهر، و، في نفس الوقت، للحد من التعرض للإشعاع لعينة. هذا يعتمد بشكل كبير على نوع الاداة المستخدمة ويوصى عموما لاستخدام تقنيات المسح الضوئي بسرعة مثل القرص الغزل أو واحد المجهري الإضاءة الطائرة. على وجه التحديد، لPIV ديناميات القشرية، الإصدارات القديمة من نقطة المسح الضوئيالمجاهر قد تكون بطيئة جدا للسماح التقاط إشارات القشرية في القرار والسرعة لإجراء تحليلات صالحة كافية. ولذلك دائما حاسم لتقييم بعناية التعرض للإشعاع واختبار صلاحية العينة. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من أن بروتوكولات مناقشتها هنا تستخدم micobeads إلى جبل الأجنة، فمن الممكن أيضا استخدام منصات الاغاروز، والتي تأخذ فقط قليلا من الوقت للتحضير لكنها أقل تكلفة ومع بعض الخبرة استنساخه على حد سواء. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الجمع بين وحة agarose وnanobeads هو الأسلوب متفوقة لتجميد طويل الأجل من الديدان البالغة لأنه يتجنب استخدام أي عامل شال، على سبيل المثال، الليفاميزول.
وتجدر الإشارة إلى أن أدوات مناقشتها هنا لها محدوديتها لأنها لم تقم بإجراء تحليل بيانات مؤتمتة بالكامل. ومع ذلك، لهياكل مثل بقايا انقسام الخلايا، وغالبا ما يكون تحديا لتحديد الواسمات الجزيئية التي ق فقطبأنواعها المختلفة هذا الهيكل، وهو أمر حاسم لتتبع موثوق بها. ولذلك فإن التحدي الرئيسي يكمن في المستقبل بما في ذلك ميزات مثل آلة التعلم والتكيف خوارزميات الكشف / تجزئة في سهل الاستخدام والبرمجيات مفتوحة الوصول التي نناقش هنا. بعض من هذه الميزات يمكن العثور عليها في وحدات برمجية أخرى، في برامج معينة يمكن أن تتعامل مع تتبع المتكررة على مدى فترات زمنية أطول، أو التي يمكن أن تقارن مجموعات كبيرة من البيانات تتبع (على سبيل المثال، StarryNite / AceTree 25 أو Nucleitracker4D 26، والتي صممت ل المسار نوى باستخدام البروتينات هيستون الانصهار أو مغزل 27، أو سيمي BioCell 28). قد تكون هذه الأدوات أكثر تعقيدا لتنفيذ عندما تهدف إلى تتبع هياكل أخرى من النوى. بغض النظر عن هيكل معين يجب أن تتبع، وهذه البرامج عادة ما تكون مفيدة جدا عندما سيتم تحليل كميات كبيرة من البيانات صورة. الأهم من ذلك، هناك توافق بين المذكور أعلاه مجمع نموذجي البرمجياتوفاق.
عند العمل مع أنظمة نموذجية أخرى (على سبيل المثال، ويطير الأجنة، الخلايا المستزرعة الثدييات، وما إلى ذلك)، والأساليب المقدمة هنا هي مناسبة تماما لتعقب الهياكل orthologous كما هو موضح أعلاه أيضا. الأهم من ذلك، بشكل مستقل عن النظام النموذجي قيد التحقيق، والهياكل التحت خلوية مختلفة، على سبيل المثال، centrosomes، الأنوية، المجهرية الدقيقة، الحويصلات، وما يمكن تعقبها بسهولة، إلا أن المعلمات اقتناء لا بد من تعديلها لضمان اسر كاملة من مسارات الكائن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
