Abstract
정량적으로 개발 프로세스를 캡처하는 것은 돌연변이의 표현형을 식별하고 설명하는 기계적인 모델과 키를 유도하는 것이 중요하다. 여기 프로토콜은 배아와 성인 C. 제조되게됩니다 엘레 장단기 시간 경과 현미경 동물과 발달 과정의 추적 및 정량 방법. 제시된 방법은 모든 C.에 기초 쉽게 사용되는 현미경 시스템의 독립적 실험실에서 구현 될 수 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터에서 사용할 수 있으며 오픈 소스 소프트웨어에 간스 균주. 모델링 소프트웨어 IMOD를 이용하여 3 차원 셀 형상 모델의 재구성, - 형광 표지 된 세포 내 구조물 다목적 이미지 분석 프로그램 Endrov 및 PIVlab를 사용하여 피질 수축 흐름 분석을 사용하여 수동으로 추적 (시분 디지털 입자 화상 유속계 MATLAB에 대한 도구) 표시됩니다. 그것은 T 이러한 방법도 배포 할 수있는 방법을 설명합니다O를 정량적으로 소포 흐름의 추적, 추적 다른 모델, 예를 들면, 세포 추적 및 계보의 다른 발달 과정을 캡처합니다.
Introduction
형광 단백질, 유전자 공학, 광학 현미경, 컴퓨터 소프트 및 하드웨어의 지속적인 개선과 함께, 그것은 전례가없는 시공간 해상도에서 많은 모델 생물의 개발을 기록 할 수있게되었습니다. 이 연구진은 이전에 해결 될 수없는 질문을하거나 간과 측면을 검색하기 위해 알려진 개발 프로세스를 재 방문 할 수 있습니다. 이 진행은 철저한 측정 및 통계 분석에 의해 정량적 모델로 질적, 비공식적 모델 변환을 목표로 양적 발달 생물학의 분야를 촉발했다.
트래킹 셀과 세포 내 구조는 배아 발달, 신경계 활성, 또는 세포 분열 1-12 정량적 모델을 도출하는 것이 가능했다. C의 초기 개발 과정에서 세포 분열의 잔재를 추적하여 엘레 배아, 우리는 그들이 스테레오를 따르는 것이 밝혀 최근 수경로를 입력하고 구성하는 중요한 편광는 13,14 요인.
여기에, 프로토콜은 양적 발달 생물학 비 전문가를위한 접근에 접근 할 것을되게됩니다. 초점은 표준 공 초점 현미경과 컴퓨터에 액세스 할 수있는 모든 실험실에서 구현 가능한 세 개의 직선 앞으로 자유롭게 사용할 수있는 도구에 놓여있다. 이들은 3D 셀 형상을 생성하는 프로토콜, 세포 분열 잔재를 추적 프로토콜 및 정량적 피질 액토 마이 오신 역학을 설명하는 프로토콜을 포함한다. 선충 C. 엘레가 실시 케이스로 사용하지만, 여기에 기술 된 방법과 도구 등 다른 생물학적 예를 들어 모델, 배양 세포, 조직 외식, organoids 또는 타원체, 다른 배아에 질문의 다양한 적합
일반적으로, 여기에 표시된 분석 중 일부는 (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index 인기있는 오픈 소스 도구 ImageJ에 수행 할 수 있습니다.HTML; 또는 피지, 다른 정량 분석을위한 많은 플러그인을 사용할 수있는 ImageJ에 버전, http://fiji.sc/Fiji을) '배터리 포함'. 그러나, 프로그램은 여기서 설명하는 특정 문제를 해결하기 위해 설계되었습니다.
우선, IMOD, 화상 처리는, 모델링 및 디스플레이 스위트 전자 또는 광학 현미경 (15)로부터 시리얼 섹션들의 3D 재구성을 위해 사용될 수있다. IMOD는 어떤 방향에서 3D 데이터를보기위한 도구가 포함되어 있습니다. 둘째, Endrov, ImageJ에 플러그인 호환성 16, 네트워크 또는 확장 플러그인 구조의 기초 (다른 사람들) 트랙의 이미지 분석, 데이터 처리, 및 주석을 수행하도록 설계된 자바 프로그램. 그것은 140 이미지 처리 작업과 모델 및 원시 데이터를 개별적으로 표시되는 확장 사용자 인터페이스가 포함되어 있습니다. 소스 코드는 https://github.com/mahogny/Endrov에서 찾을 수 있습니다. 셋째, PIVlab, M정량적 및 정 성적으로 입자 유동장 (17)을 분석 할 수 있도록 사용자를 디지털 입자 화상 속도계 애 트랩 용 도구. 이 프로그램의 사용은 처리 도구 상자 (http://mathworks.com) 이미지를 포함하는 MATLAB 라이센스가 필요합니다. PIVlab 정량적 흐름을 설명하기위한 프로그램이다. 이 이미지 쌍 또는 시리즈 내의 속도 분포, 크기, 소용돌이, 발산, 또는 전단을 계산합니다. 이를 위해 가장 가능성 입자 변위를 유도 이미지 쌍 (프로토콜 부분에서 소위 '패스') 이미지의 작은 영역을 상호 연관. 이 교차 상관은 직접적인 상호 상관 또는 각각 고속 푸리에 변환 (FFT)을 사용하여 공간 또는 주파수 영역에서 분석 될 수 상관 행렬을 산출한다.
여기에 사용 된 장비는 Nipkow ( '방사') 디스크, EMCCD, 488 및 561 nm의 표준 솔리드 구비 도립 현미경 인상태 레이저 및 석유 또는 물에 침수 목표 아포 크로 매트 20 배 공기 또는 40 배 또는 60 배 계획 /. 그러나, 다른 영상 방식으로 시간 경과 이미징을 수행하는 것이 가능하다, 예를 들면, 포인트 - 투, 라인 - 또는 컨벌루션 또는 구조화 결합 시트 주사 레이저 기반 현미경 멀티 광자 현미경뿐만 아니라, 에피 형광 현미경 조명. Nipkow 디스크 시스템을 사용하는 이점은 스트리밍 모드 (연속 이동 및 Z 차원 물체의 스캐닝)을 사용할 경우 특히, 매우 빠른 화상 취득한다. 또한 분해능을 향상시키기 위해, EMCCD 앞 1.5 배 확대 증량제를 사용할 수있다.
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Protocol
C. 1. 준비 엘레 배아는 시간 경과 현미경을위한 마이크로 비드를 사용하여
- M9 버퍼의 드롭에 웜 픽 (백금선)를 사용하여 임신하는 성인 웜을 전송하고 격렬하게 교반 한 다음 이쑤시개 / 피펫 팁 상에 장착 눈 래시를 사용 M9의 인접 드롭 각 웜 전사 제에 의해 박테리아를 닦아 또는 뾰족한 유리 모세관을 사용합니다.
- , HPO 4, 5g의 NaCl M9 버퍼 (1 L M9 버퍼 3g의 KH 2를 포함 PO 4, 6 g의 2- 나에 20 ㎛의 직경의 폴리스티렌 비드 10 배를 함유하는 분산액을 희석하고, 오토 클레이브 (20 분, 120 ℃ 이후 C)는,) 1 M 황산 용액의 추가 1 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 얇은 유리 모세관의 모든 유형에서 입으로 피펫을 확인합니다 (예를 들어, 포인트 모세 혈관이나 모세 혈관 주사 바늘을 당겨하는 데 사용 용융), 고무, 실리콘 또는 유사한 재료 튜브 (이상적으로 투명)의 약 0.5 m 길이의 조각, 200 μl를피펫 팁, 200 ㎕의 PCR 용 튜브의 뚜껑, 작은 주사기 소수성 필터 (예., 0.2에서 0.45 사이 μm의 공경 15-50mm 직경 나일론, PTFE 또는 유사한 물질 필터), 및 1,000 μL 피펫 팁 . 입 피펫이 유형의 생물학적 물질은 실험자에 접촉 얻을 수 없다는 것을 보장한다.
- 튜브 내로 제 팁 200 μL 피펫 팁을 삽입하여 피펫을 조립하여 사용 모세관의 직경과 일치 중심 천공을 가지고 PCR 튜브의 뚜껑을 끼우. 매우 지적 송곳 또는 제제 바늘 천공을 생성하기 위해 사용될 수있다.
- 얇은 모세관을 그리고 구멍에 삽입합니다. 튜브의 다른 쪽 끝으로 필터를 삽입하고 (그림 1) 입 조각으로 1000 μL 피펫 팁을 삽입합니다.
- 깨끗한 면도날이나 메스와 외음부에 가로 벌레를 절단하여 임신하는 성인을 해부하다.
참고 : 일반적으로, 많은 배아 전자됩니다절단 후 xpulsed. 초기 배아가 필요한 경우, 이들은 때때로 눈 래시 또는 뾰족한 바늘을 사용하여 도체로부터 방출되어야한다. - 입 피펫을 사용하여이 드롭으로 24x60 mm 커버 유리와 이식란 상에 희석 폴리스티렌 비드 분산 (~ 4 μL)의 피펫 한 방울.
- 조심스럽게 작은 (예를 들어, 18 × 18 또는 20 × 20 mm)를 배치 드롭 위에 유리를 커버하고 드롭이 완전히 퍼져 가지고 있는지 확인하십시오.
참고 : 드롭도 작은 커버 유리의 가장자리를 터치하는 것만으로는 충분하지 작아야한다. - 액화 바셀린으로 마운트를 밀봉. 24x60 mm 커버 슬립 측에 침지 기름 한 방울을 추가하고 '시간 경과 현미경'섹션을 진행합니다.
성인 C. 2. 준비 엘레 동물 시간 경과 현미경은 나노 비드를 사용하는
주 : 일반적으로, 성인 동물을 장착하기위한 프로토콜 (REF)에서 프로토콜의 적응이다. 18.이 프로토콜로, 그것은 성인 동물의 장기 경과 공 초점 현미경 검사를 수행 할 수있다.
- 1.5 %를 준비 M9 버퍼에 아가로 오스 솔루션 (/ V W), 종기 (1 분, 물 목욕이나 전자 레인지에서 100 ° C). 이 장 및 / 또는 생식선의 부품 압출로 이어질 수 있기 때문에 아가로 오스의 높은 농도의 사용은 권장되지 않습니다.
- 이 현미경 슬라이드 각에 테이프의 2 ~ 3 층을 스틱. 테이프로 두 슬라이드 사이의 테이프없이 슬라이드를 놓습니다.
- 피펫 팁을 사용하고 중간 슬라이드의 중심에서 뜨거운 아가로 오스 솔루션의 한 방울을 배치합니다. 이 양쪽에 테이프 층에 의해 지원 될 수 있도록 신속하게 드롭에 다른 슬라이드를 배치합니다. 이 약 10mm 직경의 원형과 평면 한천 패드를 작성합니다.
- 패드 상 (V) / W (2.6 %로 희석) 100 nm의 비드 용액 한 방울을 넣어. 웜 픽업과 드롭에 1-10 청소 성인 웜을 전송합니다. 보호 해주는에 설명 된대로 18 × 18 mm의 커버 유리와 바셀린과 인감ocol 1.
3. 시간 경과 현미경
- 현미경 슬라이드 또는 커버 유리 샌드위치에 침지 기름 방울을 넣어. 샘플을 찾기 위해 낮은 배율 (배 또는 10 배 렌즈)에서 시야를 사용합니다.
참고 : 예를 들어, (C를 배아 엘레 간스를 위해 특히) 가능한 한 푸른 빛에 노출을 제한 / 찾을 시편에 초점을 대신 시야를 사용하는 에피 형광 현미경을 사용하지 마십시오. - 높은 배율 (40 배 또는 60 배 목표)로 변경, (중앙 평면 또는 수집 소프트웨어에 따라 샘플의 위 / 아래 비행기를) 초점에 샘플을 가져.
- 1 μm의 간격 (30) 평면에 샘플링 간격을 설정마다 1 분을 기록했다. 자동화 xy- 또는 XYZ 스테이지를 사용할 경우, 다수의 반점은 한 세션에 기록 될 수있다. 형광 이미징로 전환하고 초점을 다시 확인합니다.
참고 : 약간 긴 노출 시간을 사용하지 않고, 높은 레이저 파워를 사용하지 않도록하십시오매우 낮은 강도에서. 측정은 역학 범위 작물 포화를 방지하기 위해 이미지 수집 프로그램 또는 ImageJ에에 하나, 바로 이미지를 획득하고 과도한 방사선 노출을 의미한다. - 시간 경과 시리즈를 녹음 시작합니다.
참고 : 아티팩트를 분석 제외 샘플 검사 사이의 길이 (3-10 분) 시간 간격으로 시작하여 점차적으로 원하는 간격에 시간 샘플링을 증가시킵니다. 통계 분석을 수행 할 때 두 경우 모두 발달 타이밍뿐만 아니라 엔드 포인트는 비슷해야합니다. 또한, 광독성 및 생존율을 평가하는 것이 필요하다. 따라서 장기적으로 시간 경과 현미경 후 마운트에서 표본을 복구하고 라이브 / 개발을 계속 여부를 확인합니다.
4. IMOD와 3D 셀 형상 모델을 재구성
참고 : http://bio3d.colorado.edu/imod/ : IMOD 소프트웨어가 IMOD 웹 페이지에서 사용할 수 있습니다. 소프트웨어의 설치는 설명이다이 d를. 윈도우 OS를 사용하는 경우, 유닉스 툴킷은 또한 IMOD 웹 페이지에 패키지로 찾을 수있는, 설치해야합니다. 또한, IMOD 웹 페이지 (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html)에 사용할 수있는 뛰어난 컴파일 3dmod 소개가있다.
- 유닉스 쉘을 열고 "IMOD"를 입력. IMOD 창이 열립니다. 3D 모델을 생성 할 수있는 원시 데이터 (이상적으로 적층 TIF 또는 이와 유사한 것)을 사용하여 파일을 선택합니다.
- 정보 창 (최대 및 스크롤 도구 아래)를 사용하여 ZAP 창에서 개체의 하단과 상단을 찾습니다.
- 세포 윤곽을 추적 시작합니다. 중요한 것은, 각 셀은 하나의 객체인지 확인하십시오. 각 셀의 상단면과 함께 시작 창 정보를 이용하여이 첫 번째 형상을 만든다. Z에서 아래로 스크롤하여 각 Z 평면을위한 새로운 윤곽을 만들 수 있습니다.
- 3 차원 모델링에 필요한만큼의 세포에 대해서도 똑같이. 새로운 세포로 시작할 때 새로운 객체를 생성하는 것을 잊지 마십시오.
엔OTE는 : 윤곽 추적 및 여러 유용한 플러그인을위한 여러 가지 방법이 있습니다. 자세한 내용은 IMOD 웹 페이지 및 온라인 자습서를 방문하십시오. 여기에 도시 한 경우, 기본 설정이 사용되었다. - 개체 및 윤곽을 검사 할 수있는 "모델보기"창을 엽니 다.
- "객체"- "모델보기"도구 모음에서 "편집"을 선택합니다. 각각의 편집 창이 열립니다.
- "데이터 형식을 그리기"와 "도면 스타일"로 "입력"으로 "메시"를 선택, 작성 및 폐쇄 개체로 세포를 모델링합니다. 창의 왼쪽에있는 스크롤 선택에서 "메싱"을 클릭합니다. 오른쪽 아래에있는 선택의 옵션 "모자"를 확인합니다. 필요한만큼 많은 개체를 확인하고 "모든 메쉬"을 클릭합니다. 이 프로그램은 윤곽의 스택에서 고체를 생성합니다. Z - 샘플링 인자는 "보기"창에서 "Z 스케일"을 변경하여 조정할 수있다.
- 이동 / 3D의 objec을 회전T ( "편집"- "보기") 및 스냅 샷 또는 동영상을 저장 ( "파일"- "스냅 티파니로 ..."또는 "영화 / 몽타주").
Endrov 5. 추적 형광 표지 된 구조
참고 : 셀 아이디 (예를 들어, H2B, PH-PLC-D1) 및 세포 분열 남은 마커 (예 : 대한 핵 또는 플라즈마 막 마커 변형을 사용하여, 세포 분열의 잔재를 추적하기 위해, NMY-2, 젠-4 ). 핵 또는 플라즈마 막 마커는 세포 분열의 남은 상속 세포 결정하는 것이 중요하다.
- 빠른 로딩 및 사용의 용이성을 위해, 원시 데이터 (ImageJ에에서, 예) TIFF 파일로 변환 할 수있다. 다음, 오픈 Endrov 및 파일을로드 파일 메뉴에서 "로드 파일"옵션을 선택하여 분석한다. 도구 모음에서 "2D 뷰어"아이콘을 클릭합니다.
- 오른쪽 아래 모서리에 ( "맞춤 범위"아이콘을 파란색 아이콘을 클릭하여 막대 그래프를 조정Endrov 화면). "파일 이름"- - "Imageset에"를 -에 "데이터"를 이동하여 XYZ 해상도를 설정합니다 "채널"- "XYZ 해상도를 설정합니다." X 및 Y 해상도가 0.2 μm의 경우 예를 들면 X, Y, Z와, 5, 5, 1의 값을 입력하고 Z. 모든 샘플 1 ㎛
- 핵 주석의 경우, 관심의 평면으로 이동 "2D 뷰어"을 클릭합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "리니지"를 선택하고 "새 계보"를 선택합니다.
- 클릭하고 핵에 드래그하여이를 표시 할 수 있습니다. 핵의 이름을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭 다운 메뉴에서 "입자 이름 바꾸기"를 선택합니다. 증가 또는 원의 직경을 감소하기 위해, 마크 원의 왼쪽에 표시되는 화살표 아이콘을 드래그합니다. 핵의 중심 평면을 표시하려면 오른쪽 아이콘을 클릭합니다. 세포막 마커를 사용하는 경우, 큰 구 셀의 대부분을 커버 할 것이다 그려있다.
- 시간과 평면으로 진행하려면, "프레임"과 "Z"를 선택하단 도구 모음에서 옵션을 설정합니다. 다음 시점에 가고 후 따라서 핵 마크 원의 위치 나 크기를 조정한다. 추적 세포가 분열 할 때까지이 과정을 반복합니다.
- 세포 분열이있을 때, 딸이 핵을 표시하고 "리니지 뷰어"로 전환합니다. 이것은 상단 도구 모음에서 "윈도우"아이콘을 클릭하여 선택할 수 있습니다. 마크 동시에 세 개의 핵, 상단 도구 모음에서 "리니지"옵션에 가서 "준 부모"를 선택합니다.
- 셀 추적이 완료되면, 트래킹 셀 분할 잔여 마킹 채널로 전환. 채널을 전환하려면 도구 모음의 왼쪽 하단에있는 파일 이름을 클릭합니다. 핵에 대해 전술 한 바와 같이 세포 분열의 찌꺼기 (또는 다른 구조)이 추적 될 수있다.
- "리니지"- - "편집"편집 될 혈통 번호를 클릭하여 종료 후 소프트웨어로 복귀 할 때, "2D 뷰어"로 이동하는 것이 필요하다.
6. PIVlab과 두피 액토 마이 오신 흐름 분석
참고 : PIVlab은에서 자유롭게 사용할 수있는 소프트웨어입니다 : http://pivlab.blogspot.de/은; 그것은 PIVlab_GUI을 입력하여 matlab에 명령 줄 환경 내에서 호출 할 수 있습니다. PIVlab 작업 할 때, 그것은 별도의 폴더에 이미지 시리즈를 저장하는 것이 좋습니다.
- "파일 메뉴"에서 새로운 세션을 시작합니다. "로드 이미지"버튼을 클릭하여 이미지 파일을로드합니다.
- , 시퀀싱 스타일 1-2, 2-3 ...를 선택하고 원하는 이미지의 순서를 포함하는 디렉토리로 이동합니다. 이미지를 선택하고 "추가"버튼을 가져 오기를 클릭합니다.
- "분석 설정"으로 이동하여 "제외 (투자 수익 (ROI), 마스크)"를 선택합니다. 또는 키를 눌러 "Ctrl 키 + E". 이미지 / S (배아 외부 즉, 영역)의 원치 않는 부분을 비활성화하려면 "현재 프레임에 대한 마스크 (들)을 그립니다"버튼을 사용합니다.
- "PIV 설정"을 선택 FR"분석 설정"메뉴를 OM. 또는 키를 눌러 "Ctrl + S를". 원하는 PIV 알고리즘으로 "FFT 윈도우 변형"을 선택합니다.
주 : 고속 푸리에 변환 (FFT)의 계산 비용을 줄일 수 있지만, 신호는 물론 잡음 위 연구 입자의 변위 (6.5 참조) 분석 반 패스 영역을 초과하지 않는 경우이다 권장 만한다. - 연속 된 이미지 사이의 강도 간 상관 관계에 대한 질문의 영역 세 가지 패스에 대해 다음 값을 입력 : 1 패스 : 심문을 64 픽셀의 영역을 32 패스 2 단계 : 심문 32 픽셀의 영역을 16 단계 . 드롭 다운 메뉴 창 변형에서 "선"을 선택합니다. 서브 픽셀 변위 추정 가우스 2 * 3 점법을 선택한다.
- 선택 "분석!" 분석 메뉴와 버튼을 사용에서 분석을 시작하기 위해 "모든 프레임을 분석".
- 후 처리를 들어 ""벡터 유효성 검사 "를 선택, 후 처리 "메뉴 7 표준 편차 (표준 편차) 필터 임계 값을 설정하고 모든 프레임에 적용됩니다.
- "플롯"메뉴에서 "데이터를 수정 / 매개 변수를 유도"를 선택합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "벡터 [PX / 프레임]"를 선택합니다. 벡터와 하이 패스 필터의 부드러움을 조정하고 모든 프레임에 적용됩니다.
- 모든 프레임의 평균 벡터를 계산 1 "중고 프레임"으로 설정하려면 다음 말을하고 "평균 벡터를 계산"버튼을 클릭합니다.
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Representative Results
프로토콜 2, 3, 4, 야생형 C. 생식선에서의 시간 경과 이미징을 사용하여 엘레 성인이 수행 (변형 OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1, 파이-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + UNC-119 (+)), 생식 세포 프로모터에서 막 마커를 발현하는 ). 생식선의 회전을 중심으로, 생식 세포의 3D 모델은 현미경 데이터 (그림 2)에서 생성됩니다. 이 모델은, 세포의 통과는 기단 아암 선단을 형성하는 동안 셀 크기의 변화를 분석 할 수 우축의 조직 및 우축 개별 세포의 접점의 크기를 보여준다 (도 HTTP 참조 : //www.wormatlas한다. 조직 / 자웅 동체 / 세균 % 20line / Germframeset.html).
다음으로, 프로토콜 1, 3, 5 C. 장기간 경과 현미경을 수행하는 데 사용되는 itIs37 [파이-1P :: mCherry :: H2B :: 파이-1 3'UTR + UNC-119 (+)]; stIs10226 (UNC-119 (ED3) III 변형 RW10226의 크로스 elegans의 배아 (변형 CHP52 [그의-72 프로모터그의-24 :: mCherry 번역 융합 할 수-858 3 'UTR + UNC-119 (+)]) 및 변형 LP162 (nmy-2 (CP13 [nmy-2 :: GFP +에 loxP]) I.를). 이 변형에서, GFP가 CRISPR를 통해 프레임에 통합 된 genomically 수정이 아닌 근육 마이 오신 II 궤적 / Cas9 기술 (19)를 통해 모두 (mCherry-히스톤 융합 단백질을 통해) 핵 및 세포 분열의 잔재를 (따라 할 수있다 ) 두 색 시간 경과 현미경 (그림 3을 사용하는 경우 동시에, 왼쪽 패널). Endrov 모두 구조로 lineaging 의해 얻어진 모델은 세포 분열의 찌꺼기 상속 13,14 전술 상동를 나타낸다. 또한, lineaging 데이터, 각 셀 및 셀 분할 잔여 (도 3, 오른쪽 패널) 및 세포 분열 잔여 지속 시간을위한 트랙에서뿐만 아니라 셀에 상관 (NMY -2- GFP -Signal 기준) 분할 타이밍 <(얻을 수있다ABA의 혈통 만 해당)에 대해 도시 strong>을 그림 4. 또한 세포막 마커를 사용할 때, 세포 분열의 찌꺼기 내재화 시점을 관찰하는 것도 가능하다.
마지막으로, 높은 시간 해상도 피질 비 근육 미오신 II (NMY -2- GFP)의 (Z-스택 기록 사이 5S 간격)와 프로토콜을 1, 3, 6, 단기 시간 경과 현미경을 사용하여 수행된다. 초점은 여기에 야생형 및 배아의 Rho는 GTPase 활성화 단백질 RGA-3 (20, 21)에 대한 RNAi의 고갈 사이의 흐름을 비교하여 대뇌 피질의 편광 흐름의 역학의 차이에있다. RGA -3- RNAi의 배아의 흐름이 축에 직교하면서 최근 관측 22와 유사하게, 야생형 배아 흐르게하면, 주로 배아의 장축 (도 5, 왼쪽 패널)을 따라있다. 이것은 연속적인 시간 지점을 오버레이 또는 PIV의 분석가로부터 명백하다(그림 5, 하단 패널)입니다.
피질 유동 입자가 데이터를 정확하게 해석 명백하게 해결 될 수 있도록 이러한 차이를 관찰하기 위해, 샘플링 간격을 선택하는 것이 중요하다. 작은 시간 간격 (≤5 초)을 큰 변위 누락 된 벡터를 방지하는 것이 좋습니다. 심문 윈도우는 입자의 크기가 분석 될 (피질 과립)을 수용 할만큼 충분히 커야한다. 이웃 심문 창 사이 오버랩 벡터 간격을 줄일 수 있으며, 따라서 격자 벡터의 개수를 증가시킨다.
그림 1. 입 피펫을 조립 왼쪽 :. 필터와 입 피펫을 조립하는 데 필요한 부품. 오른쪽 :. 조립 피펫 하세요이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
생식소 턴 지역의 그림 2. 3D 모델 왼쪽 위. 시간 경과 현미경 데이터의 단일 시점의 3D 투영합니다. 상단 중앙과 오른쪽 : 현미경 데이터의 3D 모델. 아래 :. 세포 꽃대 연락처의 세부 사항 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 핵 및 세포 분열의 잔재 왼쪽 그림 3. 추적 : 시간 경과 현미경 데이터에서 3D 전망. 중동 : 스냅 샷 모두 핵 (컬러 분야)과 세포 분열의 잔재 (회색 구체) 추적에서 얻은 모델. 오른쪽 : 스냅 샷세포 분열 남은 추적에서. 잔존물에 대한 경로도 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
대표적인 배아에서 ABA의 sublineage. 계통 그림 4. 세포와 세포 분열 남은 계통이 표시됩니다. 세포 분열은 사각형으로 표시됩니다. 각각의 눈금은 1 분에 해당합니다. 세포 분열의 잔재가 남은이 생성되는 동안의 부문에서 발생하는 딸의 이름을 따서 명명되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PIV 최고와 대뇌 피질의 수축 흐름의 그림 5. 분석 : 시작 (첫 번째 행) 및 PIVlab와 벡터 필드를 계산하는 데 사용되는 시간의 창 끝 (두 번째 행)을 묘사 시간 경과 현미경에서 3D 프로젝션 스틸.. 패널의 세 번째 행은 시간 윈도우의 모든 시점의 오버레이를 도시한다. 아래 :. PIVlab에 의해 얻어진 벡터 필드 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1 -. 생식선 회전 영역 2. 3D 모델도 관련이 동영상은 세포 세그먼트에 사용되는 비행기의 전체 스택을 스크롤로 시작합니다. 스택의 이후 3D 최대 투사 x와 (와 분할 생식선의 꽃대없이) Y 축을 중심으로 회전 3D의 세그멘트 모델 다음에 표시됩니다.
비디오 2 - 핵 및 세포 분열의 잔재 왼쪽 3. 추적도 관련 :. 시간 경과 현미경 데이터에서 3D 전망을. 중동 : 모두 핵 (컬러 분야)과 세포 분열의 잔재 (회색 구체) 추적에서 얻은 모델입니다. 오른쪽 : 세포 분열의 잔재와 그 궤적. 스케일 바는 10 μm의 =.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> 비디오 3 - PIV와 피질 수축성 흐름 5. 분석도 관련 PIVlab 눈금 막대와 벡터 필드를 계산하는 데 사용되는 대표적인 야생형 및 RGA -3- RNAi의 배아 3D 최대 투영 저속 녹화.. = 10 μm의.
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Discussion
개발 물체 추적을 통해, 특히 핵 추적, 그것은 C. 중앙 패터닝 메커니즘을 규명 할 수 있었다 엘레은 1,23,24를 배아. 더 높은 처리량이 전략을 확대, 추가적인 패턴 규칙을 발견하고 패턴을 추론하는 방법을 방법은 드 노보 (10) 규칙을 제안 최근에 가능했습니다. 많은 돌연변이를 들어, 그러나, 정확한 패터닝 결함은 여전히 알려져 있지 않다. 여기에 설명 된 방법은 자신의 해명하는 수단이 될 수있는 도구입니다. 중요한 것은, 많은 다른 모델 시스템은 다 같은 불변 개발을 수행하지 않지만 것을 최근 몇 년 동안 명백 해졌다 간스, 물체 추적 및 정량적 트래킹 데이터 분석 발달 메커니즘과 질병의 메카니즘을 식별하는 중요한 도구이다.
이 중 하나를 너무 될 경우 여기에 표시된 방법은 상황에 특히 적합하다각각 상업적 소프트웨어 툴을 구현하는 더욱 복잡한 및 / 또는 자체 생성 소프트웨어 솔루션, 또는 단순히 너무 비용을 구현하기 어려운. 중요한 것은, 여기에서 논의 된 도구로드하고 독립적가 기록 된 어떤 악기의 데이터를 분석하는 연구를 할 수 있습니다. 독점적 인 이미지 수집 소프트웨어를 사용하는 경우 또한, ImageJ에 독점 형식으로 데이터를로드 및 표준 포맷 (JPEG, TIFF)에 저장할 수 있습니다 바이오 형식 플러그인을 제공합니다.
시간 경과 현미경에 의존하는 모든 프로토콜에서 중요한 단계는 오른쪽 조건을 선택 현미경 이미지에서 충분한 콘트라스트를 얻을 수 있도록하고, 동시에, 시료에 방사선 노출을 감소시키는 것이다. 이것은 많이 사용되는 현미경의 종류에 따라 다릅니다 그것은 일반적으로 회전하는 디스크 또는 단일 평면 조명 현미경 빠른 스캐닝 기술을 사용하는 것이 좋습니다. 특히, 대뇌 피질의 역학의 PIV, 포인트 스캔의 이전 버전에 대한현미경은 충분한 해상도와 유효한 분석을 수행 할 수있는 속도로 대뇌 피질의 신호를 포착 할 수 너무 느린 수 있습니다. 따라서 항상 신중 방사선 노출을 평가하고 검체의 생존력을 시험하는 것이 중요하다. 여기서 설명 프로토콜 배아를 탑재 micobeads을 사용하더라도 또한, 단지 제조 조금 더 시간이 걸리지 만 덜 비싸고 똑같이 재현 일부 경험 아가 패드를 사용하는 것도 가능하다. 그러나, 그것은 어떠한 마비 제, 예를 들면, 레바 미솔의 사용을 피할 보낸 아가 패드 나노 비드의 조합 성체 벌레의 장기 고정화 우수한 방법 인 것을 지적한다.
그것은 여기에서 논의 된 도구들이 완전 자동화 된 데이터 분석을 수행하지 않기 때문에 자신의 한계를 가지고 있다고 지적한다. 그러나, 세포 분열 잔재와 같은 구조의 경우, 종종 s의 분자 마커를 식별하는 도전안정적인 추적을 위해 매우 중요하다이 구조를 tains. 주요 미래 과제는 따라서 기계 학습과 우리가 여기에서 논의 사용하기 쉬운 오픈 액세스 소프트웨어에 적응 탐지 / 분할 알고리즘 등의 기능을 포함에있다. 이러한 기능들 중 일부는 더 긴 시간 간격에 걸쳐 반복 추적 해결할 수있는 특정 소프트웨어에서, 다른 소프트웨어 모듈들에서 발견 될 수 있고, 또는 그하도록 설계 트래킹 데이터의 큰 세트 (예 StarryNite / AceTree 25 Nucleitracker4D 26를 비교할 수 히스톤 융합 단백질 또는 스핀들 (27)를 사용하여 트랙 핵, 또는 미 BioCell 28). 이러한 도구는 핵이 아닌 다른 구조의 추적을 목표로 할 때 구현하기 더 복잡 할 수 있습니다. 추적되어야 특정 구조에도 불구하고, 이러한 프로그램은 일반적으로 이미지 데이터의 많은 양을 분석 할 때 매우 유용하다. 중요하게는, 상술 한 소프트웨어 MODUL 간의 호환성이있다ES.
다른 모델 시스템을 사용하는 경우 (예를 들어, 배아를 비행, 포유 동물 배양 세포 등), 여기에 제시된 방법은 상술 한 바와 같이 orthologous 구조를 추적하기 적합하다. 더 중요한 것은, 독립적 등 조사중인 모델 시스템, 다른 세포 내 구조물, 예를 들면, 중심체, 핵소체, 미립자, 소체의 용이 만 획득 파라미터 객체 트랙을 완전히 포착을 보장하기 위해 조절 될 필요가 추적 될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
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