Abstract
Capturant quantitativement les processus de développement est cruciale pour obtenir des modèles mécanistes et clé pour identifier et décrire les phénotypes de mutants. Voici protocoles sont présentés pour la préparation des embryons et des adultes de C. elegans pour animaux à court et à long terme Vidéomicroscopie et des méthodes pour le suivi et la quantification des processus de développement. Les méthodes présentées sont toutes basées sur C. souches elegans disponibles à partir du Centre de Génétique et de Caenorhabditis sur les logiciels open-source qui peuvent être facilement mises en œuvre dans tout laboratoire indépendamment du système de microscopie utilisée. Une reconstruction d'un modèle cellulaire-forme 3D utilisant le IMOD logiciel de modélisation, suivi manuel des structures sous-cellulaires marqués par fluorescence à l'aide du multi-usages programme d'analyse d'image Endrov, et une analyse des flux contractile corticale en utilisant PIVlab (Time-Resolved numérique Particle Image Velocimetry Outil pour MATLAB) sont présentés. Il est discuté comment ces méthodes peuvent également être déployés to capturer quantitativement autres processus de développement des différents modèles, par exemple, le suivi de la lignée cellulaire et le traçage, le suivi des flux de vésicule.
Introduction
Avec les améliorations constantes des protéines fluorescentes, l'ingénierie des génomes, la microscopie optique et ciels et de matériel informatique, il est désormais possible d'enregistrer développement de nombreux organismes modèles à une résolution spatio-temporelle sans précédent. Cela permet aux chercheurs de poser des questions qui ne pouvaient pas être traitées antérieurement ou de revoir les processus de développement connues afin de chercher des aspects négligés. Ce progrès a suscité le domaine de la biologie du développement quantitatif, qui vise à transformer les modèles qualitatifs, informelles dans des modèles quantitatifs par des mesures approfondies et des analyses statistiques.
Cellules de suivi et de structures sous-cellulaires a permis de tirer des modèles quantitatifs du développement embryonnaire, l'activité du système nerveux, ou la division cellulaire 1-12. En faisant le suivi des restes de la division cellulaire au cours du développement précoce de la C. elegans embryon, nous pourrions récemment révéler qu'ils suivent une chaîne stéréoFacteurs tapé chemin de polarisation importante et constituer 13,14.
Ici, les protocoles sont présentés qui font la biologie quantitative développement approches accessibles pour les non-experts. L'accent est mis sur trois outils straight-forward, librement disponibles qui sont mis en œuvre dans tout laboratoire qui a accès à la microscopie confocale et les ordinateurs standard. Ceux-ci comprennent un protocole pour générer des formes cellulaires 3D, un protocole à suivre restes de la division cellulaire, et un protocole pour décrire quantitativement la dynamique de actomyosine corticales. Le nématode C. elegans est utilisé comme un cas exemplaire, cependant, les méthodes et les outils présentés ici sont adaptés à une variété de questions dans d'autres modèles biologiques, par exemple, des cellules en culture, des explants de tissus, organoïdes ou sphéroïdes, les autres embryons, etc.
Généralement, certaines des analyses présentées ici peuvent également être effectuées avec l'outil open source ImageJ populaire (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; ou FIDJI, les «batteries inclus» version de ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) pour lequel de nombreux plugins pour des analyses quantitatives différentes sont disponibles. Cependant, les programmes discutés ici sont conçus pour résoudre les problèmes spécifiques.
Tout d'abord, IMOD, un traitement d'image, la modélisation et la suite de l'affichage peut être utilisé pour des reconstitutions en 3D de coupes en série de microscopie électronique ou la lumière 15. IMOD contient également des outils pour la visualisation des données 3D à partir d'une orientation quelconque. Deuxièmement, Endrov, un programme Java conçu pour effectuer l'analyse d'image, traitement de données, et l'annotation des réseaux ou des pistes (entre autres) sur la base d'une architecture de plugin prolongée, avec compatibilité plugin ImageJ 16. Il contient plus de 140 opérations de traitement d'image et une interface utilisateur extensible dans lequel le modèle et les données brutes sont affichés séparément. Son code source peut être trouvé à https://github.com/mahogny/Endrov. Troisièmement, PIVlab, un MAtlab outil de particules d'image numérique velocimetry qui permet à l'utilisateur d'analyser quantitativement et qualitativement les champs de flux de particules 17. L'utilisation de ce programmes nécessite une licence MATLAB qui comprend le Image Processing Toolbox (http://mathworks.com). PIVlab est un programme conçu pour décrire quantitativement flux. Il calcule la distribution de la vitesse, de l'ampleur, le tourbillon, la divergence, ou de cisaillement dans les paires d'images ou séries. Pour cela, il cross-corrélation de petites zones d'images (appelés 'passe' dans la section de protocole) d'une paire d'image pour dériver le déplacement de la particule la plus probable. Cette corrélation croisée donne une matrice de corrélation qui peut être analysé dans le domaine de l'espace ou de fréquence utilisant soit inter-corrélation directe ou une transformation de Fourier rapide (FFT), respectivement.
L'équipement utilisé ici est un microscope inversé équipé d'un Nipkow («spinning») disque, un EMCCD, 488 et 561 nm solide-normelasers, et 20x ou 40x ou air 60x / plan apochromat objectifs de pétrole ou de l'eau d'immersion. Cependant, il est également possible d'effectuer une imagerie time-lapse avec d'autres modalités d'imagerie, par exemple, Point-, ligne- ou la microscopie à balayage feuille à base de laser, la microscopie multi-photons, ainsi que la microscopie épifluorescence combiné avec déconvolution ou structurée éclairage. L'avantage d'utiliser un système de disque Nipkow est l'acquisition d'image extrêmement rapide, surtout si un mode de diffusion (mouvement et la numérisation de l'objet dans la dimension z continu) est disponible. En outre, pour améliorer la résolution, un agent d'allongement de 1,5 grossissant de pliage en face de la EMCCD peut être utilisé.
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Protocol
1. Préparation de C. elegans embryons pour Time-lapse microscopie utilisant des microbilles
- Transfert vers adultes gravides en utilisant un choix sans fin (fil de platine) dans une goutte de tampon M9 et nettoyer les bactéries en premier agitant vigoureusement et ensuite transférer chaque ver à une baisse adjacente de M9 utilisant un cil monté sur un / pointe de la pipette cure-dent ou utiliser un capillaire de verre pointu.
- Diluer la dispersion contenant 20 um billes diamètre de polystyrène de 10 fois dans du tampon M9 (1 tampon L M9 contenant 3 g de KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, et, après l'autoclavage (20 min, 120 ° C), ajouter un 1 ml supplémentaires d'une solution à 1 M 4 MgSO).
- Faire une pipette de la bouche de tout type de mince capillaire en verre (par exemple, la fonte des capillaires ponctuelles ou capillaires utilisés pour tirer les aiguilles d'injection), un environ 0,5 m de long morceau de caoutchouc, silicone ou tubes en matériau similaire (idéalement transparent), un 200 pipointe de la pipette, le couvercle d'un tube de PCR de 200 pi, un filtre hydrophobe pour les petites seringues (par ex., un de 0,2 à 0,45 um taille des pores et 15-50 mm de diamètre Nylon, PTFE ou le filtre de matériau similaire) pointe, et une pipette de 1000 pi . Ce type de bouche pipette assure qu'aucun matériel biologique ne peut entrer en contact avec l'expérimentateur.
- Monter la pipette par l'insertion, la pointe de la pipette 200 ul de la première extrémité dans le tube et de le brancher avec le couvercle d'un tube de PCR qui présente une perforation centrale qui correspond au diamètre du capillaire utilisé. Une aiguille poinçon ou de la préparation très pointu peut être utilisé pour générer la perforation.
- Dessinez un capillaire mince et l'insérer dans la perforation. Insérez le filtre dans l'autre extrémité de la tubulure et d'insérer une pipette de 1000 pi que la bouche pièce (Figure 1).
- Disséquer adultes gravides en coupant vers transversalement à la vulve avec une lame de rasoir propre ou d'un scalpel.
NOTE: Habituellement, de nombreux embryons seront expulsed après la coupe. Toutefois, si les embryons précoces sont nécessaires, ils ont parfois à être libéré de la carcasse à l'aide d'un cil ou une aiguille pointue. - Pipette une goutte de la dispersion de perles de polystyrène dilué (~ 4 pi) sur un 24x60 mm couvercle en verre et d'embryons de transfert dans cette goutte en utilisant la bouche pipette.
- Placez délicatement un petit (par exemple, 18x18 ou 20x20 mm) couvrir verre sur le dessus de la goutte et assurez-vous que la baisse a pleinement étaler.
NOTE: La baisse devrait également être suffisamment petit pour ne pas toucher les bords de la petite vitre de protection. - Sceller la montagne avec de la vaseline liquéfié. Ajouter une goutte d'huile d'immersion sur le côté de la lamelle de 24x60 mm et passez à la section 'Time-lapse microscopie.
2. Préparation des adultes C. elegans animaux pour Time-lapse microscopie utilisant des nanobilles
NOTE: En général, le protocole pour le montage d'animaux adultes est une adaptation du protocole de réf. 18.Avec ce protocole, il est possible de réaliser à long terme Vidéomicroscopie confocale des animaux adultes.
- Préparer un 1,5% (p / v) de solution d'agarose dans du tampon M9, faire bouillir (1 min, 100 ° C au bain-marie ou micro-ondes). L'utilisation de concentrations plus élevées d'agarose est déconseillé car cela peut conduire à l'extrusion de l'intestin et / ou des parties de la gonade.
- Coller 2-3 couches de ruban adhésif sur deux lames de microscope chacun. Placez une diapositive sans bande entre les deux diapositives avec du ruban adhésif.
- Utiliser un embout de pipette et déposer une goutte de la solution d'agarose chaud dans le centre de la diapositive milieu. Placer rapidement une autre diapositive sur la goutte de sorte qu'il est soutenu par les couches de ruban de chaque côté. Cela va créer un rond et pad agar forfaitaire d'environ 10 mm de diamètre.
- Mettre une goutte de solution de talon 100 nm (non dilué, ce qui est 2,6% (p / v)) sur le tampon. Transfert 1-10 vers adultes nettoyés dans la goutte avec un pic de ver. Sceller avec 18x18 mm verre de couverture et de la vaseline comme expliqué dans Protocol 1.
3. microscopie time-lapse
- Mettre une goutte d'huile d'immersion sur la lame de microscope ou le sandwich de verre de couverture. Utilisez fond clair à faible grossissement (5x ou 10x lentilles) pour localiser l'échantillon.
REMARQUE: Limiter l'exposition à la lumière bleue autant que possible (en particulier pour C. elegans embryons), par exemple, ne pas utiliser la microscopie épifluorescence pour trouver / concentrer l'échantillon, mais utiliser en fond clair à la place. - Changer pour un plus fort grossissement (40x ou 60x objectifs), amener l'échantillon dans le foyer (soit plan central ou les plans haut / bas de l'échantillon, selon le logiciel d'acquisition).
- Définissez les intervalles d'échantillonnage à 30 avions à 1 um espacement enregistrés chaque 1min. Dans le cas d'une xy ou xyz stade automatisé est disponible, plusieurs points peuvent être enregistrées en une seule session. Passez à l'imagerie de fluorescence et de vérifier la mise à nouveau.
REMARQUE: Essayez d'éviter d'utiliser de hautes puissances laser, utilisez plutôt un peu plus longs temps d'expositionà de très faibles intensités. Mesure images acquises immédiatement, soit dans le programme d'acquisition d'image ou dans ImageJ pour éviter la saturation, quelles cultures vont la dynamique et signifie également l'exposition excessive au rayonnement. - Démarrez l'enregistrement de la série time-lapse.
NOTE: Pour exclure l'analyse des artefacts, commencer avec des intervalles longs (3-10 min) de temps entre la numérisation de l'échantillon et augmenter progressivement échantillonnage temporel aux intervalles souhaités. Timing de développement ainsi que des points d'extrémité dans les deux cas doivent être similaires lors de l'exécution d'une analyse statistique. En outre, il est souvent nécessaire d'évaluer la phototoxicité et les taux de survie. Par conséquent, récupérer spécimen de la montagne après long terme Vidéomicroscopie et vérifier si elles continuent à se développer / live.
4. Reconstruire un modèle cellulaire de forme 3D avec IMOD
REMARQUE: Le logiciel IMOD est disponible à partir de la page Web IMOD: http://bio3d.colorado.edu/imod/. L'installation du logiciel est décritD il. Si vous utilisez Windows OS, une boîte à outils Unix doit être installé, qui peut également être trouvé comme un paquet sur la page Web IMOD. En outre, il ya une introduction 3dmod excellemment compilé disponible sur la page Web IMOD (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Ouvrez le shell Unix et tapez "imod". La fenêtre IMOD ouvrira. Sélectionnez le fichier avec les données brutes (idéalement un TIF empilés ou similaires) qui permet de produire un modèle 3D.
- Localisez le bas et le haut des objets dans la fenêtre ZaP en utilisant la fenêtre d'information (de haut en bas outil de défilement).
- Commencer à tracer les contours de cellules. Surtout, veiller à ce que chaque cellule est un objet. Commencez avec le plan supérieur de chaque cellule et de créer le premier contour de là en utilisant la fenêtre d'information. Faites défiler z et de créer un nouveau contour pour chaque plan z.
- Faites de même pour autant de cellules que nécessaire pour modéliser en 3D. Ne pas oublier de créer un nouvel objet lors du démarrage d'une nouvelle cellule.
NOTE: Il ya beaucoup de façons différentes pour le traçage de contour et plusieurs plugins utiles. S'il vous plaît visitez la page Web IMOD et tutoriels en ligne pour plus de détails. Dans le cas représenté ici, le réglage par défaut a été utilisé. - Ouvrez le "Model View" fenêtre d'inspecter les objets et leurs contours.
- Dans le "Model View" barre d'outils Choisissez "Editer" - "Objets". La fenêtre d'édition respective ouvre.
- Pour modéliser les cellules comme des objets remplis et fermés, choisissez "Mesh" comme "Dessiner Type de données" et de "remplissage" comme "style de dessin". Cliquez sur "Maillage" dans la sélection de défilement en bas à gauche de la fenêtre. Cochez l'option "Cap" dans la sélection en bas à droite. Vérifiez autant d'objets que nécessaire et cliquez sur "Mesh tous». Le programme va générer des objets solides des piles de contours. Le facteur z-échantillonnage peut être ajustée en changeant "Z-échelle" dans la fenêtre "View".
- Déplacer / tourner la objec 3Dt ("Edit" - "Affichage") et enregistrer des instantanés ou des films ("Fichier" - "Aligner Tiff sous ..." ou "Film / Montage").
5. Suivi par fluorescence Structures marqué avec Endrov
NOTE: Pour suivre les restes de la division cellulaire, utiliser une souche avec un marqueur de membrane nucléaire ou de plasma pour l'identification de cellule (par exemple, H2B, PH-PLC-d1) et un marqueur reste de la division cellulaire (par exemple, NMY-2, ZEN-4 ). Le marqueur de membrane nucléaire ou le plasma est important de déterminer quelle cellule hérite le reste de la division cellulaire.
- Pour le chargement rapide et la facilité d'utilisation, les données brutes doit être converti en un fichier TIFF (par exemple, dans ImageJ). Ensuite, ouverte Endrov et charger le fichier à analyser en choisissant l'option "Load File" dans le menu fichier. Cliquez sur l'icône "de la visionneuse 2D" sur la barre d'outils.
- Réglez l'histogramme en cliquant sur l'icône "gamme Fit" (l'icône bleue au coin inférieur droitde l'écran Endrov). Réglez le XYZ-résolution en allant à "Données" - "nom de fichier" - "ImageSet" - "Channel" - "Set XYZ-résolution". Tapez des valeurs pour X, Y et Z, par exemple, 5, 5, 1 si la résolution X et Y est de 0,2 um et d'échantillonner chaque 1 um dans Z.
- Pour annoter les noyaux, déplacer au plan de l'intérêt et cliquez sur "spectateur 2D". Sélectionnez "Lineage" dans le menu déroulant et choisissez "Nouveau lignée".
- En cliquant et en faisant glisser sur le noyau, il peut être marqué. Pour nommer le noyau, cliquez droit et choisissez "Renommer particules" dans le menu déroulant. Pour augmenter ou diminuer le diamètre du cercle, faites glisser l'icône de flèche qui apparaît sur la gauche du cercle marqué. Pour marquer le plan central du noyau, cliquez sur l'icône à droite. Lors de l'utilisation d'un marqueur de la membrane plasmique, une grande sphère peut être tirée qui couvre la majeure partie de la cellule.
- Pour poursuivre dans le temps et l'avion, choisir le "Frame" et "Z"options à la barre d'outils en bas. Après être allé à la prochaine point de temps, ajuster la position ou la taille du cercle qui marque le noyau en conséquence. Répétez jusqu'à ce que la cellule se divise suivis.
- Quand il ya une division cellulaire, marquer les noyaux filles et passer à "spectateur de Lineage". Cela peut être sélectionné en cliquant sur l'icône "Windows" sur la barre d'outils supérieure. Marquez tous les trois noyaux simultanément, aller à l'option "Lineage" dans la barre d'outils supérieure et sélectionnez "parent associé".
- Lorsque le suivi de la cellule est terminée, passer à la cérémonie marquant le reste de la division cellulaire pour le suivi canal. Pour changer de chaîne, cliquez sur le nom du fichier dans le coin inférieur gauche de la barre d'outils. Le reste de la division cellulaire (ou toute autre structure) peuvent être suivies comme décrit ci-dessus pour le noyau.
- Lors du retour au logiciel après la fermeture, il est nécessaire d'aller à "2D Viewer" - "Lineage" - "Modifier" et de cliquer sur le numéro de la lignée qui sera édité.
6. Analyse corticale actomyosine débit avec PIVlab
REMARQUE: PIVlab est un logiciel disponible gratuitement sur: http://pivlab.blogspot.de/; il peut être invoqué à partir de l'environnement de ligne de commande en tapant PIVlab_GUI Matlab. Lorsque vous travaillez avec PIVlab, il est recommandé de sauvegarder la série d'images dans un dossier distinct.
- Démarrez une nouvelle session dans le menu "Fichier". Chargez les fichiers image en cliquant sur le bouton «Charger les images".
- Sélectionnez le style de séquençage 1-2, 2-3, ... et accédez au répertoire qui contient la séquence d'images souhaitées. Sélectionnez les images et cliquez sur le bouton "Ajouter" et l'importation.
- Allez dans "Paramètres" Analyses et sélectionnez «Exclusions (ROI, masque)". Alternativement, appuyez sur "Ctrl + E". Utilisez le bouton "Dessiner masque (s) pour la trame courante" pour inactiver la partie indésirable de l'image / s (c.-à-région en dehors embryon).
- Sélectionnez "Paramètres de PIV" from le menu "paramètres Analyses". Alternativement, appuyez sur "Ctrl + S". Choisir "fenêtre FFT déformation" en tant que l'algorithme de PIV souhaitée.
REMARQUE: transformation de Fourier rapide (FFT) réduit le coût de calcul, mais est seulement recommandé le signal est bien au-dessus du bruit et si le déplacement des particules étudiées ne dépasse pas la moitié de la zone de passage analysé (voir 6.5). - Entrez les valeurs suivantes pour les trois passages, qui sont la zone d'interrogation croisée d'intensité corrélation entre les images suivantes: Pass 1: Interrogation superficie de 64 pixels avec un pas de 32. Col 2: Interrogation superficie de 32 pixels avec un pas de 16 . Sélectionnez "linéaire" de la déformation de la fenêtre dans le menu déroulant. Choisissez la méthode de Gauss 2 * 3 points pour les sous-pixel déplacement estimation.
- Sélectionnez "Analyser!" à partir du menu Analyse et utiliser le bouton "Analyser tous les cadres" pour commencer une analyse.
- Pour le post-traitement sélectionnez "validation de Vector" de "; Traitement après menu "et régler la déviation standard (Stdev) seuil de filtre à 7 et d'appliquer à tous les cadres.
- Choisissez "dériver les paramètres / modifier les données" du menu "Plot". Sélectionnez "vecteurs [px / frame]" dans le menu déroulant. Réglez la finesse de vecteurs et de filtre passe-haut et d'appliquer à tous les cadres.
- Pour calculer des vecteurs moyennes de tous les cadres, définir les «cadres d'occasion" à 1: fin et cliquez sur le bouton «Calculer vecteurs moyens".
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Representative Results
En utilisant les protocoles 2, 3, et 4, imagerie time-lapse de gonades dans sauvage de type C. elegans adultes est effectuée (souche OD58 (unc-119 (ed3) III; ltIs38 [pAA1; Pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), exprimant un marqueur de la membrane d'un promoteur de la lignée germinale ). En se concentrant sur le tour de la gonade, un modèle 3D de cellules germinales est généré à partir des données de microscopie (figure 2). Ce modèle permet d'analyser l'évolution de la taille des cellules tandis que le transit des cellules forment la partie distale à la partie proximale du bras, révèle l'organisation du rachis et de la taille des contacts des cellules individuelles au rachis (voir aussi http: //www.wormatlas. org / hermaphrodite / germe% 20LINE / Germframeset.html).
Ensuite, les protocoles 1, 3 et 5 sont utilisés pour effectuer à long terme Vidéomicroscopie de C. elegans embryons (souche CHP52 qui est un croisement de la souche RW10226 (unc-119 (ed3) III; itIs37 [Pie-1p :: :: mCherry H2B :: Pie-1 + 3 'UTR unc-119 (+)]; stIs10226 [sa-72 promoteurHIS-24 :: mCherry fusion traductionnelle avec laissez-858 3 'UTR + unc-119 (+)]) et la souche LP162 (nmy-2 (CP13 [nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). Dans cette souche, il est possible de suivre les deux noyaux (à travers les protéines de fusion mCherry-histones) et les restes de la division cellulaire (par le biais du myosine II locus génomiquement modifiée non muscle où une GFP a été intégré dans le cadre à travers le CRISPR / technologie cas9 19 ) panneaux simultanément en utilisant deux couleurs time-lapse microscopie (figure 3, gauche). Les modèles obtenus par lineaging des deux structures dans Endrov montrent le motif stéréotypée décrit précédemment de la division cellulaire héritage reste 13,14. En outre, à partir des données de lineaging, les titres pour chaque résidu cellulaire et la division cellulaire (Figure 3, panneaux de droite) et le moment de la division cellulaire persistance reste (sur la base du NMY-2 GFP -signal), ainsi que la corrélation de la cellule calendrier de division peut être obtenue (<strong> Figure 4, représenté par la lignée de l'ABA seulement). Lors de l'utilisation d'un marqueur de la membrane plasmique en outre, il est également possible d'observer le point de division cellulaire internalisation reste du temps.
Enfin, en utilisant les protocoles 1, 3 et 6, à court terme Vidéomicroscopie avec haute résolution temporelle (intervalles de 5s entre l'enregistrement d'un z-stack) de la myosine non musculaire corticale II (NMY-2 GFP) est effectuée. L'accent est sur les différences dans la dynamique des flux de polarisation corticale en comparant ce flux entre le type et embryons ARNi appauvri pour la protéine d'activation de Rho GTPase RGA-3 20,21 sauvage. Similaires à des observations récentes 22, le débit dans des embryons de type sauvage est essentiellement le long de l'axe long de l'embryon (figure 5, les panneaux de gauche), tandis que l'écoulement dans le RNAi-embryon RGA 3 est orthogonal à cet axe. Ceci est évident à partir de la superposition des points de temps consécutifs ou des analys PIVest (Figure 5, panneaux inférieurs).
Pour observer ces différences, il est important de choisir un intervalle d'échantillonnage de sorte que les particules de flux corticales peuvent être résolus sans ambiguïté pour l'interprétation exacte des données. Intervalles de temps plus petit (≤5 sec) sont recommandés pour éviter les grands déplacements et des vecteurs manquants. La fenêtre d'interrogation doit être suffisamment grand pour accueillir la taille des particules à analyser (granules corticaux). Chevauchement entre les fenêtres d'interrogation voisins permet de réduire l'espacement de vecteur et augmente le nombre de vecteurs dans la grille ainsi.
Figure 1. Montage d'une pipette de bouche Gauche:. Pièces nécessaires à l'assemblage de pipette avec filtre. Droite:. La pipette assemblé S'il vous plaîtcliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Un modèle 3D de la région gonades top tour de gauche:. Projection 3D d'un seul point du temps à partir des données de Vidéomicroscopie. Top milieu et à droite: les modèles 3D des données de microscopie. En bas:. Détails de contacts cellule-rachis S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Suivi des noyaux et des restes de la division cellulaire. A gauche: projections en 3D à partir de données de Vidéomicroscopie. Moyen: Instantanés du modèle obtenu à partir de deux noyaux de suivi (sphères colorées) et des restes de la division cellulaire (sphères grises). Droite: Snapshotsde la division de la cellule de suivi reste. Les chemins pour les restes sont également présentés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. cellulaire et la division cellulaire des lignées restantes pour l'ABA sous-lignée. Lignées d'un embryon représentant sont présentés. Divisions cellulaires sont marqués par des carrés. Chaque marque de graduation correspond à 1 min. Les restes de la division cellulaire ont été nommées d'après les filles qui découlent de la division au cours de laquelle le reste est généré. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Analyse des flux contractile corticale avec PIV Haut:. Alambics de projection 3D à partir Vidéomicroscopie qui dépeignent le début (première rangée) et la fin (deuxième rangée) de la fenêtre de temps utilisée pour calculer le champ de vecteur avec PIVlab. La troisième rangée de panneaux montre la superposition de tous les points de temps de la fenêtre de temps. En bas:. Les champs vectoriels obtenus par PIVlab S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Vidéo 1 -. En rapport avec la figure 2. Un modèle 3D de la zone de tour de la gonade La vidéo commence à faire défiler toute la pile de plans utilisés pour segmenter les cellules. Après une projection 3D maximale de la pile est représenté, suivi par la segmentation basée sur modèle 3D tournant autour du axes x et y (avec et sans les gonades du rachis segmenté).
Vidéo 2 - liée à la figure 3. Suivi des noyaux et des restes de la division cellulaire gauche: projections en 3D à partir de données de Vidéomicroscopie.. Moyen: Le modèle obtenu à partir de deux noyaux de suivi (sphères colorées) et des restes de la division cellulaire (sphères grises). A droite: les restes de la division cellulaire et leurs trajectoires. La barre d'échelle = 10 um.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Vidéo 3 - liée à la figure 5. Analyse des flux contractile corticale avec PIV projection maximale enregistrements 3D time-lapse d'un type sauvage représentatif et RGA-3 ARNi embryon utilisé pour calculer le champ de vecteur avec PIVlab barre d'échelle.. = 10 um.
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Discussion
Grâce objet de suivi dans le développement, dans le suivi nucléaire particulier, il a été possible d'élucider les mécanismes de formation de motifs centraux de C. elegans embryogenèse 1,23,24. Élargir cette stratégie à un débit plus élevé, il a été récemment possible de découvrir les règles de structuration supplémentaires et de proposer une méthode comment déduire structuration règles de novo 10. Pour de nombreux mutants, cependant, les défauts de mise en forme précise sont encore inconnus. Les méthodes décrites ici sont des outils qui peuvent contribuer à leur élucidation. Surtout, il est devenu évident au cours des dernières années que, bien que de nombreux autres systèmes modèles ne suivent pas une évolution invariant comme C. elegans, le suivi et l'analyse des données quantitatives de suivi objet est un outil essentiel pour identifier les mécanismes et les mécanismes de la maladie de développement.
Les méthodes présentées ici sont particulièrement bien adaptés à la situation où il serait soit tropdifficile à mettre en œuvre des solutions logicielles plus complexes et / ou auto-générés, ou tout simplement trop coûteux à mettre en œuvre des outils de logiciels commerciaux, respectivement. Surtout, les outils présentés ici permettent au chercheur de charger et d'analyser toutes les données indépendamment sur instrument sur lequel ils ont été enregistrés. En outre, si le logiciel propriétaire d'acquisition d'image est utilisé, ImageJ fournit le plugin Bio-formats qui peuvent charger des données dans des formats propriétaires et les enregistrer dans des formats standard (JPEG, TIFF).
Une étape cruciale dans tous les protocoles qui reposent sur la microscopie laps de temps est de choisir les bonnes conditions pour obtenir un contraste suffisant dans les images de microscopie, et, dans le même temps, afin de réduire l'exposition aux rayonnements à l'échantillon. Cela dépend fortement du type de microscope utilisé et il est généralement recommandé d'utiliser des techniques de numérisation rapides comme disque de filature ou seule la microscopie plan d'éclairage. Plus précisément, pour PIV de la dynamique corticales, des versions plus anciennes du point de balayagemicroscopes pourraient être trop lente pour permettre l'acquisition de signaux corticaux à une résolution et de la vitesse pour effectuer des analyses valides suffisante. Il est donc toujours indispensable d'évaluer soigneusement l'exposition aux rayonnements et de tester la viabilité de l'échantillon. En outre, bien que les protocoles discutés ici utilisent micobeads pour monter des embryons, il est également possible d'utiliser des serviettes agarose, ce qui prend un peu plus de temps pour se préparer, mais est moins cher et avec une certaine expérience aussi reproductible. Toutefois, il convient de signaler que la combinaison de tampon et des nanobilles d'agarose est la meilleure méthode pour l'immobilisation de longue durée de vers adultes car elle évite l'utilisation d'un agent paralysant, par exemple, le lévamisole.
Il convient de souligner que les outils présentés ici ont leurs limites car ils ne réalisent l'analyse des données entièrement automatisé. Cependant, pour des structures telles que des restes de la division cellulaire, il est souvent difficile d'identifier un marqueur moléculaire qui ne scontient cette structure, qui est crucial pour un suivi fiable. Un défi majeur de l'avenir réside donc dans incluant des fonctionnalités telles que l'apprentissage machine et adaptables algorithmes de détection / de segmentation dans le logiciel d'accès facile à utiliser et ouvert que nous discutons ici. Certaines de ces caractéristiques peuvent être trouvés dans d'autres modules de logiciels, en particulier les logiciels qui peuvent traiter avec un suivi répétées sur des intervalles de temps plus longues, ou qui peuvent comparer de grands ensembles de données de suivi (par exemple, StarryNite / AceTree 25 ou Nucleitracker4D 26, qui sont conçus pour noyaux de piste en utilisant des protéines ou des broches 27 histone-fusion, ou Simi BioCell 28). Ces outils peuvent être plus complexe à mettre en oeuvre lorsque l'on cherche à suivi de structures autres que les noyaux. Nonobstant la structure particulière qui devrait être suivi, ces programmes sont généralement très utiles lorsque de grandes quantités de données d'image seront analysés. Surtout, il ya compatibilité entre le Modul logiciel mentionné ci-dessuses.
Lorsque vous travaillez avec d'autres systèmes modèles (par exemple, voler des embryons, des cellules cultivées de mammifères, etc.), les méthodes présentées ici sont également bien adaptés pour suivre les structures orthologues comme décrit plus haut. Plus important encore, indépendamment du système de modèle objet de l'enquête, différentes structures sous-cellulaires, par exemple, les centrosomes, nucléoles, des microparticules, des vésicules, etc. peuvent être facilement suivis, seuls les paramètres d'acquisition doivent être ajustées pour assurer la capture complète de traces d'objets.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
