Abstract
Kwantitatief vastleggen van ontwikkelingsprocessen is cruciaal om mechanistische modellen en belangrijke ontlenen aan mutante fenotypes te identificeren en te beschrijven. Hier protocollen worden gepresenteerd voor het bereiden van embryo's en volwassen C. elegans dieren voor de korte en lange termijn time-lapse microscopie en methoden voor het opsporen en kwantificeren van ontwikkelingsprocessen. De gepresenteerde methoden zijn allemaal gebaseerd op C. elegans stammen beschikbaar in het Caenorhabditis Genetics Center en open source software die gemakkelijk kan worden geïmplementeerd in elk laboratorium onafhankelijk van de gebruikte microscoop. Een reconstructie van een 3D-cel-vorm model met behulp van het modelleren software IMOD, handmatig bijhouden van fluorescent-gelabelde subcellulaire structuren met behulp van de multi-purpose beeldanalyse programma Endrov, en een analyse van de corticale contractie stroom met behulp PIVlab (tijdsopgeloste Digital Particle Image Velocimetry tool voor MATLAB) getoond. Er wordt besproken hoe deze werkwijzen ook kunnen worden ingezet to kwantitatief vast te leggen andere ontwikkelingsprocessen in verschillende modellen, bijvoorbeeld, mobiele tracking en lineage tracing, het bijhouden van blaasje flow.
Introduction
Met de gestage verbetering van de fluorescerende eiwitten, genoom engineering, lichtmicroscopie en computer soft- en hardware, is het nu mogelijk om de ontwikkeling van vele modelorganismen opnemen met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Dit stelt onderzoekers in staat om vragen die niet eerder konden worden aangepakt vragen of bekende ontwikkelingsprocessen opnieuw in om te zoeken naar het hoofd gezien aspecten. Deze vooruitgang is op het gebied van kwantitatieve ontwikkelingsbiologie, die gericht is op het transformeren van kwalitatieve, informele modellen in kwantitatieve modellen door een grondige metingen en statistische analyses aangewakkerd.
Tracking cellen en subcellulaire structuren heeft het mogelijk gemaakt om kwantitatieve modellen van embryonale ontwikkeling, zenuwstelselactiviteit of celdeling 1-12 afleiden. Door het bijhouden van celdeling resten tijdens de vroege ontwikkeling van het C. elegans embryo, konden we onlangs bekend dat zij volgen een stereogetypte pad en zijn belangrijke factoren polariserende 13,14.
Hier worden protocollen gepresenteerd waaruit kwantitatieve ontwikkelingsbiologie benaderingen toegankelijk voor niet-experts. De focus ligt op drie straight-forward, vrij beschikbare tools die implementeerbaar in een lab dat de toegang tot standaard confocale microscopie en computers heeft zijn. Deze omvatten een protocol om 3D cel vormen te genereren, een protocol bij de celdeling resten volgen en een protocol om corticale actomyosine dynamiek kwantitatief te beschrijven. De nematode C. elegans wordt gebruikt als een typisch geval echter de methoden en instrumenten die hier besproken zijn geschikt voor een verscheidenheid van vragen in andere biologische modellen, bijvoorbeeld gekweekte cellen, weefsel explantaten, organoids of sferoïden andere embryo's, etc.
In het algemeen, een aantal van de hier getoonde analyses kunnen ook worden uitgevoerd met de populaire open source tool ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/docs/index.html; of Fiji, de 'batterijen' versie van ImageJ, http://fiji.sc/Fiji) waarvoor veel plugins voor verschillende kwantitatieve analyses beschikbaar zijn. Echter, de programma's die hier besproken zijn ontworpen om specifieke problemen aan te pakken.
Allereerst IMD, een beeldverwerking, modelleren en weergave suite kan worden gebruikt voor 3D-reconstructies van seriële coupes van elektron of lichtmicroscopie 15. IMOD bevat ook gereedschappen voor het bekijken van de 3D-gegevens uit elke richting. Ten tweede, Endrov, een Java-programma dat is ontworpen om beeldanalyse, data verwerking en annotatie van netwerken of tracks (onder andere) aan de hand van een uitgebreide plugin architectuur te voeren, met ImageJ plugin compatibiliteit 16. Het bevat meer dan 140 image-verwerking en een uitbreidbare gebruikersinterface in welk model en ruwe data afzonderlijk worden weergegeven. De broncode is te vinden op https://github.com/mahogny/Endrov. Ten derde PIVlab een MATLAB hulpmiddel voor digitale Particle Image Velocimetry dat de gebruiker toelaat om deeltjes vloeivelden 17 kwantitatief en kwalitatief te analyseren. Het gebruik van deze programma's vereist een MATLAB licentie die de Image Processing Toolbox (http://mathworks.com) omvat. PIVlab is een programma ontworpen om kwantitatief te beschrijven flow. Het berekent de snelheid distributie, magnitude, vorticiteit, divergentie of afschuiving binnen het paren of reeksen. Hiervoor is cross-correlatie kleine gebieden afbeeldingen (zogenaamde "passen" in het protocol) van een beeldpaar de meest waarschijnlijke deeltje verplaatsing ontlenen. Dit kruiscorrelatie levert een correlatiematrix die in de ruimte of frequentiedomein met behulp van rechtstreekse kruiscorrelatie of een snelle Fourier transformatie (FFT), respectievelijk kunnen worden geanalyseerd.
De apparatuur die hier gebruikt is een omgekeerde microscoop uitgerust met een Nipkow ('spinnen') disc, een EMCCD, 488 en 561 nm standaard solid-state lasers, en 20x lucht of 40x en 60x plannen / Apochromat olie- of water-immersie doelstellingen. Het is echter ook mogelijk om time-lapse imaging voeren met andere beeldvormende modaliteiten, bijvoorbeeld punt-, lijn- of blad-scanning laser microscopie gebaseerde multi-foton microscopie, en epi-fluorescentie microscopie gecombineerd met deconvolutie of gestructureerde verlichting. Het voordeel van een Nipkow schijfsysteem is de extreem snelle beeldacquisitie, vooral als een streamingmodus (continue beweging en scannen van het object in de z dimensie) beschikbaar. Bovendien, om de resolutie te verbeteren, kan een 1,5-voudige vergroot extender voor het EMCCD gebruiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van C. elegans embryo's voor Time-lapse Microscopie met Microbeads
- Transfer gravid volwassen wormen met behulp van een worm pick (platina draad) in een daling van de M9 buffer en schoon uit bacteriën door eerst krachtig roeren en vervolgens de overdracht van elke worm aan een aangrenzende druppel M9 met behulp van een wimpers gemonteerd op een tandenstoker / pipetpunt of gebruik een puntig glas capillair.
- Verdun de dispersie bevattende 20 urn diameter polystyreen kralen 10-voudig in M9-buffer (1 L M9 buffer bevat 3 g KH 2PO 4, 6 g Na 2 HPO 4, 5 g NaCl, en na autoclaafbehandeling (20 min, 120 ° C), voeg nog eens 1 ml van een 1 M MgSO4 oplossing).
- Wordt mondpipet ieder type dunne glazen capillair (bijvoorbeeld smeltpunt capillairen of capillairen gebruikt voor injectienaalden trekken), een ongeveer 0,5 m lang stuk rubber, siliconen of soortgelijk materiaal buis (idealiter transparant), een 200 glpipetpunt, het deksel van een 200 pi PCR-buis, een hydrofoob filter voor kleine spuiten (bv., een 0,2-0,45 urn poriegrootte en 15-50 mm diameter nylon, PTFE of gelijkaardig materiaal filter) en een 1000 pi pipetpunt . Deze vorm van de mond pipet zorgt ervoor dat geen biologisch materiaal in contact kunnen komen met de experimentator.
- Monteer de pipet aan door de 200 ul pipetpunt met de punt naar voren in de buis en sluit met het deksel van een PCR-buis met een centrale perforatie die overeenkomt met de diameter van het capillair gebruikte heeft. Een wees priem of preparaat naald kan worden gebruikt om de perforatie te genereren.
- Teken een dunne capillaire en plaats deze in de perforatie. Plaats de filter in het andere uiteinde van de slang en plaats een 1000 pi pipetpunt als mondstuk (figuur 1).
- Ontleden zwangere volwassenen door te snijden wormen dwars op de vulva met een schone scheermesje of scalpel.
OPMERKING: Meestal zal veel embryo's zijn expulsed na het snijden. Echter, als vroege embryo's nodig zijn, ze soms moeten worden vrijgesteld van het karkas met behulp van een wimpers of puntige naald. - Pipet een druppel van de verdunde polystyreenparel dispersie (~ 4 pl) op een 24x60 mm dekglas en overdracht van embryo's in deze daling via de mond pipet.
- Plaats voorzichtig een kleine (bijvoorbeeld 18x18 of 20x20 mm) te dekken glas op de top van de drop en zorg ervoor dat de daling volledig verspreid.
OPMERKING: De daling moet ook voldoende klein zijn niet om de randen van de kleine dekglas raken. - Verzegeling van de berg met vloeibare vaseline. Voeg een druppel immersie olie op de 24x60 mm dekglas kant en ga verder met de sectie 'Time-lapse Microscopie'.
2. Voorbereiding van Adult C. elegans Dieren voor Time-lapse Microscopie met Nanobeads
LET OP: In het algemeen is het protocol voor het monteren van volwassen dieren is een aanpassing van het protocol van de ref. 18.Met dit protocol is het mogelijk om lange termijn time-lapse confocale microscopie van volwassen dieren voeren.
- Bereid een 1,5% (w / v) agarose oplossing in M9 buffer, kook (1 min, 100 ° C in een waterbad of microgolf). Het gebruik van hogere concentraties agarose wordt niet aanbevolen, aangezien dit kan leiden tot extrusie van de darm en / of delen van de gonaden.
- Stok neer 2-3 lagen van de band op twee microscoopglaasjes elk. Plaats een dia zonder band tussen de twee dia's met tape.
- Gebruik een pipet en plaats een druppel hete agarose oplossing in het midden van de middelste schuif. Plaats snel andere dia naar de druppel zodat het wordt ondersteund door de tape lagen aan elke kant. Dit zal een ronde en platte agar pad van ongeveer 10 mm diameter maken.
- Een druppel 100 nm bead oplossing (onverdunde, die 2,6% (w / v)) op het kussen. Transfer 10/01 schoongemaakt volwassen wormen in de drop met een worm pick. Seal met 18x18 mm dekglas en vaseline zoals uitgelegd in Protocol 1.
3. Time-lapse microscopie
- Doe een druppel immersie olie op de microscoop dia of het deksel glas sandwich. Gebruik brightfield bij een lage vergroting (5x of 10x lenzen) om het monster te lokaliseren.
OPMERKING: Beperk de blootstelling aan blauw licht zoveel mogelijk (in het bijzonder voor C. elegans embryo's), bijvoorbeeld, maken geen gebruik van epi-fluorescentie microscopie te vinden / concentreren van het model, maar in plaats daarvan gebruiken helderveld. - Wissel naar hogere vergroting (40x of 60x doelstellingen), breng het monster in beeld (hetzij middenvlak of boven / onder vlakken van het monster, afhankelijk van de acquisitie software).
- Stel de sampling intervallen tot 30 vliegtuigen op 1 micrometer tussenruimte opgenomen elke 1min. Indien een automatische xy of xyz-stadium beschikbaar is, kunnen meerdere plekken worden opgenomen in een sessie. Schakelen naar fluorescentie beeldvorming en controleer de scherpstelling nogmaals.
OPMERKING: Probeer te voorkomen dat het gebruik van hoge laser bevoegdheden, gebruik liever iets langere belichtingstijdenbij zeer lage intensiteit. Maatregel verkregen beelden meteen, hetzij in het beeld acquisitie programma of in ImageJ tot verzadiging, welke gewassen de dynamiek variëren vermijden en betekent ook dat overmatige blootstelling aan straling. - Start de opname van de time-lapse-serie.
OPMERKING: Om het analyseren van artefacten uit te sluiten, te beginnen met een lange (3-10 min) tijdsintervallen tussen sample scannen en geleidelijk te verhogen temporele bemonstering op de gewenste tijdstippen. Ontwikkelingstiming en eindpunten in beide gevallen gelijk te zijn bij het uitvoeren van een statistische analyse. Bovendien is het vaak noodzakelijk om fototoxiciteit overlevingskansen beoordelen. Daarom herstellen exemplaar uit de berg na langdurige time-lapse microscopie en controleren of ze blijven om live te ontwikkelen /.
4. Het reconstrueren van een 3D-Cell Shape model met IMOD
OPMERKING: IMOD software is beschikbaar op de IMOD webpagina: http://bio3d.colorado.edu/imod/. De installatie van de software is te beschrijvend daar. Bij het gebruik van Windows-besturingssysteem, een Unix-toolkit moet worden geïnstalleerd, die ook kan worden gevonden als een pakket op de IMOD webpagina. Bovendien is er een uitstekend samengesteld 3dmod introductie op de IMOD webpagina (http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html).
- Open de Unix shell en type in "IMOD". Het venster IMOD wordt geopend. Selecteer het bestand met de ruwe gegevens (idealiter een gestapelde tif of dergelijke) om een 3D-model te genereren.
- Zoek de onderkant en bovenkant van de objecten in het venster zap met behulp van de informatie venster (up & down scrolling tool).
- Start het opsporen van de cel contouren. Belangrijker is, ervoor te zorgen dat elke cel is een object. Begin met het bovenvlak van elke cel en maak de eerste contouren zijn er met behulp van de informatie-venster. Scroll naar beneden in z en maak een nieuwe contour voor elk z-vlak.
- Doe hetzelfde voor zoveel cellen als nodig te modelleren in 3D. Vergeet niet om een nieuw object te maken bij het starten met een nieuwe cel.
NOTE: Er zijn veel verschillende manieren voor contour tracing en diverse behulpzaam plugins. Bezoek de IMOD webpagina en online tutorials voor details. In de hier getoonde geval is de standaardinstelling gebruikt. - Open het venster "Model View" om de objecten en hun contouren te inspecteren.
- In de "Model View" werkbalk kies "Edit" - "objecten". De respectieve bewerken venster wordt geopend.
- Modelleren cellen als gevuld en gesloten objecten, kies "Netwerk" als "Trek Data Type" en "Fill" als "Stijl van de Tekening". Klik op "Meshing" in de scrollable selectie in de linker benedenhoek van het venster. Controleer de optie "Cap" in de selectie bij de lagere rechter. Controleer zoveel objecten als nodig is en klik op "All Mesh". Het programma vaste voorwerpen uit de stapels contouren genereren. De z-bemonstering factor kan worden ingesteld door het veranderen van "Z-schaal" in het venster "View".
- Move / draaien van de 3D bezwaart ("Edit" - "View") en op te slaan foto's of films ("File" - "Snap Tiff als ..." of "Movie / Montage").
5. Tracking fluorescent gelabelde Structuren met Endrov
OPMERKING: Om de celdeling resten volgen, gebruik dan een stam met een nucleaire of plasmamembraan marker voor de cel identificatie (bv H2B, PH-PLC-D1) en een celdeling overblijfsel marker (bijv NMy-2, ZEN-4 ). De nucleaire of plasmamembraan marker is belangrijk om te bepalen welke cel de celdeling overblijfsel erft.
- Voor het snel laden en het gebruiksgemak, de ruwe gegevens moeten worden omgezet in een tiff-bestand (bijvoorbeeld in ImageJ). Vervolgens openen Endrov en laad het bestand te analyseren door te kiezen voor de "Load file" optie in het menu bestand. Klik op het icoon "2D-viewer" op de werkbalk.
- Pas het histogram door te klikken op het pictogram "Fit range" (de blauwe icoon in de rechter benedenhoekvan het scherm Endrov). Stel de XYZ-resolutie door te gaan naar "Data" - "bestandsnaam" - "afbeeldingset" - "Kanaal" - "Set XYZ-resolutie". Typ waarden van X, Y en Z, bijvoorbeeld, 5, 5, 1 indien X en Y resolutie is 0,2 urn en 1 urn monsters elk in Z.
- Voor annoteren de kernen, te verplaatsen naar het vlak van de rente en klik op "2D-viewer". Selecteer "Lineage" uit het dropdown menu en kies "Nieuwe lijn".
- Door te klikken en te slepen op de kern, kan het worden gemarkeerd. Naar de kern te noemen, klik met de rechtermuisknop en kies "Rename deeltje" uit het dropdown menu. Te verhogen of de diameter van de cirkel te verlagen, sleept u de pijl die aan de linkerzijde van de gemarkeerde cirkel verschijnt. Aan het centrale vlak van de kern te markeren, klikt u op het juiste pictogram. Bij gebruik van een plasmamembraan marker kan een grote bol getrokken dat de meeste cellen zullen dekken.
- Om verder te gaan in de tijd en het vliegtuig, kies dan de "Frame" en "Z"opties op de onderste werkbalk. Na het gaan naar de volgende keer punt, pas de positie of de grootte van de cirkel die de kern vormt dienovereenkomstig. Herhaal dit tot de gevolgde cel deelt.
- Wanneer er sprake is van een celdeling, markeren de dochter kernen en over te schakelen naar "Lineage kijker". Dit kan worden geselecteerd door te klikken op het pictogram "Windows" op de bovenste werkbalk. Markeer alle drie kernen tegelijk, gaat u naar de optie "Lineage" in de werkbalk en kies "Associate ouder".
- Wanneer cell tracking klaar is, over te schakelen naar het kanaal te markeren van de celdeling overblijfsel voor tracking. Om kanalen te schakelen, klikt u op de naam van het bestand op de linker benedenhoek van de werkbalk. De celdeling restant (of andere structuren) kunnen worden gevolgd zoals hierboven beschreven voor de kern.
- Bij terugkeer naar de software na sluiting, is het nodig om naar "2D Viewer" - "Lineage" - "Edit" en op het geslacht nummer dat wordt bewerkt.
6. Het analyseren Cortical actomyosine Flow met PIVlab
OPMERKING: PIVlab is een vrij beschikbare software van: http://pivlab.blogspot.de/; kan vanuit het Matlab command line omgeving worden ingeroepen door het intikken PIVlab_GUI. Bij het werken met PIVlab, is het raadzaam om het beeld-serie in een aparte map op te slaan.
- Start een nieuwe sessie van het menu "Bestand". Laad de beeldbestanden door te klikken op de "Afbeeldingen laden" knop.
- Selecteer de sequencing stijl 1-2, 2-3, ... en navigeer naar de map met de volgorde van de gewenste beelden bevat. Selecteer de beelden en klik op de knop 'Toevoegen' en import.
- Ga naar 'Analyses instellingen "en selecteer" uitsluitingen (ROI, Mask) ". U kunt ook op 'Ctrl + E ". Met de toets "Draw masker (en) voor huidige frame" aan het ongewenste gedeelte van het beeld / s (dat wil zeggen, gebied buiten embryo) inactiveren.
- Selecteer "PIV instellingen" frOM het menu "Analyses instellingen". U kunt ook op "Ctrl + S". Kies "FFT venster vervorming" als de gewenste PIV-algoritme.
OPMERKING: Fast Fourier transformatie (FFT) reduceert de rekentijd slechts wordt aanbevolen het signaal goed boven lawaai en indien de verplaatsing van de bestudeerde deeltjes niet groter is dan de helft van het gebied pas geanalyseerd (zie 6.5). - Voer de volgende waarden voor de drie passen, die het gebied van verhoor voor intensiteit kruis correlatie tussen opeenvolgende beelden zijn: Pass 1: Ondervraging oppervlakte van 64 pixels met een stap van 32 Pass 2: Ondervraging van 32 pixels met een stap van 16 . Selecteer "lineair" uit het venster vervorming drop-down menu. Kies Gauss 2 * 3-punts methode voor sub-pixel verplaatsing schatting.
- Selecteer "Analyseren!" Analyse van het menu en gebruik de knop "Analyseren alle frames" een analyse te beginnen.
- Voor nabewerking selecteren "Vector validatie" uit "; Bericht verwerking menu "en zet de standaarddeviatie (Stdev) filter drempel tot 7 en gelden voor alle frames.
- Kies "Leid parameters / gegevens te wijzigen" uit het menu "Plot". Selecteer "Vectors [px / Frame]" van dropdown menu. Pas de gladheid van vectoren en high-pass filter en gelden voor alle frames.
- Om gemiddelde vectoren van alle frames te berekenen, zet de "Gebruikte frames" tot 1: einde en klik op "Bereken gemiddelde vectoren" knop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door het gebruik van protocollen 2, 3, en 4, time-lapse beeldvorming van de geslachtsklieren in wild-type C. elegans volwassenen wordt uitgevoerd (stam OD58 (UNC-119 (ED3) III; ltIs38 [pAA1; pie-1 :: GFP :: PH (PLC1delta1) + unc-119 (+)]), het uitdrukken van een membraan marker uit een kiemlijn promotor ). Gericht op het begin van de gonade, wordt een 3D-model van de kiemcellen gegenereerd uit de data microscopie (figuur 2). Dit model maakt het mogelijk om veranderingen in celgrootte analyseren terwijl de cellen doorgang vormen de distale naar de proximale arm, onthult de ordening van de spil en de grootte van de contacten van afzonderlijke cellen aan de spil (zie ook http: //www.wormatlas. org / hermafrodiet / kiem% 20line / Germframeset.html).
Next, protocollen 1, 3 en 5 worden gebruikt om op lange termijn time-lapse microscopie van C. voeren elegans embryo's (stam CHP52 dat is een kruising van de stam RW10226 (UNC-119 (ED3) III; itIs37 [pie-1p :: mCherry :: H2B :: pie-1 3'UTR + unc-119 (+)]; stIs10226 [zijn 72-promotorHIS-24 :: mCherry translationele fusie met laat-858 3 'UTR + unc-119 (+)]) en de stam LP162 (Nmy-2 (CP13 [Nmy-2 :: GFP + LoxP]) I.). In deze stam is het mogelijk om beide kernen (via mCherry-histon-eiwitten) en celdeling restanten (via genomisch gemodificeerde niet-spier myosine II locus waarbij een GFP is in frame geïntegreerd via CRISPR / Cas9 technologie 19 volgen ) gelijktijdig bij het gebruik van twee kleuren time-lapse microscopie (Figuur 3, links panelen). Het verkregen door lineaging van beide structuren in Endrov modellen tonen de eerder beschreven stereotype patroon van celdeling overblijfsel erfenis 13,14. Bovendien is de lineaging data, de nummers voor elke cel en celdeling overblijfsel (figuur 3, rechter panelen) en de tijd van celdeling overblijfsel persistentie (gebaseerd op de NMy-2 GFP -signaal) en de correlatie met de cel divisie timing kan worden verkregen (<strong> Figuur 4, getoond voor alleen de ABA lijn). Bij gebruik van een plasmamembraan marker daarnaast is het ook mogelijk om het tijdstip van celdeling overblijfsel internalisatie observeren.
Tot slot, met behulp van de protocollen 1, 3 en 6, op korte termijn time-lapse microscopie met een hoge tijdsresolutie (5s intervallen tussen het opnemen van een z-stack) van corticale niet-spier myosine II (NMy-2 GFP) wordt uitgevoerd. De nadruk ligt hierbij op de verschillen in de dynamiek van corticale polariserende stroom door het vergelijken van deze stroom tussen wildtype embryo RNAi-verarmd de Rho GTPase activerend eiwit RGA-3 20,21. Vergelijkbaar met recente waarnemingen 22, vloeien in wildtype embryo voornamelijk langs de lengteas van de embryo (figuur 5, linker panelen), terwijl stroming in het RGA-3 RNAi embryo loodrecht op deze as. Dit is duidelijk uit overlappen opeenvolgende keer punten of van de PIV analysis (Figuur 5, bodempanelen).
Om deze verschillen te observeren, is het belangrijk om een sampling interval kiezen dat corticale stroom deeltjes ondubbelzinnig kan worden opgelost voor nauwkeurige interpretatie van gegevens. Kleinere tijdsintervallen (≤5 sec) wordt aanbevolen om grote verplaatsingen en ontbrekende vectoren voorkomen. Het venster ondervraging moet groot genoeg zijn om de grootte van de deeltjes te analyseren (corticaal granules) tegemoet te komen. Overlap tussen naburige ondervraging vensters mogelijk maakt de vector afstand verminderen en verhoogt het aantal vectoren in het rooster.
Figuur 1. Montage van een mond pipet Links:. Parts die nodig is om een mond pipet met filter monteren. Rechts:. De gemonteerde pipet aubklik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Een 3D-model van de gonade beurt regio Linksboven:. 3D projectie van een enkel tijdstip van time-lapse microscopie data. Boven midden en rechts: 3D-modellen van de microscopie data. Bottom:. Details van de cel-rachis contacten Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Tracking van kernen en celdeling restanten Links:. 3D-projecties van time-lapse microscopie data. Midden: Snapshots van het model verkregen uit het volgen van beide kernen (gekleurde bollen) en celdeling restanten (grijze bollen). Rechts: Snapshotsvan celdeling overblijfsel tracking. De paden voor de overblijfselen worden ook getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Cel en celdeling overblijfsel lijnen voor de Aba sublineage. Geslachten uit een representatief embryo worden getoond. Celdelingen worden gekenmerkt door pleinen. Elk vinkje komt overeen met 1 min. De celdeling resten werden vernoemd naar de dochters die voortvloeien uit de divisie waarin de rest wordt gegenereerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Analyse van corticale contractie stroom met PIV Top:. 3D projectie stills uit time-lapse microscopie dat de start (eerste rij) en einde (tweede rij) van het tijdvenster wordt gebruikt om de vector veld berekenen met PIVlab verbeelden. De derde rij panelen toont de overlay van alle tijdstippen van het tijdvenster. Bottom:. Vector gebieden verkregen door PIVlab Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1 -. Met betrekking tot 2. Een 3D-model van de gonade beurt regio Figuur De video begint met het scrollen door de gehele stack van vliegtuigen gebruikt om het segment van de cellen. Daarna 3D maximale projectie van de stack wordt getoond, gevolgd door de 3D-model videosegmentatie roteren rond de x en y-as (met en zonder spil de gesegmenteerde gonade's).
Video 2 - gerelateerd aan 3. Tracking van kernen en celdeling restanten Links Figuur: 3D projecties van time-lapse microscopie data.. Midden: De resultaten van het bijhouden van beide kernen (gekleurde bollen) en celdeling restanten (grijze bollen) model. Rechts: Celdeling resten en hun trajecten. Schaal bar = 10 micrometer.
_for_movie_with_PIV_data.mp4 "> Video 3 - gerelateerd aan Figuur 5. Analyse van corticale contractie stroom met PIV 3D maximale projectie time-lapse opnames van een representatieve wild-type en RGA-3 RNAi embryo gebruikt om de vector veld berekenen met PIVlab Schaal bar.. = 10 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Door middel van het volgen object in ontwikkeling, met name de nucleaire tracking, is het mogelijk geweest om de centrale patroonvorming mechanismen van C. helderen elegans embryogenese 1,23,24. Uitbreiding van deze strategie tot een hogere doorvoersnelheid, is onlangs onmogelijk geweest om extra patronen regels te ontdekken en voor te stellen een methode hoe patronen afleiden regels de novo 10. Voor veel mutanten, maar de precieze patroon defecten nog onbekend. De hier beschreven methoden zijn tools die instrumenteel in hun opheldering kunnen zijn. Belangrijker is, is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat, hoewel vele andere model systemen niet volgen van een onveranderlijke ontwikkeling zoals C. elegans, object volgen en analyseren van de kwantitatieve trackinggegevens is een essentieel instrument ontwikkelingsstoornissen mechanismen en mechanismen van ziekte te identificeren.
De hier getoonde werkwijzen zijn bijzonder geschikt in het geval waarin het ofwel ook zoueen uitdaging om meer complexe en / of zelf opgewekte softwareoplossingen, of gewoon te duur uit te voeren voor de uitvoering van commerciële software tools, respectievelijk. Belangrijk is dat de instrumenten besproken kan de onderzoeker te laden en zelfstandig instrument waarop ze werden opgenomen gegevens te analyseren. Bovendien, als proprietary beeldacquisitie software wordt gebruikt, ImageJ biedt de Bio-Formaten plugin die gegevens kunnen laden in proprietary formaten en ze opslaan in de standaard formaten (JPEG, TIFF).
Een kritische stap in alle protocollen die afhankelijk time lapse microscopie is om de juiste omstandigheden te kiezen om voldoende contrast in microscopiebeelden verkrijgen en, tegelijkertijd, voor straling die het monster verminderen. Dit is sterk afhankelijk van het type gebruikte microscoop en het algemeen wordt aanbevolen om snelle scantechnieken zoals draaiende schijf of enkel vlak verlichting microscopie gebruikt. Specifiek voor PIV van corticale dynamiek, oudere versies van point-scanningmicroscopen misschien te langzaam om het vastleggen van corticale signalen op een voldoende resolutie en snelheid te geldige analyses mogelijk te maken. Het is dus altijd essentieel voor de straling nauwkeurig evalueren en testen van de levensvatbaarheid van het preparaat. Bovendien, hoewel de protocollen besproken gebruiken micobeads om embryo's te monteren, is het ook mogelijk om agarose pads, die net duurt iets langer te bereiden, maar is minder duur en met enige ervaring even reproduceerbaar gebruiken. Er moet echter worden opgemerkt dat de combinatie van agarose pad en nanobeads is de superieure werkwijze voor langdurige immobilisatie van volwassen wormen aangezien het vermijdt het gebruik van elke verlammende middel, bijvoorbeeld levamisol.
Er zij opgemerkt dat de besproken instrumenten hun beperkingen omdat ze niet volledig geautomatiseerde data analyse. Echter, voor structuren zoals celdeling resten, is het vaak een uitdaging om een moleculaire marker die alleen is te identificerenbevat deze structuur, die cruciaal is voor een betrouwbare tracking. Een belangrijke uitdaging voor de toekomst ligt dus in het opnemen van functies, zoals machine learning en aanpasbaar detectie / segmentatie algoritmen in de eenvoudig te gebruiken en open toegang software die we hier bespreken. Sommige van deze functies kunnen worden gevonden in andere softwaremodules, met name software die herhaaldelijke volgen over langere tijdsintervallen, of die grote reeksen conversiegegevens (bijv StarryNite / AceTree 25 of Nucleitracker4D 26, die bedoeld zijn ter vergelijking spoor kernen met behulp van histon-fusie-eiwitten of spindels 27, of Simi BioCell 28). Deze tools kunnen meer complexe uit te voeren wanneer die gericht zijn op het volgen van andere dan kernen structuren. Niettegenstaande de bijzondere structuur die moeten worden gevolgd, deze programma's zijn over het algemeen zeer nuttig wanneer grote hoeveelheden beeldgegevens zullen worden geanalyseerd. Belangrijk is compatibiliteit tussen de betreffende software modules.
Bij het werken met andere modelsystemen (bijvoorbeeld vlieg embryo, zoogdiercellen gekweekte cellen, enz.), De hier gepresenteerde werkwijzen zijn ook geschikt voor orthologe structuren volgen zoals hierboven beschreven. Belangrijker is onafhankelijk van het modelsysteem onderzochte verschillende subcellulaire structuren, bijvoorbeeld centrosomes, nucleoli, microdeeltjes, blaasjes, enz. Kunnen gemakkelijk worden gevolgd, alleen de acquisitie parameters moeten worden aangepast om volledig vangen van object tracks waarborgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Motic/VWR | OT4005S | Stereo microscope for dissection and mounting |
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 18329 | Embryo mounting |
| 20 µm | |||
| Polybead Polystyrene Microspheres, | Polysciences | 876 | Adult animal mounting |
| 0.1 µm | |||
| Microscope slides | VWR | 631-0902 | Adult animal mounting |
| Cover glass 18x18 mm | VWR | 631-1331 | Embryo/adult mounting |
| Cover glass 24x60 mm | VWR | 631-1339 | Embryo mounting |
| Scalpel | VWR | 233-5455 | Embryo dissection |
| Silicone tubing | VWR | 228-1501 | Tubing for mouth pipette |
| 30 mm PTFE membrane filter | NeoLab | Jul-01 | Filter for mouth pipette |
| Capillary tubes | VWR | 621-0003 | Pipette tip for mouth pipette |
| Vaseline | Roth | E746.1 | Embryo/adult mounting |
| Agar | Roth | 5210.5 | Adult animal mounting |
| Potassium-di-hydrogenphosphate | Roth | P018.2 | M9 buffer |
| Di-sodium- hydrogenphosphate | Roth | P030.2 | M9 buffer |
| Sodium chloride | Roth | 3957.1 | M9 buffer |
| VisiScope Spinning Disc Confocal System | Visitron Systems | n/a | Confocal microscopy |
References
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M. Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish. Science. 231 (4736), 365-368 (1986).
- Nishida, H. Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage. Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution. Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).
- Olivier, N., et al. Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy. Science. 329 (5994), 967-971 (2010).
- Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes. Cell. 146 (4), 568-581 (2011).
- Schrödel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light. Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).
- Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis. Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).
- Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).
- He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation. Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans. Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).
- Singh, D., Pohl, C. A function for the midbody remnant in embryonic patterning. Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).
- Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., Bürglin, T. R. Endrov: an integrated platform for image analysis. Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).
- Thielicke, W., Stamhuis, E. J. PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB. Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).
- Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization. PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).
- Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans. Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).
- Naganathan, S. R., Fürthauer, S., Nishikawa, M., Jülicher, F., Grill, S. W. Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking. Elife. 3, e04165 (2014).
- Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans. Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).
- Schnabel, R., et al. Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation. Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).
- Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree. Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).
- Giurumescu, C. A., et al. Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos. Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).
- Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans. Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).
- Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification. Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).
