Abstract
Preparazione degli spread dei cromosomi è un prerequisito per la performance di successo di ibridazione in situ fluorescente (FISH). Preparazione di alta qualità spread pianta cromosomiche è difficile a causa della parete cellulare rigida. Uno dei metodi approvati per la preparazione di cromosomi pianta è una cosiddetta preparazione goccia, noto anche come ripartizione goccia o tecnica aria di essiccazione. Qui, presentiamo un protocollo per la preparazione rapida del cromosoma mitotica diffonde adatto al rilevamento di FISH sonde singole e alte DNA copia. Questo metodo è una migliore variante del metodo goccia aria secca eseguita sotto un'umidità relativa del 50% -55%. Questo protocollo comprende un numero ridotto di fasi di lavaggio rendendo l'applicazione facile, efficiente e riproducibile. Evidenti vantaggi di questo approccio sono ben distribuite, non danneggiati e numerosi cromosomi in metafase che servono come presupposto ideale per l'analisi FISH successo. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto cromato di alta qualitàosome spread e risultati FISH riproducibili per Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
Introduction
Ibridazione in situ fluorescente (FISH) è uno strumento efficace per la mappatura fisica delle sequenze singole e alta copia a livello cromosomico. Il presupposto è la preparazione degli spread cromosomiche di alta qualità. Non c'è cromosoma protocollo preparazione generale che sarebbe ugualmente adatto per cellule animali e vegetali. Preparazione dei cromosomi vegetali è particolarmente difficile a causa della parete cellulare rigida e vari coerenza citoplasma in specie diverse. Uno dei metodi favorevoli per la preparazione di cromosomi pianta è una tecnica cosiddetta goccia anche noto come tecnica di diffusione drop e asciugatura all'aria tecnica 1,2. Questo metodo è stato introdotto nel 1958 da Rothfels e Siminovitch per in vitro cellule di mammifero coltivate 3. Successivamente Martin et al. 4 e Kato et al. 5 adattato questo metodo per le piante.
Più di recente, un metodo denominato 'SteamDrop &# 39; stato sviluppato che utilizzava vapore acqueo per la preparazione di cromosomi non sovrapposti 6. Anche se, l'influenza positiva di elevata umidità è stato osservato in precedenza 7, 'SteamDrop' offre un flusso di lavoro controllata di preparati cromosomici di alta qualità 6. Il trattamento a vapore provoca stiramento dei cromosomi, probabilmente legati ad alcune modifiche di proteine cromosomiche. La qualità del risultato spread metafase è molto alta, anche se di contenimento del numero sufficiente di completo metafase si diffonde per le successive esperimenti di FISH richiede competenze tecniche.
Qui vi presentiamo un protocollo per la preparazione di cromosomi mitotici di cereali adatti per la rilevazione FISH di singoli e di alta copia sonde 5,8. Questo metodo è una migliore variante del metodo caduta asciugare descritto da Kato 9 eseguita sotto umidità relativa del 50% -55% (Figura 1). Questo protocollo comprende un numero ridottodi fasi di lavaggio rendendo l'applicazione facile, efficiente e riproducibile. Usando questo protocollo abbiamo ottenuto spread cromosomiche di alta qualità e risultati FISH per Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
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Protocol
1. Cromosoma Preparazione
- Germinazione dei semi e la fissazione di apici radicali
- Germinare 10-20 semi di orzo su due strati di carta da filtro umida in una capsula di Petri in condizioni di oscurità per 2 giorni a 22-24 ° C. Tagliare radici vigorose con la lunghezza di 1-2 cm dal seme usando una lama di rasoio.
- Preparare acqua ghiacciata mettendo una bottiglia di vetro da 500 ml contenente acqua di rubinetto fredda nel ghiaccio tritato-acqua. Aerare l'acqua ghiacciata e immergere apici radicali per 20 ore di aumentare la frequenza di cellule in metafase.
- Trasferire radici da acqua a 50 ml di etanolo: acido acetico (3: 1) fissativo fissarli a temperatura ambiente per 2 giorni. Conservare radici in etanolo appena preparato: acido acetico (3: 1) fissativo a 4 ° C fino al momento dell'uso fino ad un anno.
- Lavaggio e trattamento enzimatico
- Lavare le 10-20 radici con 30 ml acqua di rubinetto ghiacciata per 5 minuti due volte con un bicchiere di vetro da 50 ml. Utilizzare microscopio binoculare. Trasferire radici uno per uno in30 ml di 0,01 M tampone citrato (0,01 M di acido citrico + 0,01 M sodio citrato, pH 4.8) con pinze e lavare agitando il bicchiere di vetro per 5 minuti due volte. Posizionare radici su carta da filtro per rimuovere completamente il liquido e cut-off non-tessuto meristematico indesiderato usando una lama di rasoio.
- Incubare fino a 20 apici radicali in miscela enzimatica 1 ml a 37 ° C per circa 50 minuti per ammorbidire i tessuti vegetali (Tabella 1) in un vetro da orologio. Miscela enzimatico contiene 0,7% cellulasi R10, 0,7% cellulasi, 1% e 1% pectolyase cytohelicase diluito in tampone citrato 0,01 M. Conservare la miscela enzimatica a -20 ° C e riutilizzati fino a cinque volte.
- Rimuovere l'enzima pipettando e lavare le punte delle radici su ghiaccio con 5 ml di 0,01 M tampone citrato due volte per sostituire l'enzima residuale.
- Root macerazione
- Apici radicali Lavare con 1 ml di etanolo al 96% per due volte con attenzione nello stesso vetro dell'orologio. Sostituire etanolo con appena preparato fissativo (75% di acido acetico: 25% etanolo). Usa 10-15fissativo pl per punta della radice.
- Apici radicali trasferimento insieme al fissatore in un tubo da 2 ml e disintegrare meristemi radice con un ago da dissezione o pinze. Premere il tubo 20 volte per risospendere le cellule per ottenere una sospensione di cellule. Conservare la sospensione cellulare a -20 ° C fino a due mesi.
- Cadute di sospensione cellulare
- Mettere 2-3 strati di carta velina imbevuta di acqua su un piatto caldo a 50 ° C. Immergere i vetrini microscopici in acqua di rubinetto ghiacciata in frigo per 30 minuti. E posto scivola sulla parte superiore del tessuto di carta umida.
- Pipettare 7-10 ml di sospensione cellulare e inserirla da una distanza di 20 cm sul vetrino raffreddata posto sulla piastra calda. Pipettare 10 ml di miscela di acidi acetico-etanolo nello stesso luogo come sospensione cellulare sul vetrino e mantenere la slitta sulla piastra calda per ulteriori 2 min. Posizionare il vetrino sulla piastra calda senza il tessuto bagnato e lasciare asciugare per 1 minuto.
- Controllo qualità e contene di diapositive
- Controllare diapositive utilizzando un microscopio a contrasto di fase per il controllo della qualità della diffusione cromosoma. Utilizzare vetrini sia lo stesso giorno o deposito immergendo in 96% di etanolo in una vaschetta Coplin a -20 ° C.
- Il pretrattamento di diapositive prima FISH; tutte le fasi vengono eseguite a temperatura ambiente
- Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 50 ml di 2x SSC (20x SSC contiene 3 M di NaCl e 300 mm citrato trisodico) per 5 min. Utilizzando pinze, trasferimento vetrini in una vaschetta Coplin contenente 50 ml di 45% di acido acetico per 3-10 min.
- Trasferire i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 50 ml di 2x SSC per 10 min. Trasferire i vetrini ad una vaschetta Coplin contenente 50 ml di formaldeide al 4% (in 2x SSC) e immergere i vetrini per 10 minuti per riparare i cromosomi.
- Rimuovere formaldeide risciacquando i vetrini 3 volte per 4 min ciascuno, in una vaschetta Coplin contenente 50 ml 2x SSC. Disidratare i vetrini in una vaschetta Coplin per 2 min in serie di 70%, 90% e 100% etanolo, rispettivamente, e scorre secco in verticaleposizione.
2. ibridazione in situ fluorescente (FISH)
- Per ciascun vetrino, preparare una soluzione di ibridazione di 20 microlitri in totale utilizzando 10 ml di formammide deionizzata, 5 ml di tampone 4x ibridazione (200 microlitri di buffer contiene 80 microlitri 20x SSC, 8 microlitri 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 microlitri 0,5 M EDTA, 11.2 ml 10 mg / mL di sperma di salmone e acqua priva di DNasi 99,2 ml), 3 ml di sonda e 2 ml di acqua priva di DNasi.
- Aggiungere 20 ml di soluzione di ibridazione per vetrino e coprire con un vetrino 24 x 32 mm ed arrestare la polizza di copertura con il cemento di gomma. Denaturare vetrini con sonde contemporaneamente a 80 ° C per 2 min su una piastra calda.
- Trasferire i vetrini in una camera umida e incubare i vetrini a 37 ° CO / N luce evitando. Rimuovere vetrini risciacquando i vetrini in una vaschetta Coplin con SSC 2x. Collocare i vetrini in una vaschetta Coplin contenente 55-60 ° C 2x SSC e incubare per 20 min.
- Porre i vetrini a 2x SSC in una vaschetta Coplin per 2 minuti a temperatura ambiente. Disidratare i vetrini in una vaschetta Coplin per 2 min in serie di 70%, 90% e 100% etanolo, rispettivamente.
- Asciugare le diapositive e di contrasto con 1 mg / ml di 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) in antifade mezzo di montaggio, evitare la luce intensa.
3. Analisi microscopica e bagagli
- Analizzare le diapositive utilizzando un microscopio a epifluorescenza. La selezione di filtro dipende dalla fluorocromo usato per la marcatura della sonda. Se necessario, conservare i vetrini a 4 ° C in condizioni di oscurità fino a un anno.
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Representative Results
Preparati microscopici con spread metafase mitotico sono stati preparati dalla caduta cromosoma metodo rapido di preparazione asciugare sopra descritto (Suppl. Figura 1). Analisi FISH è stata condotta utilizzando sia, sequenze ripetitive e singola copia. Le immagini sono state ottenute con un microscopio a epifluorescenza dotato di una serie di filtri che permettono di eccitazione di fluorofori corrispondenti e catturato da una telecamera CCD monocromatica ad alta sensibilità. Per l'acquisizione di immagini è stato utilizzato un computer con un software di acquisizione immagini. I risultati degli esperimenti di FISH su cromosomi in metafase mitotica utilizzando 5S rDNA, [CTT] 10, e le sonde singola copia erano distinte e di alta qualità per Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (Figura 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale (Figura 2D). Evidenti vantaggi di questo approccio sono ben diffusa, non danneggiato e numerose incontrato cromosomi aphase servono come presupposto ideale per l'analisi FISH successo. È possibile memorizzare la sospensione cellulare a -20 ° C fino a due mesi e per preparare il cromosoma diffonde il giorno dell'esperimento FISH. Appena vetrini preparati possono essere anche conservati a -20 ° C in 96% di etanolo, anche se abbiamo osservato che la qualità dei segnali di ibridazione su tali cromosomi è ridotto rispetto agli spread metafase preparati al momento. I metodi possono essere usati per preparare spread cromosomiche alta qualità in cereali in modo semplice, efficiente e riproducibile e molto probabilmente possono essere utilizzati in altre specie vegetali anche.
Figura 1. Un regime che descrive la procedura del metodo di preparazione dell'impianto caduta cromosoma aria secca.
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Figura 2. FISH sugli spread mitotico metafase cromosomiche di Hordeum vulgare, H. bulbosum e Secale cereale preparato secondo il metodo caduta asciugare all'aria. (A) H. vulgare con una sola sonda copia (FPct_40752) marcato con un colorante fluorescente rosso. (B) H. vulgare con sonda 5S rDNA etichettati da un colorante fluorescente verde. (C) H. bulbosum con CTT-microsatellite etichettati da un colorante fluorescente verde e (D) S. cereale con pSc119.2 ripetizione etichettati da un colorante fluorescente verde. Tutti i cromosomi sono stati di contrasto con DAPI (in rosso). Segnali FISH sono mostrati in giallo. Barra di scala = 10 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figuri.
Tabella 1. tempo di incubazione di trattamento enzimatico per le specie diverse.
Suppl. Figura 1. contrasto di fase e contrasto interferenziale differenziale (DIC) immagini di mitotico metafase spread cromosomi della pianta caduta metodo di preparazione cromosoma asciugare sull'esempio di Hordeum vulgare. (A) Immagine a contrasto di fase prese a 200 ingrandimenti e (B) immagine di contrasto di interferenza differenziale prese a 630X ingrandimento. Cliccatequi per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'esperimento preparazione cromosoma è stata effettuata utilizzando radici giovani di cereali appartenenti alla famiglia delle graminacee (Poaceae). Tutte le specie analizzate hanno 14 cromosomi in metafase relativamente lunga mitotico (11-15 micron) nel set genoma diploide e appartengono a specie di grande genoma (5,1-7,9 GBP).
Lunghezza di radici germinati non era più di 2 cm per ottenere un massimo di tessuti meristematici. Sincronizzazione di divisione delle cellule è stato raggiunto da un trattamento a lungo acqua ghiacciata 20 hr che ha migliorato la quantità di mitosi metafase 10.
Due passaggi sono importanti per la preparazione di preparati cromosomici di alta qualità: (I) l'umidità relativa del 50% -55% e (II) durata del trattamento enzimatico. Il primo punto è stato ottenuto posizionando tessuti carta bagnata su una piastra calda in prossimità dei vetrini. L'umidità relativa è stata misurata con un igrometro. L'umidità ottimale per la preparazione di piantecromosomi era simile alla umidità riportato da Kirov et al. 6. L'effetto positivo sulla qualità ottimale al cromosoma umidità relativa verifica da gonfiore del citoplasma e parete cellulare idrolisi.
La durata del trattamento enzimatico è specie dipendenti (Tabella 1). Il periodo di trattamento enzimatico dipende anche il lasso di tempo di innesto delle radici in etanolo / acido acetico e la dimensione delle radici. Le radici più lunghe sono stati conservati in fissativo (fino a 1 anno a 4 ° C), il tempo che impiega a digerire le radici per il buon grado. Materiale radice insufficientemente digerito è difficile macerare e aumenta il tempo totale di preparazione a causa della lunga macerazione. Inoltre, i cromosomi in metafase rimangono incorporati nel citoplasma che potrebbe ostacolare conseguente penetrazione della sonda durante l'esperimento FISH. D'altra parte over-digerito materiale può influenzare la struttura dei cromosomi stessi, e porta danni DNA per l'analisi FISH.
Un ulteriore fattore di miglioramento della preparazione è l'uso della seconda goccia di fissativo (3: 1, acido acetico / etanolo). Alta concentrazione di acido acetico in questa miscela stimola la digestione del citoplasma e promuove cromosoma diffusione in specie con grandi cromosomi. Riduzione citoplasma può avvenire anche dopo l'immobilizzazione dei cromosomi di diapositive. A tal fine, vetrini da microscopio che trasportano gli spread dei cromosomi possono essere incubate in acido acetico 45% a temperatura ambiente per 2-10 minuti a seconda del livello citoplasma. Controllo qualità di spread cromosomiche è stata eseguita con un microscopio a contrasto di fase senza colorazione complementare (ad esempio 1% aceto-carmin). Normalmente più di 25 vetrini contenenti spread cromosomiche alta qualità possono essere ottenuti da radici 20 utilizzando il metodo di cui sopra.
I risultati degli esperimenti di FISH su cromosomi in metafase mitotica utilizzando 5S rDNA, [CTT] 10, e 6 kb lungo Sonda singola copia (FPct_40752) erano distinti e di alta qualità per tutte le specie sopra descritte (figura 2). Evidenti vantaggi di questo approccio sono ben distribuite, non danneggiati e numerosi cromosomi in metafase che servono come presupposto ideale per l'analisi FISH successo. È possibile memorizzare la sospensione cellulare a -20 ° C fino a due mesi e per preparare il cromosoma diffonde il giorno dell'esperimento FISH. Appena vetrini preparati possono essere anche conservati a -20 ° C in 96% di etanolo, anche se abbiamo osservato che la qualità dei segnali di ibridazione su tali cromosomi è ridotto rispetto agli spread metafase preparati al momento.
Spread cromosomiche preparati con la tecnica rapida caduta asciugare erano adatte per FISH e sono state riprodotte un numero di volte. La combinazione di questo metodo di preparazione dei cromosomi con FISH potrebbe essere ampiamente applicata per esplorare l'organizzazione del genoma nelle piante, per esempio, per il cariotipo 11, chromosmappatura omal 12, in studi sintetici, e per l'integrazione di mappe fisiche e genetiche 13.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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