Abstract
Preparação dos spreads de cromossomos é um pré-requisito para o bom desempenho de hibridização fluorescente in situ (FISH). Preparação de alta qualidade para barrar planta cromossômicas é desafiador devido à parede celular rígida. Um dos métodos aprovados para a preparação dos cromossomas de plantas é uma preparação gota chamada, também conhecido como espalhando-gota ou técnica de secagem ao ar. Aqui, apresentamos um protocolo para a preparação rápida do cromossomo mitótico espalha adequado para a detecção de sondas de DNA FISH individuais e elevado número de cópias. Este método é uma variante melhorada do método de gota, seca ao ar realizada sob uma humidade relativa de 50% -55%. Este protocolo compreende um número reduzido de etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Óbvios benefícios desta abordagem são bem-propagação, cromossomos metafásicos não danificadas e numerosos que servem como pré-requisito perfeito para análise FISH bem sucedido. Usando este protocolo obtivemos chrom de alta qualidadeosome spreads e resultados PEIXES reprodutíveis para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
Introduction
Hibridização fluorescente in situ (FISH) é uma ferramenta eficaz para o mapeamento físico de sequências de cópia única e de alta no nível cromossômico. Pré-requisito é a preparação dos spreads de cromossomos de alta qualidade. Não existe um protocolo de preparação geral descrito cromossoma que seriam igualmente adequados para células animais e vegetais. Preparação dos cromossomas de plantas é particularmente difícil devido à rígida parede celular e vários consistência citoplasma dentro de espécies diferentes. Um dos métodos mais favoráveis para a preparação dos cromossomas de plantas é uma assim chamada técnica de gota também conhecida como técnica de espalhamento gota e a técnica de secagem ao ar 1,2. Este método foi introduzido pela primeira vez em 1958 por Rothfels e Siminovitch in vitro para células de mamíferos cultivadas 3. Mais tarde, Martin et al. 4 e Kato et al. 5 este método adaptado para plantas.
Mais recentemente, um método chamado '& SteamDrop# 39; foi desenvolvido o qual utilizado vapor de água para a preparação de cromossomas que não se sobrepõem 6. Embora, a influência positiva da alta umidade foi observado anteriormente 7, 'SteamDrop' oferece um fluxo de trabalho controlado de preparações cromossômicas de alta qualidade 6. O tratamento de vapor faz com que o alongamento de cromossomas, provavelmente ligados a algumas modificações de proteínas cromossómicas. A qualidade dos resultando metáfase é muito elevado, apesar de retenção de número suficiente de metaphase completa espalha para experimentos FISH subsequentes exige conhecimentos técnicos.
Aqui é apresentado um protocolo para a preparação dos cromossomas de cereais mitóticas adequados para a detecção de sondas FISH individuais e elevado número de cópias 5,8. Este método é uma variante melhorada do método de gotejamento, seca ao ar descrito por Kato 9 realizada sob uma humidade relativa de 50% -55% (Figura 1). Este protocolo compreende um número reduzidode etapas de lavagem fazendo sua fácil aplicação, eficiente e reprodutível. Usando este protocolo obtivemos os spreads de cromossomos de alta qualidade e os resultados peixe para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum e Secale cereale.
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Protocol
1. Preparação Chromosome
- A germinação das sementes e fixação de pontas de raiz
- 10-20 germinar sementes de cevada em duas camadas de papel de filtro húmido numa placa de Petri em condições escuras durante 2 dias a 22-24 ° C. Cortar raízes vigorosos com o comprimento de 1-2 cm a partir da semente, utilizando uma lâmina de barbear.
- Prepare água gelada, colocando uma garrafa de vidro de 500 ml contendo água fria da torneira em esmagado gelo-água. Arejar a água gelada e mergulhe dicas de raiz durante 20 horas para aumentar a freqüência de células em metafase.
- Transferir raízes a partir de água a 50 ml de etanol: ácido acético (3: 1) fixador para fixá-los à temperatura ambiente durante 2 dias. Armazenar em raízes recentemente preparada etanol: ácido acético (3: 1) fixador, a 4 ° C até à sua utilização até um ano.
- Lavar e tratamento enzima
- Lavam-se as raízes 10-20 com 30 ml de gelo-água fria da torneira durante 5 minutos duas vezes, utilizando uma proveta de vidro de 50 ml. Use microscópio binocular. Transferir raízes, um por um em30 ml de tampão 0,01 M de citrato (0,01 M de ácido cítrico + citrato de sódio 0,01 M, pH 4,8) usando uma pinça e lavar por agitação da proveta de vidro durante 5 min, duas vezes. Coloque raízes em papel de filtro para remover completamente o líquido e de corte do tecido meristemático não indesejada utilizando uma lâmina de barbear.
- Incubar até 20 pontas de raízes em 1 ml de mistura de enzima a 37 ° C durante cerca de 50 minutos para amaciar o tecido da planta (Tabela 1) em um vidro de relógio. Mistura enzimática contém 0.7% celulase R10, 0.7% celulase, 1% e 1% pectolyase cytohelicase diluída em tampão de citrato 0,01 M. Armazenar a mistura da enzima, a -20 ° C e reutilizado até cinco vezes.
- Remover a enzima por pipetagem e lavar as pontas de raiz em gelo com 5 ml de tampão de citrato 0,01 M, duas vezes para substituir a enzima residual.
- Maceração Root
- Pontas de raiz de lavagem com 1 ml de etanol a 96%, duas vezes cuidadosamente no mesmo vidro de relógio. Substituir etanol com fixador preparado de fresco (75% de ácido acético: etanol a 25%). Use 10-15fixador ul por ponta da raiz.
- Pontas de raiz de transferência juntamente com o fixador para um tubo de 2 mL e se desintegram meristemas da raiz com uma agulha de dissecação ou fórceps. Toque o tubo 20 vezes para as células re-suspensão para se obter uma suspensão de células. Armazenar a suspensão de células a -20 ° C até dois meses.
- Deixando cair da suspensão de células
- Coloque 2-3 camadas de tecido de papel embebido em água em uma placa quente a 50 ° C. Imergir as lâminas microscópicas na água gelada da torneira na geladeira por 30 minutos. E lugar desliza em cima do lenço de papel úmido.
- Pipeta 7-10 ul de suspensão celular e solte-o a uma distância de 20 cm para o slide arrefecida colocada sobre a placa quente. Pipeta 10 ml de mistura de ácido acético-etanol no mesmo lugar como suspensão de células no slide e manter a lâmina sobre a placa quente durante mais 2 min. Coloque o slide no prato quente sem o tecido molhado e deixe secar por 1 min.
- Controle de qualidade e de armazE de lâminas
- Verificar lâminas através de um microscópio de contraste de fase para controlar a qualidade da propagação cromossoma. Utilizar lâminas, quer no mesmo dia ou da loja por imersão em etanol a 96% em um frasco Coplin a -20 ° C.
- O pré-tratamento das lâminas antes FISH; todos os passos são realizados à TA
- Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo 50 ml de 2x SSC (20x SSC contém 3 M NaCl e 300 mM de citrato trissódico) por 5 min. Utilizando uma pinça, slides de transferência para uma jarra de Coplin contendo 50 ml de ácido acético 45% para 3-10 min.
- Transferir as lâminas para um frasco Coplin contendo 50 ml de SSC 2x durante 10 min. Lâminas de transferência para uma jarra de Coplin contendo 50 ml de formaldeído 4% (em 2x SSC) e mergulhe as lâminas por 10 min para corrigir cromossomos.
- Remover o formaldeído por lavagem das lâminas 3 vezes durante 4 min cada, num frasco Coplin contendo 50 ml de SSC 2X. Desidratar slides em uma jarra de Coplin por 2 min em séries de 70%, 90% e 100% de etanol, respectivamente, e lâminas secas no plano verticalposição.
2. fluorescente hibridação in situ (FISH)
- Para cada lâmina, preparar uma solução de hibridação de 20 ul, no total, utilizando 10 ul de formamida desionizada, 5 uL de tampão de 4x hibridação (ul de tampão 200 contém 80 ul de SSC 20x, 8 ul de 1 M de Tris-HCl pH 8,0, 1,6 mL de 0,5 M EDTA, 11,2 ul 10 mg / mL de esperma de salmão e 99,2 ul DNase-livre água), 3 ul da sonda e 2 mL de água livre de DNase.
- Adicionar 20 ml de solução de hibridação por lâmina e cobrir com uma lamela de 24 x 32 mm e prender a lamínula com cimento de borracha. Desnaturar lâminas com sondas simultaneamente a 80 ° C durante 2 minutos numa placa de aquecimento.
- Transferir as lâminas para uma câmara húmida e incubar a 37 ° CO / N evitando a luz. Remover lamelas enxaguando os slides em uma jarra de Coplin com 2x SSC. Colocar as lâminas em um frasco Coplin contendo 55-60 ° C 2x SSC e incubar por 20 min.
- Colocar as lâminas 2x SSC em um frasco Coplin durante 2 min à temperatura ambiente. Desidratar lâminas em um frasco Coplin durante 2 min em série de 70%, 90% e etanol a 100%, respectivamente.
- Secar as lâminas e contrastante com 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) em antifade meio de montagem, evitar a luz intensa.
3. A análise microscópica e armazenamento
- Analisar os slides usando um microscópio de epifluorescência. A seleção do filtro depende do fluorocromo utilizado para a rotulagem sonda. Se necessário, armazenar as lâminas a 4 ° C, no escuro, até um ano.
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Representative Results
Lâminas microscópicas com os diferenciais de mitose em metafase foram preparados pelo método de preparação rápida, seca ao ar de gotejamento cromossoma descrito acima (Supl. Figura 1). Análise dos peixes foi realizada utilizando ambos, seqüências repetitivas e de cópia única. As imagens foram obtidas através de um microscópio de epifluorescência, com um conjunto de filtros que permitem excitação de fluoróforos correspondentes e captada por uma câmara CCD monocromática de alta sensibilidade. Para a aquisição de imagens foi utilizado um computador com um software de aquisição de imagem. Os resultados dos experimentos FISH nos cromossomos metafásicos mitótico usando DNAr 5S, [CTT] 10, e sondas de cópia única foram distintas e de alta qualidade para Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (Figura 2C), H. marinum, H. murinum, H. Secale cereale e pubiflorum (Figura 2D). Óbvios benefícios desta abordagem são bem-propagação, sem danos e numerosas satisfeitas cromossomos aphase que servem como pré-requisito perfeito para análise FISH de sucesso. É possível armazenar a suspensão de células a -20 ° C até dois meses e para preparar o cromossoma espalha no dia da experiência FISH. Recentemente lâminas preparadas podem também ser armazenados a -20 ° C em etanol a 96%, no entanto observou-se que a qualidade dos sinais de hibridação de cromossomas em tais é reduzida em comparação com as metáfase recentemente preparados. Os métodos podem ser utilizados para preparar os spreads cromossoma de alta qualidade em cereais de uma forma fácil, eficiente e reprodutível e provavelmente podem ser usados em outras espécies de plantas demasiado.
Figura 1. Um esquema que descreve o processo da planta cair método de preparação cromossomo secar ao ar.
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Figura 2. FISH sobre os spreads mitótico metáfase de cromossomos de Hordeum vulgare, H. Secale cereale bulbosum e preparados pelo método de gotejamento seco ao ar. (A) H. vulgare com uma sonda única cópia (FPct_40752) marcada com um corante fluorescente vermelho. (B) H. vulgare com sonda de DNAr 5S marcado por um corante fluorescente verde. (C) H. bulbosum com os CTT-microssatélites marcados por um corante fluorescente verde e (D) S. cereale com repetição pSc119.2 marcado por um corante fluorescente verde. Todos os cromossomas foram contrastadas com DAPI (a vermelho). Sinais de FISH são mostrados em amarelo. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figuré.
Tabela 1. tempo de incubação de tratamento enzimático para diferentes espécies.
Suppl. Figura 1. de contraste de fase e contraste de interferência diferencial (DIC) imagens de mitótico metaphase os spreads de cromossomos da planta cair método de preparação cromossomo de ar seco sobre a exemplo de Hordeum vulgare. (A) Imagem de contraste de fase tomadas com uma ampliação de 200X e (B) imagem contraste de interferência diferencial tomada na ampliação 630X. Por favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O experimento cromossoma preparação foi levada a cabo usando raízes novas de cereais pertencentes à família das gramíneas (Poaceae). Todas as espécies analisadas têm 14 relativamente longo mitóticas cromossomos metafásicos (11-15 um) no conjunto de genoma diplóide e pertencem a espécies de grande genoma (5,1-7,9 GBP).
Comprimento de raízes germinadas não era mais do que 2 cm, para se obter um máximo de tecido meristemático. Sincronização de células em divisão foi atingido por um 20 horas de tratamento de água gelada tempo que melhorou a quantidade de mitótico metaphase espalha 10.
Dois passos são importantes para a preparação de preparações de cromossomas de alta qualidade: (I) a uma humidade relativa de 50% -55% e (II), duração do tratamento enzimático. O primeiro ponto foi alcançado pela colocação de tecidos de papel molhado numa placa de aquecimento na proximidade das lâminas de vidro. A humidade relativa foi medida com um higrómetro. A humidade ideal para a preparação de produtos vegetaiscromossomas foi semelhante à relatada por humidade Kirov et al. 6. O efeito positivo sobre a qualidade do cromossoma a uma humidade relativa óptima ocorre por inchaço da parede celular e do citoplasma de hidrólise.
A duração de tratamento enzimático é dependente espécies (Tabela 1). O período de tratamento enzimático também depende do intervalo de tempo de fixação das raízes em etanol / ácido acético e o tamanho das raízes. As raízes mais longas foram armazenadas no fixador (até 1 ano a 4 ° C), o que leva mais tempo a digerir raízes com o grau adequado. Material de raiz insuficientemente digerido é difícil de macerar e vai aumentar o tempo total de preparação como resultado de maceração de longa duração. Além disso, cromossomos metafásicos permanecer embutido no citoplasma que poderia dificultar a que se seguiu a penetração da sonda durante o experimento FISH. Por outro lado o material sobre-digerido podem influenciar a estrutura dos próprios cromossomas, e danos DN alvoUma análise de FISH para a.
Um factor adicional para o melhoramento da preparação é a utilização do segundo fixador de queda (3: 1, ácido acético / etanol). A alta concentração de ácido acético nesta mistura estimula a digestão do citoplasma e promove a difusão do cromossoma em espécies com grandes cromossomas. Redução citoplasma também pode ter lugar após a imobilização dos cromossomos em lâminas. Para este efeito, lâminas de microscópio que transportam os diferenciais de cromossomas podem ser incubadas em 45% de ácido acético à temperatura ambiente durante 2-10 minutos, dependendo do nível citoplasma. Verificação da qualidade das margens do cromossoma foi realizada com um microscópio de contraste de fase sem qualquer coloração suplementar (por exemplo, 1% de aceto-carmim). Normalmente mais de 25 lâminas contendo cromossoma barrar de alta qualidade pode ser obtida a partir de raízes 20 utilizando o método acima.
Os resultados dos experimentos FISH nos cromossomos metafásicos mitótico usando DNAr 5S, [CTT] 10, e 6 kb sonda longa de cópia única (FPct_40752) eram distintos e de alta qualidade para todas as espécies descritas acima (Figura 2). Óbvios benefícios desta abordagem são bem-propagação, cromossomos metafásicos não danificadas e numerosos que servem como pré-requisito perfeito para análise FISH bem sucedido. É possível armazenar a suspensão de células a -20 ° C até dois meses e para preparar o cromossoma espalha no dia da experiência FISH. Recentemente lâminas preparadas podem também ser armazenados a -20 ° C em etanol a 96%, no entanto observou-se que a qualidade dos sinais de hibridação de cromossomas em tais é reduzida em comparação com as metáfase recentemente preparados.
Os spreads cromossômicas preparados pela técnica de gotejamento de ar seco rápido eram adequadas para os peixes e foram reproduzidas várias vezes. Combinação do presente método de preparação do cromossoma com FISH pode ser amplamente aplicado para explorar a organização do genoma de plantas, por exemplo, para a cariotipagem 11, cromosmapeamento OMAL 12, em estudos de síntese, e para a integração dos mapas físicos e genéticos 13.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
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