Abstract
Preparación de extensiones de cromosomas es un requisito previo para el buen desarrollo de la hibridación in situ fluorescente (FISH). Preparación de alta calidad extensiones de cromosomas planta es un reto debido a la pared celular rígida. Uno de los métodos aprobados para la preparación de cromosomas de la planta es una preparación gota llamada, también conocido como gota de dispersión o la técnica de secado al aire. A continuación, presentamos un protocolo para la preparación rápida del cromosoma mitótico extiende adecuado para la detección FISH de sondas de ADN individuales y altos de copia. Este método es una variante mejorada del método de la gota de secado al aire se realiza bajo una humedad relativa de 50% -55%. Este protocolo se compone de un número reducido de etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. Obvios beneficios de este enfoque son bien extendidas, metafase los cromosomas intactos y numerosos que sirven como requisito previo perfecto para el análisis FISH éxito. El uso de este protocolo se obtuvo chrom de alta calidadOsome márgenes y resultados de FISH reproducibles para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.
Introduction
Hibridación in situ fluorescente (FISH) es una herramienta eficaz para el mapeo físico de las secuencias de copia única y altas a nivel cromosómico. Requisito previo es la preparación de extensiones de cromosomas de alta calidad. No hay cromosoma protocolo general de preparación que sería igualmente adecuado para células animales y vegetales. Preparación de cromosomas de la planta es particularmente difícil debido a la pared celular rígida y varios consistencia citoplasma dentro de diferentes especies. Uno de los métodos favorables para la preparación de cromosomas de la planta es una técnica de caída de llamada también conocida como técnica de la gota de dispersión y secado al aire técnica de 1,2. Este método fue introducido por primera vez en 1958 por Rothfels y Siminovitch para in vitro células de mamíferos cultivadas 3. Más tarde Martin et al., 4 y Kato et al. 5 adaptó este método para las plantas.
Más recientemente, un método llamado 'SteamDrop y# 39; fue desarrollado que utiliza vapor de agua para la preparación de cromosomas que no se solapan 6. Aunque, se observó la influencia positiva de la alta humedad anterior 7, 'SteamDrop' ofrece un flujo de trabajo controlado de preparaciones de cromosomas de alta calidad 6. El tratamiento de vapor provoca el estiramiento de los cromosomas probablemente conectados a algunas modificaciones de las proteínas cromosómicas. La calidad de los diferenciales de metafase resultante es muy alta, aunque de retención de número suficiente de metafase completa se extiende para posteriores experimentos de FISH exige conocimientos técnicos.
Aquí se presenta un protocolo para la preparación de los cromosomas mitóticos cereales adecuados para la detección de sondas FISH individuales y alta copia 5,8. Este método es una variante mejorada del método de goteo se seque al aire descrito por Kato 9 realizado bajo una humedad relativa de 50% -55% (Figura 1). Este protocolo comprende un número reducidode etapas de lavado que hace su aplicación fácil, eficiente y reproducible. El uso de este protocolo se obtuvieron extensiones de cromosomas de alta calidad y los resultados de FISH para Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cromosoma Preparación
- La germinación de semillas y fijación de puntas de las raíces
- 10-20 germinar semillas de cebada en dos capas de papel de filtro húmedo en una placa de Petri bajo condiciones de oscuridad durante 2 días a 22-24 ° C. Cortar las raíces vigorosas con la longitud de 1-2 cm de la semilla mediante el uso de una cuchilla de afeitar.
- Preparar agua helada mediante la colocación de una botella de vidrio de 500 ml que contiene agua fría del grifo en agua con hielo picado. Airear el agua helada y se sumerja puntas de las raíces durante 20 horas para aumentar la frecuencia de las células en metafase.
- Transferencia de raíces a partir de agua a 50 ml de etanol: ácido acético (3: 1) fijador para fijarlos a TA durante 2 días. Raíces Almacenar en etanol recién preparada: ácido acético (3: 1) fijador a 4 ° C hasta su uso hasta un año.
- Tratamiento de lavado y la enzima
- Lávese las 10-20 raíces con agua corriente helada 30 ml durante 5 minutos dos veces usando un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml. Utilice microscopio binocular. Transferencia raíces uno por uno en30 ml 0,01 M tampón citrato (0,01 M de ácido cítrico + 0,01 M de citrato de sodio, pH 4,8) utilizando pinzas y lavar agitando el vaso de vidrio durante 5 minutos dos veces. Coloque raíces sobre papel de filtro para eliminar el líquido por completo y de corte de tejido no meristemática no deseado usando una cuchilla de afeitar.
- Incubar hasta 20 puntas de las raíces en la mezcla de enzima 1 ml a 37 ° C durante aproximadamente 50 min para suavizar el tejido de la planta (Tabla 1) en un vidrio de reloj. Mezcla de enzimas contiene 0,7% R10 celulasa, 0,7% de celulasa, pectoliasa 1% y 1% citohelicasa diluido en tampón de citrato 0,01 M. Almacenar la mezcla de enzimas a -20 ° C y reutilizada hasta cinco veces.
- Retire la enzima con la pipeta y lavar las puntas de las raíces en el hielo con 5 ml de 0,01 M tampón citrato dos veces para reemplazar la enzima residual.
- Maceración Root
- Puntas de las raíces de lavado con 1 ml de etanol al 96% dos veces cuidadosamente en el mismo vidrio de reloj. Reemplazar con etanol recién preparada fijador (75% ácido acético: etanol 25%). Utilice 10-15fijador l por punta de la raíz.
- Puntas de las raíces de transferencia junto con el fijador en un tubo de 2 ml y se desintegran meristemos radiculares con una aguja o unas pinzas de disección. Toca el tubo 20 veces para resuspender las células para obtener una suspensión celular. Guarde la suspensión de células a -20 ° C hasta dos meses.
- Dropping de la suspensión celular
- Coloca 2-3 capas de tejido de papel empapada en agua en una placa caliente a 50 ° C. Sumerja diapositivas microscópicas en el agua del grifo helado en la nevera durante 30 minutos. Y el lugar se desliza en la parte superior del tejido de papel húmeda.
- Pipeta 7-10 l de suspensión celular y colóquelo a una distancia de 20 cm sobre el portaobjetos enfriado colocado en el plato caliente. Pipeta 10 l de mezcla de ácido acético-etanol en el mismo lugar que la suspensión de células en la diapositiva y mantener la diapositiva en el plato caliente durante otros 2 min. Colocar el portaobjetos en el plato caliente sin el tejido húmedo y deje que se seque durante 1 min.
- Control de calidad y storage de diapositivas
- Compruebe diapositivas utilizando un microscopio de contraste de fase para controlar la calidad de la difusión cromosoma. Utilice diapositivas o bien el mismo día o tienda por inmersión en etanol al 96% en un tarro Coplin a -20 ° C.
- Pretratamiento de diapositivas antes de FISH; todos los pasos se llevaron a cabo a RT
- Colocar los portaobjetos en un tarro de Coplin que contiene 50 ml de 2x SSC (20x SSC contiene 3 M NaCl y 300 mM de citrato trisódico) durante 5 min. Con unas pinzas, toboganes de transferencia a un tarro de Coplin que contiene 50 ml de ácido acético 45% para 3 a 10 min.
- Transferencia desliza a un frasco de Coplin que contiene 50 ml de 2x SSC durante 10 minutos. Diapositivas de transferencia a un frasco Coplin que contiene 50 ml de formaldehído al 4% (en 2x SSC) y sumergirse diapositivas durante 10 minutos para fijar los cromosomas.
- Retire formaldehído enjuagando las diapositivas 3 veces durante 4 minutos cada uno, en una jarra Coplin que contiene 50 ml 2x SSC. Deshidratar las diapositivas en una jarra Coplin durante 2 minutos en serie de 70%, 90% y etanol al 100%, respectivamente, y se desliza en seco en una línea verticalposición.
2. fluorescente hibridación in situ (FISH)
- Para cada diapositiva, preparar una solución de hibridación de 20 l en total utilizando 10 l de formamida desionizada, 5 l de tampón de hibridación 4x (200 l de tampón contiene 80 l de 20x SSC, 8 l 1 M Tris-HCl pH 8,0, 1,6 l 0,5 M EDTA, 11,2 l 10 g / l de esperma de salmón y 99,2 l de DNasa libre de agua), 3 l de la sonda y 2 l de agua libre de DNasa.
- Añadir 20 l de solución de hibridación por diapositiva y la tapa con un cubreobjetos de 24 x 32 mm y arrestar a la hoja de la cubierta con cemento de goma. Desnaturalizar diapositivas con sondas simultáneamente a 80 ° C durante 2 minutos en un plato caliente.
- Transferencia desliza a una cámara húmeda e incubar diapositivas a 37 ° CO / N luz evitando. Retire cubreobjetos enjuagando las diapositivas en un frasco Coplin con 2x SSC. Colocar los portaobjetos en un tarro de Coplin que contiene 55 a 60 ° C 2x SSC y se incuban durante 20 min.
- Colocar los portaobjetos a 2x SSC en un frasco Coplin durante 2 minutos a temperatura ambiente. Deshidratar portaobjetos en un tarro Coplin durante 2 minutos en serie de 70%, 90% y 100% de etanol, respectivamente.
- Seque las diapositivas y de contraste con 1 mg / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) en antifade medio de montaje, evitar la luz intensa.
3. Análisis microscópico y almacenamiento
- Analizar las diapositivas utilizando un microscopio de epifluorescencia. La selección de filtro depende de la fluorocromo utilizado para el marcaje de la sonda. Si es necesario, almacenar diapositivas a 4 ° C en condiciones de oscuridad hasta un año.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diapositivas microscópica con los diferenciales en metafase de la mitosis se prepararon por el método de preparación rápida secar al aire el cromosoma de goteo descrita anteriormente (Suppl. Figura 1). FISH análisis se llevó a cabo utilizando tanto, secuencias repetitivas y de una sola copia. Las imágenes se obtuvieron por un microscopio de epifluorescencia con un conjunto de filtros que permite la excitación de los fluoróforos correspondientes y capturados por una cámara CCD monocromo de alta sensibilidad. Para la adquisición de imágenes se utilizó un ordenador con un software de adquisición de imágenes. Los resultados de los experimentos de FISH en los cromosomas en metafase mitótica utilizando 5S rDNA, [CTT] 10, y las sondas de una sola copia eran distintos y de alta calidad para Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (Figura 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum y Secale cereale (Figura 2D). Obvios beneficios de este enfoque son bien extendidas, se reunió en buen estado y numerosos cromosomas aphase sirven como requisito previo perfecto para el análisis FISH éxito. Es posible almacenar la suspensión celular a -20 ° C hasta dos meses y para preparar el cromosoma se propaga en el día del experimento FISH. Recién portaobjetos preparados pueden ser también almacenadas a -20 ° C en etanol 96%, aunque se observó que la calidad de las señales de hibridación en tales cromosomas se reduce en comparación con los diferenciales en metafase recién preparados. Los métodos se pueden utilizar para preparar extensiones de cromosomas de alta calidad en los cereales de una manera fácil, eficiente y reproducible y lo más probable se pueden utilizar en otras especies de plantas también.
Figura 1. Un esquema que describe el procedimiento del método de preparación cromosoma de la planta de goteo se seque al aire.
en / ftp_upload / 53470 / 53470fig2.jpg "/>
Figura 2. FISH en los cromosomas en metafase mitótica diferenciales de Hordeum vulgare, H. bulbosum Secale cereale y preparado por el método de goteo se seque al aire. (A) H. vulgare con una única sonda de copia (FPct_40752) marcado con un colorante fluorescente de color rojo. (B) H. vulgare con sonda 5S rDNA etiquetado por un colorante fluorescente verde. (C) H. bulbosum con CTT-microsatélite etiquetado por un colorante fluorescente verde y (D) S. cereale con repetición pSc119.2 etiquetado por un colorante fluorescente verde. Todos los cromosomas se contratiñeron con DAPI (en rojo). Señales de FISH se muestran en amarillo. Barra de escala = 10 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure.
Tabla 1. Tiempo de Incubación de tratamiento enzimático para las diferentes especies.
Suppl. Figura 1. Fase contraste y contraste de interferencia diferencial (DIC) imágenes de metafase mitótica cromosoma diferenciales del método de preparación cromosoma de la planta de goteo se seque al aire en el ejemplo de Hordeum vulgare. (A) Imagen de contraste de fase tomada a 200X aumentos y (B) Imagen de contraste de interferencia diferencial llevado a un aumento de 630x. Por favor, haga clicaquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El experimento preparación cromosoma se ha llevado a cabo utilizando las raíces jóvenes de cereales pertenecientes a la familia de las gramíneas (Poaceae). Todas las especies analizadas tienen 14 cromosomas en metafase relativamente largo mitótico (11 a 15 micras) en el conjunto del genoma diploide y pertenecen a especies de gran genoma (05.01 a 07.09 GBP).
Longitud de raíces germinadas no era más de 2 cm para obtener un máximo de tejido meristemático. La sincronización de las células en división se realiza mediante un tratamiento de hielo-agua 20 hr larga que la mejora de la cantidad de metafase mitótica se extiende 10.
Dos pasos son importantes para la preparación de preparaciones de cromosomas de alta calidad: (I) la humedad relativa del 50% -55% y (II) la duración del tratamiento enzimático. El primer punto se logró mediante la colocación de los tejidos de papel húmedo en una placa caliente en la proximidad de los portaobjetos de vidrio. La humedad relativa se midió con un higrómetro. La humedad óptima para la preparación de la plantacromosomas fue similar a la reportada por la humedad Kirov et al. 6. El efecto positivo en la calidad cromosoma a una humedad relativa óptima se produce por la inflamación del citoplasma y la pared celular de hidrólisis.
La duración del tratamiento depende de la especie de la enzima (Tabla 1). El período de tratamiento enzimático también depende del intervalo de tiempo de la fijación de la raíz en etanol / ácido acético y el tamaño de las raíces. Las raíces más largas se almacenaron en el fijador (hasta 1 año a 4 ° C), más tiempo se tarda en digerir las raíces de grado apropiado. Material de raíz digerido insuficientemente es difícil para macerar y aumentará el tiempo total de preparación como resultado de la maceración larga duración. Por otra parte, los cromosomas en metafase permanecen incrustados en el citoplasma que podrían obstaculizar subsiguiente penetración de la sonda durante el experimento FISH. Por otro lado sobre-digerido material puede influir en la estructura de los propios cromosomas, y el objetivo daños DNUna para el análisis FISH.
Un factor adicional para la mejora de la preparación es el uso de la segunda gota de fijador (3: 1, ácido acético / etanol). La alta concentración de ácido acético en esta mezcla estimula la digestión de citoplasma y promueve la propagación de cromosoma en las especies con grandes cromosomas. Reducción citoplasma también puede tener lugar después de la inmovilización de los cromosomas en las diapositivas. Para este propósito portaobjetos de microscopio que llevan las extensiones de cromosomas se pueden incubar en ácido acético 45% a TA durante 2-10 min dependiendo del nivel de citoplasma. Verificación de la calidad de las extensiones de cromosomas se realizó con un microscopio de contraste de fases sin ninguna tinción complementaria (por ejemplo, 1% aceto-Carmin). Normalmente más de 25 portaobjetos que contenían extensiones de cromosomas de alta calidad se pueden obtener a partir de 20 raíces utilizando el método anterior.
Los resultados de los experimentos de FISH en los cromosomas en metafase mitótica utilizando 5S rDNA, [CTT] 10, y 6 kb larga sonda de copia única (FPct_40752) eran distintos y de alta calidad para todas las especies descritas anteriormente (Figura 2). Obvios beneficios de este enfoque son bien extendidas, metafase los cromosomas intactos y numerosos que sirven como requisito previo perfecto para el análisis FISH éxito. Es posible almacenar la suspensión celular a -20 ° C hasta dos meses y para preparar el cromosoma se propaga en el día del experimento FISH. Recién portaobjetos preparados pueden ser también almacenadas a -20 ° C en etanol 96%, aunque se observó que la calidad de las señales de hibridación en tales cromosomas se reduce en comparación con los diferenciales en metafase recién preparados.
Extensiones de cromosomas preparadas por la técnica rápida caída de secado al aire eran adecuados para los peces y se reprodujeron varias veces. La combinación de este método de preparación cromosoma con FISH podría ser ampliamente aplicada a explorar la organización del genoma en las plantas, por ejemplo, para la determinación del cariotipo 11, chromosmapeo omal 12, en los estudios de síntesis, y para la integración de mapas físicos y genéticos 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
