Abstract
Framställning av kromosom sprider är en förutsättning för ett framgångsrikt utförande av fluorescens in situ hybridisering (FISH). Framställning av högkvalitativa växtkromosom sprider är utmanande på grund av den styva cellväggen. En av de godkända förfaranden för framställning av växtkromosomer är en s.k. dropp-preparat, även känd som drop-spridning eller lufttorkningsteknik. Här presenterar vi ett protokoll för snabb beredning av mitotisk kromosom sprider lämplig för FISH detektion av enstaka och höga kopia DNA-sonder. Denna metod är en förbättrad variant av det lufttorra droppmetoden utförs under en relativ fuktighet av 50% -55%. Detta protokoll består av ett minskat antal tvättsteg gör sin ansökan enkelt, effektivt och reproducerbar. Uppenbara fördelarna med denna metod är väl spridda, oskadade och många metafaskromosomer tjänar som en perfekt förutsättning för en framgångsrik FISH-analys. Med hjälp av detta protokoll vi fått hög kvalitet kromosome spreadar och reproducerbara FISH resultat Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum och Secale cereale.
Introduction
Fluorescens in situ-hybridisering (FISH) är ett effektivt verktyg för fysikalisk kartläggning av enkel-och höga kopieringssekvenser på kromosomnivå. Förutsättning är framställningen av högkvalitativa kromosomspridningar. Det finns ingen allmän kromosom förberedelse protokoll som skulle vara lika bra för djur- och växtceller. Beredning av växt kromosomer är särskilt utmanande på grund av den stela cellväggen och olika cytoplasma enhetlighet inom olika arter. En av de gynnsamma förfaranden för framställning av växtkromosomer är en så kallad dropptekniken även känd som drop-spridningsteknik och lufttorkningsteknik 1,2. Denna metod introducerades för första gången 1958 av Rothfels och Siminovitch för in vitro odlade däggdjursceller 3. Senare Martin et al. 4 och et al. Kato 5 anpassat denna metod för växter.
Mer nyligen, en metod som heter "SteamDrop &# 39; utvecklades som använde vattenånga för framställning av icke-överlappande kromosomer 6. Även var den positiva inverkan av hög fuktighet observerats tidigare 7, "SteamDrop" levererar en kontrollerad arbetsflöde högkvalitativa kromosompreparat 6. Ångbehandlingen orsakar sträckning av kromosomer sannolikt kopplade till vissa ändringar av kromosomala proteiner. Kvaliteten på erhållna metafas sprider är mycket hög, även om kvarhållande av ett tillräckligt antal av kompletta metaspreadarna för efterföljande FISH experiment kräver teknisk expertis.
Här presenterar vi ett protokoll för framställning av mitotiska spannmåls kromosomer som lämpar sig för FISH detektion av enstaka och hög kopia sonder 5,8. Denna metod är en förbättrad variant av det lufttorra dropp metod som beskrivits av Kato 9 utförs under relativ fuktighet av 50% -55% (figur 1). Detta protokoll består av ett minskat antaltvättsteg gör sin ansökan enkelt, effektivt och reproducerbar. Med hjälp av detta protokoll vi fått högkvalitativa kromosom uppslag och FISH resultat för Hordeum vulgare, H. bulbosum, H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum och Secale cereale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kromosom Framställning
- Frögroning och fixering av rotspetsar
- Gro 10-20 korn frön på två lager av fuktigt filterpapper i en petriskål under mörka förhållanden i 2 dagar vid 22-24 ° C. Kapa kraftiga rötter med längden 1-2 cm från fröet genom att använda ett rakblad.
- Förbered iskallt vatten genom att placera en 500 ml glasflaska innehållande kallt kranvatten i krossad isvatten. Lufta iskallt vatten och sänk rotspetsar under 20 timmar för att öka frekvensen av metafas celler.
- Överför rötter från vatten till 50 ml etanol: ättiksyra (3: 1) fixativ för att fixera dem vid rumstemperatur under 2 dagar. Förvara rötter i en nyberedd etanol: ättiksyra (3: 1) fixativ vid 4 ° C fram till användning upp till ett år.
- Tvättning och enzymbehandling
- Tvätta 10-20 rötter med 30 ml iskall kranvatten under 5 minuter två gånger med användning av en 50 ml glasbägare. Använd binokulärt mikroskop. Överför rötter en efter en i30 ml 0,01 M citrat-buffert (0,01 M citronsyra + 0,01 M natriumcitrat, pH 4,8) med hjälp av pincett och tvätta genom skakning glasbägaren för fem minuter två gånger. Placera rötter på filterpapper för att avlägsna vätskan helt och cut-off oönskade icke-meristematisk vävnad med användning av ett rakblad.
- Inkubera upp till 20 rotspetsar i 1 ml enzymblandningen vid 37 ° C under ca 50 min för att mjuka upp växtvävnad (tabell 1) i ett urglas. Enzymblandningen innehåller 0,7% cellulas R10, 0,7% cellulas, 1% pectolyase och 1% cytohelicase utspädd i 0,01 M citratbuffert. Förvara enzymblandningen vid -20 ° C och återanvändas upp till fem gånger.
- Avlägsna enzymet genom pipettering och tvätta rotspetsar på is med 5 ml 0,01 M citrat-buffert två gånger för att ersätta den kvarvarande enzymet.
- Root maceration
- Tvätta rotspetsar med 1 ml 96% -ig etanol två gånger noggrant i samma urglas. Byt ut etanol med nygjord fixativ (75% ättiksyra: 25% etanol). Använd 10-15il fixerings per rotspets.
- Transfer rotspetsar tillsammans med fixativ i ett 2 ml rör och upplöses rot meristemer med en dissekera nål eller pincett. Knacka på röret 20 gånger för att återsuspendera celler för att erhålla en cellsuspension. Förvara cellsuspensionen vid -20 ° C upp till två månader.
- Tappa av cellsuspensionen
- Placera 2-3 lager av vattenindränkta pappersvävnad på en värmeplatta vid 50 ° C. Sänk mikroskopiska diabilder i iskallt kranvatten i kylskåpet i 30 minuter. Och plats glider ovanpå den fuktiga pappersvävnaden.
- Pipettera 7-10 l av cellsuspensionen och släpp den från ett avstånd på 20 cm på den kylda sliden placeras på den varma plattan. Pipettera 10 pl ättiksyra-etanolblandningen på samma plats som cellsuspension på bilden och hålla bilden på värmeplattan för ytterligare 2 min. Placera bilden på värmeplattan utan våt vävnad och låt den torka i en minut.
- Kvalitetskontroll och förvae av diabilder
- Kolla bilderna med hjälp av en faskontrastmikroskop att kontrollera kvaliteten på kromosom spridning. Använd bilderna antingen samma dag eller butik genom nedsänkning i 96% etanol i en Coplin burk vid -20 ° C.
- Förbehandling av bilderna innan FISH; alla steg utförs vid RT
- Placera objektglasen i ett Coplin-kärl innehållande 50 ml 2 x SSC (20x SSC innehåller 3 M NaCl och 300 mM trinatriumcitrat) under 5 minuter. Använd pincett, överföra bilder till en Coplin burk innehållande 50 ml 45% ättiksyra under 3-10 minuter.
- Överför objektglasen till ett Coplin-kärl innehållande 50 ml 2 x SSC under 10 min. Överför objektglasen till ett Coplin-kärl innehållande 50 ml 4% formaldehyd (i 2 x SSC) och sänk ned bilder för 10 min för att fixera kromosomer.
- Ta bort formaldehyd genom att skölja bilderna 3 gånger under 4 minuter vardera i en Coplin burk innehållande 50 ml 2 x SSC. Torka objektglasen i en Coplin burk för 2 minuter i serie på 70%, 90% och 100% etanol, respektive och torra glider i ett vertikaltplacera.
2. Fluorescerande In Situ Hybridisering (FISH)
- För varje bild, förbereda en hybridiseringslösning av 20 ^ i totalt med användning av 10 fil av avjoniserad formamid, 5 il 4x hybridiseringsbuffert (200 | j, l buffert innehåller 80 pl 20x SSC, 8 | il 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,6 | il 0,5 M EDTA, 11,2 | al 10 ^ g / ^ l laxsperma och 99,2 pl DNas-fritt vatten), 3 pl av sonden och 2 | il DNas-fritt vatten.
- Tillsätt 20 l av hybridisering lösning per bild och täck med en 24 x 32 mm täckglas och gripa locket glida med gummi cement. Denaturera bilder med prober samtidigt vid 80 ° C under 2 minuter på en varm platta.
- Transfer glider en fuktig kammare och inkubera glider vid 37 ° CO / N undvika ljus. Ta bort täckglas genom att skölja glasen i en Coplin burk med 2x SSC. Placera objektglasen i en Coplin burk innehållande 55-60 ° C 2x SSC och inkubera i 20 minuter.
- Placera glasen till 2x SSC i ett Coplin-kärl för två min vid RT. Torka glasen i en Coplin burk för 2 minuter i serie på 70%, 90% och 100% etanol, respektive.
- Lufttorka glasen och kontrast med 1 mikrogram / ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindoline (DAPI) i antifad monteringsmedium, undvika intensivt ljus.
3. Mikroskopisk analys och förvaring
- Analysera objektglasen med användning av ett epifluorescensmikroskop. Valet av filter beror på den fluorokrom används för sondmärkning. Om det behövs, lagra bilderna vid 4 ° C under mörka förhållanden upp till ett år.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikroskopiska objektglasen med de mitotiska metafas spreadframställdes genom den snabba lufttorka dropp kromosom framställningsmetod som beskrivits ovan (suppl. Figur 1). FISH-analys utfördes med användning av både, repetitiva och single-kopieringssekvenser. Bilder erhölls genom en epifluorescensmikroskop med en uppsättning filter som gör det möjligt excitation av motsvarande fluoroforer och fångas upp av en högkänslig CCD monokrom kamera. För bilden förvärvet använde vi en dator med en bild förvärv programvara. Resultat från FISH experiment på mitotisk metafaskromosomer använder 5S rDNA [CTT] 10, och lösnummer sonder var distinkt och av hög kvalitet för Hordeum vulgare (Figre 2A, B), H. bulbosum (Figur 2C), H. marinum, H. murinum, H. pubiflorum och Secale cereale (figur 2D). Uppenbara fördelarna med denna metod är väl spridda, oskadad och många uppfyllda aphase kromosomer tjänar som en perfekt förutsättning för en framgångsrik FISH analys. Det är möjligt att lagra cellsuspensionen vid -20 ° C upp till två månader och förbereda kromosomen sprider på dagen för FISH experimentet. Nylagade bilderna kan också lagras vid -20 ° C i 96% etanol, även om vi konstatera att kvaliteten på hybridiseringssignaler på sådana kromosomer är reducerad jämfört med de nyligen framställda metafas sprider. Metoderna kan användas för att framställa högkvalitativa kromosom sprider sig i spannmål i ett enkelt, effektivt och reproducerbart sätt och troligen kan användas i andra växtarter också.
Figur 1. Ett system som beskriver förfarandet för det lufttorra släppa växt kromosom framställningsmetod.
es / ftp_upload / 53.470 / 53470fig2.jpg "/>
Figur 2. FISH på mitotiska metakromosomspreadarna Hordeum vulgare, H. bulbosum och Secale cereale framställd genom det lufttorra droppmetoden. (A) H. vulgare med en enda kopia sond (FPct_40752) märkt med en röd fluorescerande färg. (B) H. vulgare med 5S rDNA sond märkt med en grön fluorescerande färgämne. (C) H. bulbosum med CTT-mikrosatellit märkt med en grön fluorescerande färgämne och (D) S. cereale med pSc119.2 upprepa märkt av ett grönt fluorescerande färgämne. Alla kromosomer motfärgades med DAPI (i rött). FISH signaler visas i gult. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna Figure.
Tabell 1. Inkubationstiden av enzymbehandling för olika arter.
Suppl. Figur 1. fas kontrast och differential interferens kontrast (DIC) bilder av mitotisk metafas kromosom uppslag av det lufttorra släppa växt kromosomframställningsmetod på exemplet med Hordeum vulgare. (A) Faskontrast bild tagen vid 200 gångers förstoring och (B) Differential interferenskontrastbild tagen vid 630X förstoring. Klickahär för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kromosom förberedelse experiment har utförts med hjälp av unga rötter spannmål som hör till gräsfamiljen (Poaceae). Alla analyserade arter har 14 relativt lång mitotiska metafaskromosomer (11-15 pm) i diploida genomet set och tillhör stora genomet arter (5,1-7,9 GBP).
Längd grodda rötter var inte mer än 2 cm för att erhålla maximalt meristemvävnad. Synkronisering av delande celler uppnåddes genom en 20 timmar lång isvatten behandling som förbättrat mängden mitotiska meta sprider 10.
Två steg är viktiga för framställning av högkvalitativa kromosompreparat: (I) den relativa luftfuktigheten på 50% -55% och (II) varaktigheten av enzymbehandling. Den första punkten uppnåddes genom att placera våta pappers vävnader på en varm platta i närheten av de glasskivor. Den relativa fuktigheten mättes med en hygrometer. Den optimala luftfuktigheten för framställning av växtkromosomer liknade fuktigheten rapporterats av Kirov et al., 6. Den positiva effekten på kromosomen kvalitet till optimal relativ fuktighet sker genom svallning av cytoplasman och cellväggs hydrolys.
Varaktigheten av enzymbehandlingen är artberoende (tabell 1). Perioden för enzymbehandling beror också på tidsspannet för rot fixering i etanol / ättiksyra och storleken på rötterna. De längre rötter lagrades i fixativ (upp till 1 år vid 4 ° C), desto längre tid tar att smälta rötter att rätt kvalitet. Otillräckligt diger root material är svårt att blöta och kommer att öka den totala tiden för förberedelse till följd av långvarig maceration. Dessutom förblir metafaskromosomer inbäddade i cytoplasman som kan försvåra efterföljande sonden penetration under FISH experiment. Å andra sidan överdigere materialet kan påverka strukturen hos kromosomerna själva, och skadan målet DNA för FISH-analys.
En ytterligare faktor för förbättring av framställningen är användningen av den andra droppe fixativ (3: 1, ättiksyra / etanol). Hög koncentration av ättiksyra i denna blandning stimulerar nedbrytning av cytoplasman och främjar kromosom sprids i arter med stora kromosomer. Cytoplasma minskning kan också ske efter immobilisering av kromosomerna på bilderna. För detta ändamål objektglas som uppbär kromosomspread kan inkuberas i 45% ättiksyra vid rumstemperatur under 2-10 min beroende på cytoplasma nivå. Kvalitetskontroll av kromosom uppslag utfördes med en faskontrastmikroskop utan tilläggs färgning (t.ex. 1% aceto-Carmin). Normalt mer än 25 objektglas innehållande högkvalitativa kromosom spreadar kan erhållas från 20 rötter användning av metoden ovan.
Resultat från FISH experiment på mitotisk metafaskromosomer använder 5S rDNA [CTT] 10, och 6 kb lång enda kopia sond (FPct_40752) var distinkt och av hög kvalitet för alla arter som beskrivs ovan (Figur 2). Uppenbara fördelarna med denna metod är väl spridda, oskadade och många metafaskromosomer tjänar som en perfekt förutsättning för en framgångsrik FISH-analys. Det är möjligt att lagra cellsuspensionen vid -20 ° C upp till två månader och förbereda kromosomen sprider på dagen för FISH experimentet. Nylagade bilderna kan också lagras vid -20 ° C i 96% etanol, även om vi konstatera att kvaliteten på hybridiseringssignaler på sådana kromosomer är reducerad jämfört med de nyligen framställda metafas sprider.
Kromosom sprider utarbetats av den snabba lufttorka släppa tekniken var lämpliga för FISH och reproducerades ett antal gånger. Kombination av denna kromosom framställningsmetod med FISH kan tillämpas i stor utsträckning för att undersöka genomorganisation i växter, exempelvis för karyotypning 11, kromolitografierOMAL kartläggning 12, i form av syntetiska studier och för integrationen av fysiska och genetiska kartor 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hot Plate | MEDAX GmbH | 12603 | |
| Cellulase R10 | Duchefa | C8001 | |
| Cellulase | CalBioChem | 219466 | |
| Pectolyase | Sigma | P3026 | |
| Cytohelicase | Sigma | C8274 | |
| Texas Red-12-dUTP | Invitrogen | C3176 | direct fluorochrome |
| Fluor488-5-dUTP | Invitrogen | C11397 | direct fluorochrome |
| Fluorecsence microscope | Olympus BX61 | BX61 | |
| CCD camera | Orca ER, Hamamatsu | C10600 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-1200 | fluorecsent dye |
References
- Geber, G., Schweizer, D. Cytochemical heterochromatin differentiation in Sinapis alba (Cruciferae) using a simple air-drying technique for producing chromosome spreads. Pl Syst Evol. 158 (2-4), 97-106 (1988).
- Andras, S. C., et al. A drop-spreading technique to produce cytoplasm-free mitotic preparations from plants with small chromosomes. Chromosome Res. 7 (8), 641-647 (1999).
- Rothfels, K. H., Siminovitch, L. An air-drying technique for flattening chromosomes in mammalian cells grown in vitro. Stain Technology. 33 (2), 73-77 (1958).
- Martin, R., Busch, W., Herrmann, R. G., Wanner, G. Efficient preparation of plant chromosomes for high-resolution scanning electron microscopy. Chromosome Res. 2 (5), 411-415 (1994).
- Kato, A., Albert, P. S., Vega, J. M., Birchler, J. A. Sensitive fluorescence in situ hybridization signal detection in maize using directly labeled probes produced by high concentration DNA polymerase nick translation. Biotech. Histochem. 81 (2-3), 71-78 (2006).
- Kirov, I., Divashuk, M., Van Laere, K., Soloviev, A., Khrustaleva, L. An easy 'SteamDrop' method for high quality plant chromosome preparation. Mol. Cytogenet. 7, 21 (2014).
- Spurbeck, J. L., Zinsmeister, A. R., Meyer, K. J., Jalal, S. M. Dynamics of chromosome spreading. Am J Med Genet. 61 (4), 387-393 (1996).
- Ma, L., et al. Synteny between Brachypodium distachyon and Hordeum vulgare as revealed by FISH. Chromosome Res. 18 (7), 841-850 (2010).
- Kato, A., Lamb, J. C., Birchler, J. A. Chromosome painting using repetitive DNA sequences as probes for somatic chromosome identification in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (37), 13554-13559 (2004).
- Pan, W. H., Houben, A., Schlegel, R. Highly effective cell synchronization in plant-roots by hydroxyurea and amiprophos-methyl or colchicine. Genome. 36 (2), 387-390 (1993).
- Kim, J. S., et al. Integrated karyotyping of sorghum by in situ hybridization of landed BACs. Genome. 45 (2), 402-412 (2002).
- Lapitan, N. L. V., Brown, S. E., Kennard, W., Stephens, J. L., Knudson, D. L. FISH physical mapping with barley BAC clones. Plant J. 11 (1), 149-156 (1997).
- Aliyeva-Schnorr, L., et al. Cytogenetic mapping with centromeric BAC contigs shows that this recombination-poor region comprises more than half of barley chromosome 3H. Plant J. 84, 385-394 (2015).
