Introduction
हाल के वर्षों में उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) के लिए स्तंभ तकनीक बहुत उन्नत है; शिखर क्षमता काफी हद तक छोटे कण आकार के उपयोग और अधिक कुशल कोर खोल कणों को काफी धन्यवाद वृद्धि हुई है। चूंकि विभाजन आम तौर पर अधिक कुशल हैं, एक प्रवाह पर प्रभाव के प्रति संवेदनशीलता में वृद्धि की गई है के बाद से अब चोटियों तेज और इसलिए लम्बे 1-8 कर रहे हैं।
फिर भी, रेडियल बिस्तर विविधता अभी भी सभी स्तंभों के प्रदर्शन में एक सीमित कारक है, लेकिन यह एक नई कहानी के बाद से chromatographers कई वर्षों के लिए जाना जाता है नहीं है। कॉलम बेड दोनों रेडियल दिशा 9-12 में विषम हैं, और 10,12-15 अक्ष कॉलम के साथ। दीवार पर प्रभाव विशेष रूप से जुदाई प्रदर्शन 7,16-18 के नुकसान के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान है। Shalliker और रिची 7 हाल ही में स्तंभ बिस्तर विविधता के पहलुओं की समीक्षा की है और इसलिए इस discusse होने की जरूरत नहींयहाँ आगे घ। हालांकि इतना ही कहना है, कि स्तंभ बिस्तर पैकिंग घनत्व में भिन्नता और दीवार प्रभाव घुला हुआ पदार्थ प्लग की एक विकृति है, जैसे कि बैंड प्लग कि आंशिक रूप से सूप भरा सदृश में कॉलम के माध्यम से elute करने के लिए नेतृत्व के कटोरे बल्कि पतली फ्लैट ठोस डिस्क 7 रहे हैं कि अधिक से आम तौर पर बुनियादी शिक्षण ग्रंथों में दर्शाया। जब प्रयोगों में इस तरह के कार्य शुरू किया गया है कि बिस्तर के माध्यम से घुला हुआ पलायन देखे जा सकते हैं स्तंभ के अंदर प्लग प्रोफाइल आंशिक रूप से खोखला कर रहे थे और बैंड का पीछा खंड काफी हद तक नमूना प्लग की दीवार घटक है। अंतिम परिणाम यह है कि इन 'आंशिक रूप से खोखला' प्लग से आवश्यक होगा यदि डिस्क ठोस और फ्लैट 12,14,17 थे अलग करने के लिए कई और अधिक प्लेटों लेता है। बैंड दीवार प्रभाव और रेडियल पैकिंग घनत्व में परिवर्तन के साथ जुड़े मुद्दों को व्यापक बनाने पर काबू पाने के लिए, के रूप में चर्चित प्रवाह प्रौद्योगिकी (एएफटी) में जाना जाता स्तंभ प्रौद्योगिकी का एक नया रूप 7,19 डिजाइन किया गया था। इस डिजाइन के उद्देश्य थादीवार क्षेत्र के साथ विलायक Eluting के भौतिक जुदाई के माध्यम से दीवार प्रभाव को दूर करने के लिए, स्तंभ 19 के रेडियल मध्य क्षेत्र में एल्यूटिंग मोबाइल चरण के उस से। वहाँ पिछाड़ी स्तंभों की दो मुख्य प्रकार हैं; समानांतर खंडों फ्लो (पीएसएफ) कॉलम और पर्दे के प्रवाह (सीएफ) कॉलम 7। चूंकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग और CF कॉलम के अनुकूलन के उद्देश्य से है, पीएसएफ कॉलम आगे चर्चा नहीं की जाएगी।
पर्दे के प्रवाह (सीएफ)
पर्दे के प्रवाह (सीएफ) स्तंभ प्रारूपों दोनों इनलेट और स्तंभ की दुकान पर पिछाड़ी अंत फिटिंग का उपयोग। पिछाड़ी अंत फिटिंग एक कुंडलाकार एक मल्टीपोर्ट फिटिंग के अंदर स्थित मिलाना से मिलकर बनता है। मिलाना तीन भागों से बना है: एक झरझरा रेडियल मध्य भाग कि उपयुक्त अंत के केंद्रीय बंदरगाह, एक झरझरा बाहरी भाग कि अंत फिटिंग के परिधीय बंदरगाह (एस) के साथ गठबंधन किया है, और एक अभेद्य की अंगूठी के साथ गठबंधन किया है कि दो झरझरा किसी भी पार रोकने भागों को अलग करती हैमिलाना 19 के रेडियल केंद्रीय और बाहरी क्षेत्रों के बीच -flow। चित्रा 1 दिखाता पिछाड़ी मिलाना के डिजाइन और चित्रा 2 सीएफ स्तंभ प्रारूप को दिखाता है। ऑपरेशन के इस मोड (सीएफ) में नमूना, इनलेट फिटिंग के रेडियल केंद्रीय पोर्ट में इंजेक्ट किया जाता है whilst अतिरिक्त मोबाइल चरण के रेडियल मध्य क्षेत्र के माध्यम से 'पर्दा' को विलेय के प्रवास के प्रवेश के परिधीय बंदरगाह के माध्यम से पेश किया है स्तंभ। इसलिए नमूना स्तंभ मोबाइल चरण केवल यह माध्यम से पारित होने के बाहरी क्षेत्र के साथ स्तंभ के रेडियल मध्य क्षेत्र में बिस्तर में प्रवेश करती है। अध्ययनों से पता चला है कि चारों ओर 40:60 का एक बड़ा प्रवाह दर अनुपात (Central: परिधीय बंदरगाह) इनलेट एक 4.6 मिमी आंतरिक व्यास (आईडी) कॉलम के अंत फिटिंग के लिए इष्टतम 6,7,16 है। सीएफ स्तंभ के पीछे आउटलेट उनके रिश्तेदार भाग के लिए केंद्रीय और परिधीय प्रवाह के समायोजन की अनुमति देता है और लगभग किसी भी वांछित रति को अलग किया जा सकताओ दबाव प्रबंधन के माध्यम से। एक CF स्तंभ के अनुकूलन काफी ऐसे जुदाई दक्षता या संवेदनशीलता का पता लगाने के रूप में स्तंभ प्रौद्योगिकी के विभिन्न कार्यात्मक पहलुओं में सुधार कर सकते हैं। इस तरीके में एक 'दीवार-कम', 'अनंत व्यास' या 'आभासी' कॉलम 6,10,18,20 की स्थापना की है। सीएफ कॉलम के प्रयोजन के लिए सक्रिय रूप से दीवार क्षेत्र तक पहुँचने से रोकने के लिए नमूना स्तंभ के माध्यम से नमूना के पलायन का प्रबंधन है। इस प्रकार, डिटेक्टर को बाहर निकलने पर घुला हुआ पदार्थ एकाग्रता अधिकतम है, पारंपरिक स्तंभ प्रारूप की तुलना में लगभग 2.5 गुना अधिक की संवेदनशीलता में वृद्धि का उपयोग करते समय पराबैंगनी (यूवी) का पता लगाने के लिए 16, और यहां तक कि बड़े पैमाने पर वर्णक्रम का पता लगाने 6 का उपयोग करते समय अधिक से अधिक।
सीएफ कॉलम आदर्श रूप में, कम एकाग्रता के नमूने के लिए अनुकूल हैं क्योंकि संवेदनशीलता का पता लगाने में वृद्धि हुई है। इसके अलावा, वे आदर्श जब प्रवाह करने के लिए इस तरह के मास स्पेक्ट्रोमीटर (एमएस) के रूप में 6 दर सीमित डिटेक्टरों, मिलकर कर रहे हैं। एक एकएक 4.6 मिमी आईडी प्रारूप में एफटी स्तंभ, उदाहरण के लिए जब एक ही रेखीय वेग पर संचालित, 21% करने के लिए केंद्रीय प्रवाह बाहर निकलने का समायोजन करके एक मानक 2.1 मिमी आईडी प्रारूप स्तंभ के रूप में एक डिटेक्टर के लिए विलायक का एक ही मात्रा देने के लिए देखते जा सकता है। इसी तरह पिछाड़ी स्तंभ भी, एक 3.0 मिमी आईडी स्तंभ के रूप में एक डिटेक्टर के लिए एक ही मात्रा लोड वितरित करने के लिए 43% करने के लिए केंद्रीय प्रवाह बाहर निकलने का समायोजन करके देखते जा सकता है। वास्तव में किसी भी 'आभासी' कॉलम प्रारूप विश्लेषणात्मक आवश्यकता 6,18,22 सूट करने के लिए उत्पादन किया जा सकता है। प्रवेश पर इन विशेष रूप से डिजाइन अंत फिटिंग का उपयोग और आउटलेट सुनिश्चित करता है कि एक सच्चे दीवार-कम स्तंभ स्थापित है।
इसमें प्रवेश के मध्य और परिधीय बंदरगाहों के लिए विलायक वितरण प्रणाली स्थापित करने के लिए दो तरीके हैं:। विभाजित प्रवाह प्रणाली 6 और दो पंप प्रणाली 6.7 चित्रा 3 इन सीएफ सिस्टम सेट अप के प्रत्येक दिखाता है।
विभाजन प्रवाह प्रणाली
मैंna विभाजन प्रवाह प्रणाली (चित्रा 3) पंप प्रवाह इंजेक्टर के लिए अग्रणी विभाजन पूर्व इंजेक्टर एक शून्य मृत मात्रा टी टुकड़ा है, जहां मोबाइल चरण की एक धारा का प्रवाह लगानेवाला, जो तब से जुड़ा है से जुड़ा है का उपयोग कर रहा है स्तंभ के इनलेट अंत फिटिंग के केंद्रीय बंदरगाह। मोबाइल चरण के दूसरे प्रवाह धारा इंजेक्टर द्वारा गुजरता है और स्तंभ के प्रवेश पर परिधीय बंदरगाह से जुड़ा है। केंद्र और परिधीय को पंप करने के लिए, इससे पहले कि लाइनों के स्तंभ से जुड़े हैं, यानी इंजेक्टर से: प्रवाह के बंटवारे के दौरान, प्रवाह धारा प्रतिशत 40:60 (परिधीय सेंटर) के लिए निकाला जाता है।
दो पंप प्रणाली
सीएफ स्तंभ स्तंभ के इनलेट अंत फिटिंग में दो प्रवाह धाराओं की आवश्यकता है। एचपीएलसी साधन, विभाजन के प्रवाह की स्थापना की autosampler / इंजेक्टर के प्रकार पर निर्भर करता है कि संभव नहीं हो सकता है, और इसलिए सीएफ तो 2 पंप (चित्रा 3 बी 21) के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता। प्रत्येक पंप आवंटित की है और या तो केंद्रीय या परिधीय बंदरगाह और प्रवाह की दर केंद्रीय बंदरगाह के लिए प्रवाह का 40% और परिधीय बंदरगाह के लिए 60% का प्रतिनिधित्व करने के लिए सेट कर दिया जाता से जुड़ा है। उदाहरण के लिए, यदि कुल प्रवाह की दर 1.0 मिलीलीटर मिनट -1 है, केंद्रीय पंप प्रवाह की दर 0.4 मिलीलीटर मिनट के लिए सेट कर दिया जाता -1 और परिधीय पंप 0.6 मिलीलीटर मिनट -1 के लिए निर्धारित है।
आपरेशन के जो विधा का चुनाव काफी हद तक एचपीएलसी इंस्ट्रूमेंटेशन और ऑपरेशन के chromatographic मोड पर निर्भर है। उदाहरण के कुछ autosamplers में नमूना लोड की स्थिति और नमूना के बीच दबाव में एक परिवर्तन इंजेक्षन स्थिति विभाजन प्रवाह अनुपात में खलल न डालें होने पर हो सकती है और इस तरह इस मामले में एक दोहरी पंप की स्थापना इष्टतम सीएफ प्रदर्शन के लिए सिफारिश की जाएगी लिए। की स्थापना की विलायक वितरण प्रणाली सीएफ स्तंभ के प्रवेश के लिए चुना है के बावजूद, सीएफ आउटलेट अनुकूलन ही रहता है। सीएफ स्तंभ के आउटलेट केंद्रीय बंदरगाह smal के साथ पराबैंगनी-दृश्य (यूवी विज़) डिटेक्टर से जुड़ा हुआ हैमात्रा ट्यूबिंग के संभावित ऐसा न हो कि बाद के स्तंभ मृत मात्रा के प्रभाव को कम करने के लिए। चूंकि, सीएफ कॉलम संकीर्ण बोर स्तंभों का अनुकरण, स्तंभ आउटलेट और डिटेक्टर के बीच मृत मात्रा सीएफ स्तंभ की जुदाई प्रदर्शन के लिए हानिकारक है। यह केंद्रीय बंदरगाह और यूवी विज़ डिटेक्टर इस तरह के बैंड विस्तार, कार्यकुशलता और संवेदनशीलता में नुकसान के रूप में मृत मात्रा के प्रभाव को कम करने के लिए बीच ट्यूबिंग की मात्रा की छोटी राशि सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलिए, संकीर्ण बोर ट्यूबिंग (0.1 मिमी आईडी) के उपयोग में आसानी से अनुचित मृत मात्रा जोड़ने के बिना दबाव समायोजन की अनुमति देने की सलाह दी है। ट्यूबिंग भी परिधीय बंदरगाह से जुड़ी है और बर्बाद करने के लिए निर्देशित किया गया है। सीएफ स्तंभ की दुकान पर, विभाजन अनुपात किसी भी अनुपात है कि विश्लेषक के उद्देश्य से फिट बैठता है समायोजित किया जा सकता है। जब एक 4.6 मिमी आईडी सीएफ प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, यह अक्सर सुविधाजनक या तो 43:57 या 21:79 (केंद्र: परिधीय) के रूप में अनुपात निर्धारित करने के लिए एक 'आभासी' 3.0 मिमी आईडी स्तंभ या 2.1 मिमी आईडी स्तंभ का अनुकरण करने के लिए,सम्मान से। यही कारण है कि जिस तरह से जुदाई प्रदर्शन आसानी से बेंच में चिह्नित है। विभाजन अनुपात प्रवाह डिटेक्टर कि केंद्रीय बंदरगाह से जुड़ा है और एक अवधि के समय के साथ परिधीय बंदरगाह बाहर निकलने प्रवाह है से बाहर निकलने की राशि वजन द्वारा मापा जाता है। प्रत्येक बंदरगाह के माध्यम से प्रवाह प्रतिशत तो निर्धारित किया जा सकता और अनुपात ट्यूबिंग संलग्न की लंबाई में फेरबदल या ट्यूबिंग एक अलग आंतरिक व्यास (आईडी) का उपयोग कर समायोजित किया जा सकता है।
इस वीडियो प्रोटोकॉल का विवरण बढ़ाया chromatographic प्रदर्शन के लिए एक CF स्तंभ के संचालन और अनुकूलन प्रक्रियाओं।
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Protocol
सावधानी: कृपया सभी सामग्री और अभिकर्मकों के लिए सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) के लिए उपयोग करने से पहले (यानी मेथनॉल के लिए, एमएसडीएस) देखें। जब सॉल्वैंट्स और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) eluent से निपटने के लिए सभी उचित सुरक्षा प्रथाओं का उपयोग सुनिश्चित करें। एचपीएलसी, विश्लेषणात्मक संतुलन और डिटेक्टर इंस्ट्रूमेंटेशन इंजीनियरिंग नियंत्रण के उचित उपयोग सुनिश्चित करने, और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पैंट पूरी लंबाई, और बंद पैर की अंगुली जूते) का उपयोग किया जाता है।
नोट: इस प्रोटोकॉल कैसे एक एचपीएलसी प्रणाली एक यूवी विज़ डिटेक्टर के साथ युग्मित पर एक CF स्तंभ का उपयोग करने पर निर्देश शामिल हैं। प्रोटोकॉल पाठक मानते हुए बुनियादी ज्ञान और क्रोमैटोग्राफी में अनुभव है लिखा गया है।
1. एचपीएलसी साधन का सेटअप
नोट: इस खंड में 'विश्लेषकों की जरूरत है, यानी सूट करने के लिए बदला जा सकता है, सॉल्वैंट्स की पसंद है, डिटेक्टर तरंगदैर्ध्य और प्रवाह की दर है किब्याज का नमूना करने के लिए उपयुक्त हैं।
- मोबाइल चरण के रूप में एचपीएलसी लाइन बी के लिए लाइन ए के लिए 100% ultrapure पानी के साथ साधन (जैसे, मिल्ली क्यू पानी) और 100% मेथनॉल को तैयार है और निर्माता की आवश्यकता के अनुसार पंप शुद्ध करना।
- 254 एनएम के लिए यूवी विज़ डिटेक्टर सेट करें।
- या तो एक पूर्व इंजेक्शन सेट-अप के प्रवाह विभाजन मोड, या एक दोहरी पंप प्रवाह सेट-अप का चयन करें। विभाजन प्रवाह मोड के लिए, 2 चरण के लिए दोहरी पंप मोड के लिए 3 कदम आगे बढ़ना आगे बढ़ें।
2. विभाजन प्रवाह प्रणाली सेटअप
- ऑटो पारखी की सुई लगानेवाला वाल्व से पंप लाइन डिस्कनेक्ट।
- पंप लाइन के लिए एक टी-टुकड़ा देते हैं।
- टी-पीस के प्रत्येक बंदरगाह के लिए 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी टुकड़ा देते हैं।
- ऑटो पारखी के वाल्व इंजेक्टर के लिए टी-टुकड़े से एक ट्यूब कनेक्ट करें।
- 1.0 मिलीलीटर मिनट के लिए पंप सेट -1।
- 40% तक प्रवाह के विभाजन अनुपात सीएफ स्तंभ के इनलेट, धुन करने के लिए पंप लाइनों को जोड़ने से पहले: 6 0% (मध्य रेखा: परिधीय लाइन) के रूप में कदम 2.7 में निम्नानुसार है।
- विभाजन प्रवाह प्रणाली पर सीएफ इनलेट अनुपात की ट्यूनिंग
- दो खाली संग्रह जहाजों के बड़े पैमाने पर मापने एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग और लेबल एक संग्रह पोत केंद्रीय और अन्य एक परिधीय (एक ऑटो पारखी से लाइन परिधीय बंदरगाह के लिए टी-टुकड़े से लाइन के लिए बंदरगाह और एक केंद्र के लिए) ।
- 1.0 मिनट के लिए, लाइन संग्रह पोत, जिसका द्रव्यमान 2.7.1 में मापा गया था में (बात यह है कि स्तंभ से जोड़ा जाएगा पर) इंजेक्टर से आने से बाहर निकलने मोबाइल चरण इकट्ठा।
- पुनः तौलना विश्लेषणात्मक पैमाने पर संग्रह पोत और एकत्र मोबाइल चरण के द्रव्यमान का निर्धारण।
- दोहराएँ कदम 2.7.2 eluent टी टुकड़ा है कि परिधीय बंदरगाह से जुड़े होने की लाइन से बाहर निकलने के लिए 2.7.3 करने के लिए।
- प्रवाह का प्रतिशत निर्धारित (एमएल मिनट -1) निम्नलिखित समीकरणों के अनुसार प्रवाह की प्रत्येक पंक्ति से:
1 "src =" / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/> - 40% तक प्रवाह अनुपात को समायोजित: 60% (± 2%) (केंद्रीय बंदरगाह के लिए इंजेक्टर से लाइन: परिधीय बंदरगाह के लिए टी-टुकड़े से लाइन)। केंद्रीय बंदरगाह प्रवाह प्रतिशत करने के लिए इंजेक्टर से लाइन में 40% से ऊपर है, ट्यूबिंग का आंतरिक व्यास कम है, या इसकी लंबाई बढ़ाने के द्वारा दबाव ड्रॉप वृद्धि हुई है। केंद्रीय बंदरगाह प्रवाह प्रतिशत करने के लिए इंजेक्टर से लाइन में 40% नीचे है, ट्यूबिंग का आंतरिक व्यास को बढ़ाने या ट्यूब की लंबाई कम होती है।
- एक बार जब प्रवाह अनुपात देखते हैं पंप बंद प्रवाह की बारी है।
- स्तंभ प्रवेश के केंद्रीय बंदरगाह और स्तंभ इनलेट के परिधीय बंदरगाह के लिए टी-टुकड़े से लाइन के लिए इंजेक्टर से लाइन कनेक्ट।
- धीरे-धीरे 1.0 मिलीलीटर मिनट प्रवाह दर -1 100% लाइन बी में रैंप
- अनुमति देकर स्तंभ (4.6 मिमी आईडी x 100 मिमी लंबाई) संतुलित करना100% मेथनॉल (लाइन बी) मोबाइल चरण 1.0 मिलीलीटर मिनट पर कॉलम के माध्यम से प्रवाह -1 10 मिनट के लिए। इस बार अन्य स्तंभों उपयोगकर्ता काम कर सकते हैं के आयामों के अनुसार बढ़ाया है।
- सीएफ आउटलेट की ट्यूनिंग के लिए चरण 4 'सीएफ आउटलेट प्रवाह की ट्यूनिंग' जाओ।
3. दोहरी पम्प सिस्टम सेटअप
- इंजेक्टर को एचपीएलसी प्रणाली पंप कनेक्ट और फिर स्तंभ के केंद्रीय इनलेट बंदरगाह के लिए इंजेक्टर से लाइन कनेक्ट।
- स्तंभ के इनलेट परिधीय बंदरगाह के लिए सीधे अतिरिक्त पंप कनेक्ट करें। ध्यान दें कि यह दूसरा पंप सुई लगानेवाला द्वारा गुजरता है।
- 0.4 मिलीलीटर मिनट -1 100% मेथनॉल (लाइन बी) पर (1.0 मिलीलीटर मिनट -1 के कुल प्रवाह का 40% के प्रतिनिधि) करने के लिए प्रणाली केंद्रीय बंदरगाह से जुड़ी पंप के प्रवाह की दर रैंप।
- 3.3 कदम के रूप में एक ही समय में, 0.6 मिलीलीटर मिनट -1 (कुल प्रवाह का 60% के प्रतिनिधि के परिधीय पंप के प्रवाह की दर रैंप1.0 मिलीलीटर मिनट -1) 100% मेथनॉल (लाइन बी) पर।
- 1.0 मिलीलीटर मिनट पर कॉलम के माध्यम से प्रवाह -1 10 मिनट के लिए 100% मेथनॉल (लाइन बी) मोबाइल चरण की अनुमति देकर स्तंभ (4.6 मिमी आईडी x 100 मिमी लंबाई) संतुलित करना। इस बार अन्य स्तंभों उपयोगकर्ता काम कर सकते हैं के आयामों के अनुसार बढ़ाया है।
- सीएफ आउटलेट की ट्यूनिंग के लिए चरण 4 'सीएफ आउटलेट प्रवाह की ट्यूनिंग' जाओ।
4. सीएफ आउटलेट प्रवाह की ट्यूनिंग
- यूवी विज़ डिटेक्टर 0.13 मिमी आईडी टयूबिंग की एक 15 सेमी टुकड़ा का उपयोग करने के लिए केंद्रीय आउटलेट बंदरगाह से कनेक्ट।
- सीएफ स्तंभ के परिधीय आउटलेट बंदरगाह के लिए 0.13 मिमी आईडी ट्यूबिंग का एक टुकड़ा 15 सेमी कनेक्ट करें।
- विश्लेषणात्मक संतुलन पर दो खाली संग्रह जहाजों की बड़े पैमाने पर वजन और लेबल एक पोत केंद्रीय और अन्य परिधीय।
- 1.0 मिनट के लिए, संग्रह पोत लेबल केंद्रीय, जिसका बड़े पैमाने पर 4.2 मापा गया था में यूवी विज़ डिटेक्टर (केंद्रीय प्रवाह) से बाहर निकलने मोबाइल चरण इकट्ठा।
- पुनः तौलना संग्रह विश्लेषणात्मक पैमाने पर एकत्र eluent युक्त पोत और एकत्र मोबाइल चरण के द्रव्यमान का निर्धारण।
- दोहराएँ 4.4 eluent परिधीय आउटलेट बंदरगाह से बाहर निकलने के लिए लाइन 4.5 कदम।
- निम्नलिखित समीकरण के अनुसार प्रवाह की प्रत्येक पंक्ति से प्रवाह का प्रतिशत निर्धारित:
- ।, यूवी विज़ से केंद्रीय प्रवाह प्रतिशत 21% से ऊपर है तो दबाव ड्रॉप में वृद्धि 21% करने के लिए प्रवाह अनुपात को समायोजित: 79% (± 2%) (लाइन से परिधीय आउटलेट प्रवाह यूवी विज़ से केंद्रीय आउटलेट प्रवाह) ट्यूबिंग यूवी विज़ डिटेक्टर के निकास के लिए संलग्न की आंतरिक व्यास को कम करके, या इसकी लंबाई बढ़ रही है। यूवी विज़ से केंद्रीय प्रवाह प्रतिशत 21% नीचे है, ट्यूबिंग यूवी विज़ डिटेक्टर के निकास के लिए संलग्न की आंतरिक व्यास बढ़ाने के लिए, या ट्यूब की लंबाई कम होती है। हर बार टयूबिंग की लंबाई बदल दिया गया है, दोहराने4.7 करने के लिए 4.3 कदम।
नोट: 'आभासी 2.1 मिमी आईडी मोड में सीएफ स्तंभ विश्लेषण के लिए तैयार है।
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Representative Results
पिछाड़ी कॉलम मल्टीपोर्ट स्तंभ अंत फिटिंग में एक विशेष मिलाना डिजाइन (चित्रा 1) का उपयोग स्तंभ बिस्तर विविधता पर काबू पाने और जुदाई के प्रदर्शन में सुधार करने के लिए विकसित किए गए। सीएफ क्रोमैटोग्राफी कॉलम (चित्रा 2) के अलग होने के प्रदर्शन पर एक अंतर-प्रयोगशाला अध्ययन एक दोहरी पंप प्रणाली इस प्रोटोकॉल 23 की धारा 3 में वर्णित के रूप में सेट अप (चित्रा 3 बी) के साथ किया गया। तीन घटक परीक्षण मिश्रण एक 'आभासी 2.1 मिमी आईडी जहां सीएफ स्तंभ के केंद्रीय आउटलेट प्रवाह का 21% डिटेक्टर के लिए निर्देशित किया गया था के माध्यम से के तहत विश्लेषण किया गया था। एक तीन घटक परीक्षण मिश्रण की जुदाई दक्षता और संवेदनशीलता, मानक स्तंभों के लिए एक CF स्तंभ रिश्तेदार के के मामले में बेहतर प्रदर्शन दिखाता है। तीन घटक परीक्षण मिश्रण phenetole, butylbenzene और pentylbenzene रखी जाती है और पारंपरिक 4.6 और 2.1 मिमी आईडी कॉलम और एक 4.6 पर विश्लेषण किया गया था 22:78 (केंद्र: परिधीय) के एक विभाजन के अनुपात के साथ मिमी आईडी सीएफ स्तंभ एक 2.1 मिमी आईडी (चित्रा 4) का अनुकरण करने के लिए। जुदाई दक्षता प्लेट गिनती (एन), और संवेदनशीलता के मामले में मूल्यांकन किया गया था। विश्लेषण के लिए CF स्तंभ के उपयोग (चित्रा 5) एक कम पता लगाने की सीमा और संवेदनशीलता में वृद्धि देखी गई (आंकड़े 4 और 6) की तुलना करने के लिए पारंपरिक स्तंभ का विश्लेषण करती है। यह भी पाया गया कि प्रयोगशाला या एचपीएलसी प्रणाली है कि कार्यरत है के प्रकार की परवाह किए बगैर, सीएफ स्तंभ के लिए जुदाई प्रदर्शन परिणाम अपेक्षाकृत एक ही था, बेहतर जुदाई प्रदर्शन में सभी परिणामी जब सीएफ क्रोमैटोग्राफी कॉलम 23 काम करते हैं।
चित्रा 1. सक्रिय फ्लो प्रौद्योगिकी स्तंभ अंत ढाले मिलाना डिजाइन का चित्रण। oad / 53471 / 53471fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. पिछाड़ी स्तंभ -। सीएफ स्तंभ प्रारूप यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
(ए) विभाजन प्रवाह प्रणाली की स्थापना की और (बी) 2 पंप प्रणाली की स्थापना में सीएफ स्तंभ इनलेट प्रवाह की चित्रा 3. सेट करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 4. तीन घटक परीक्षण मिश्रण अंतिम 3000 प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त की एक ठेठ जुदाई। (एक) पारंपरिक 4.6 मिमी आईडी स्तंभ, (ख) पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी स्तंभ, (ग) पर्दे के प्रवाह स्तंभ एक 22% आउटलेट विभाजन के साथ संचालन अनुपात। विलेय: (i) phenetole, (ii) butylbenzene और (iii) pentylbenzene। यह आंकड़ा 23 से निकाला गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा (एक) पारंपरिक स्तंभ पर पता लगाने की सीमा पर butylbenzene 5. क्षालन बैंड प्रोफाइल, और (ख) पर्दे के प्रवाह स्तंभ सिस्टम: 2.0 मिलीग्राम / मिनट, 5 μl इंजेक्शन, 254 एनएम का पता लगाने में Shimadzu।। यह आंकड़ा से निकाला गया है
चित्रा 6 butylbenzene की क्षालन प्रोफाइल अंतिम 3000 प्रणाली पर प्राप्त की तुलना में। (एक) पारंपरिक 4.6 मिमी आईडी स्तंभ, (ख) पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी स्तंभ, (ग) एक 22% आउटलेट विभाजन के साथ पर्दे के प्रवाह स्तंभ अनुपात। यह आंकड़ा 23 से निकाला गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस अध्ययन में दक्षता और संवेदनशीलता के मामले में विश्लेषणात्मक प्रदर्शन का परीक्षण करने सीएफ क्रोमैटोग्राफी स्तंभों की अंतर-प्रयोगशाला विश्लेषण शामिल किया गया। अनुभाग में '3 वर्णित के रूप में सीएफ स्तंभ एक दोहरी पम्पिंग प्रणाली के साथ स्थापित किया गया था। सीएफ स्तंभ के प्रवेश पर: (परिधीय केंद्र) दोहरी पंप प्रणाली 40:60 का प्रवाह अनुपात को प्राप्त करने के लिए सेट अप '। 40:60 (केंद्र: परिधीय) प्रवाह अनुपात मूल्य है कि 40% और कुल प्रवाह की दर के 60%, क्रमशः का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रत्येक पंप के प्रवाह की दर की स्थापना करके हासिल की थी। सीएफ स्तंभ आउटलेट प्रक्रिया खंड में वर्णित 'का पालन करते हुए 2.1 मिमी आईडी के साथ एक' वर्चुअल 'कॉलम को देखते गया था 4। सीएफ आउटलेट प्रवाह की ट्यूनिंग '। Phenetole, butylbenzene और pentylbenzene युक्त एक नमूना मिश्रण एक 4.6 मिमी आईडी सीएफ स्तंभ (22:78) और पारंपरिक 4.6 और 2.1 मिमी आईडी स्तंभों के बीच एक अलग प्रदर्शन की तुलना के लिए एक परीक्षण मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। चित्रा 4 chromatograp के ओवरले हैपरीक्षण के मिश्रण के यहाँ जुदाई तीन स्तंभों की प्रत्येक का उपयोग किया। मुख्य इस आंकड़े में मनाया अंतर जुदाई सीएफ स्तंभ का उपयोग कर प्राप्त करने के लिए संकेत प्रतिक्रिया में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। 4.6 और 2.1 मिमी आईडी पारंपरिक स्तंभों के लिए संकेत प्रतिक्रिया लगभग समान थे के रूप में chromatographic की स्थिति कॉलम के पार के अनुभागीय सतह से मेल करने के लिए बढ़ाया गया था जैसा कि उम्मीद थी।
Linearity और पता लगाने की सीमा भी सीएफ और ऑपरेशन, जहां मानकों की एक श्रृंखला तैयार की है और विभिन्न प्रवाह दरों के साथ विभिन्न एचपीएलसी सिस्टम पर प्रतिकृति में विश्लेषण किया गया की पारंपरिक मोड के बीच का मूल्यांकन किया गया। चाहे जो की एचपीएलसी प्रणाली का इस्तेमाल किया है और क्या प्रवाह की दर विश्लेषण के परिणाम को अनिवार्य रूप से एक ही है, जहां CF के लिए संकेत प्रतिक्रिया हमेशा अन्य परम्परागत स्तंभों की तुलना में काफी अधिक था पर किया गया था। संकेत प्रतिक्रिया लाभ 1.7 और 2.8 के बीच आम तौर पर बार पारंपरिक स्तंभों की तुलना में अधिक थे। एक 5 गुनामाप की परिशुद्धता में सुधार - सबसे कम मानक श्रृंखला के लिए चोटी की ऊंचाई (यानी, रिश्तेदार मानक विचलन आरएसडी%) सीएफ पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी स्तंभ की तुलना में 22% से कम आपरेशन के मोड के लिए मनाया गया। सीएफ संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है कि CF के द्वारा प्राप्त की है के कारण चोटी के माप की परिशुद्धता में सुधार संकेत प्रतिक्रिया आरएसडी मूल्य अधिक से अधिक कम है। इस प्रकार, के रूप में बेहतर संकेत प्रतिक्रिया चोटी परिशुद्धता का एक परिणाम भी सुधार हुआ है, यह भी दक्षता उच्च है, इसलिए बैंड पूंछ कम और इसलिए शिखर एकीकरण और अधिक सटीक है। 22:78 की एक दुकान के विभाजन अनुपात (केंद्र: परिधीय) के साथ निरोध और मात्रा का ठहराव का उपयोग कर सीएफ स्तंभों की सीमा। भी पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी स्तंभ 23 से अप करने के लिए 2.3 गुना सुधार किया गया चित्रा 5 butylbenzene के लिए पता लगाने प्रतिक्रिया के पास सीमा नहीं दिखाता है सीएफ की स्थिति और पारंपरिक शर्तों के तहत शिखर।
कॉम करने के लिए एक महत्वपूर्ण पहलूसीएफ और पारंपरिक स्तंभों के बीच parison कि चित्रा 4 में स्पष्ट नहीं है सीएफ की शर्तों के तहत नमूनों में analytes के लिए चोटी की मात्रा में कमी आई है। चित्रा 4 समय के संबंध में चोटियों प्रस्तुत करता है, हालांकि, सीएफ मोड ही के एक हिस्से में जब से कुल प्रवाह के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, शिखर चौड़ाई मात्रा के संबंध में समायोजित किया जा सकता है। चित्रा 6, एक पारंपरिक 4.6 मिमी आईडी स्तंभ CF के लिए चोटी की मात्रा (22:78) के संबंध में butylbenzene क्षालन प्रोफ़ाइल तुलना एक 'वर्चुअल' 2.1 मिमी आईडी नकल और एक पारंपरिक 2.1 मिमी आईडी सीएफ और पारंपरिक 2.1 मिमी स्तंभों के बीच शिखर मात्रा लगभग समान था, हालांकि, पारंपरिक 4.6 मिमी स्तंभ के शिखर मात्रा के बारे में 5 बार पारंपरिक 2.1 मिमी और सीएफ दोनों से बड़ा (22:78) । महत्वपूर्ण बात है, सीएफ मोड में चोटी मात्रा में कमी के संकेत प्रतिक्रिया की कमी में परिणाम नहीं था, बल्कि पारंपरिक स्तंभों की तुलना में लगभग 3 गुना की वृद्धि regardlआंतरिक व्यास 23 के ईएसएस। हालांकि शिखर मात्रा में कमी यूवी विज़ पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण नहीं हो सकता, उसी का पता लगाने की प्रक्रिया है कि प्रवाह की दर निर्भर या सीमित है, उदाहरण के लिए, मास स्पेक्ट्रोमीटर या बाष्पीकरणीय प्रकाश बिखरने डिटेक्टर लिए कर रहे हैं के लिए नहीं कहा जा सकता।
संकरा बोर पारंपरिक स्तंभों की तरह है कि आपरेशन के सीएफ मोड में नुकसान के बाद स्तंभ मृत मात्रा का प्रभाव है, जो काफी संकेत तीव्रता में बैंड विस्तृत बनाने और क्षय के कारण से जुदाई प्रदर्शन को खराब कर सकते हैं करने के लिए अपनी संवेदनशीलता है। हालांकि, प्रवेश पर मृत मात्रा कम महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, पोस्ट-स्तंभ नलिका के कारण देखभाल इष्टतम सीएफ जुदाई प्रदर्शन के लिए आवश्यक है। सीएफ क्रोमैटोग्राफी भविष्य अनुप्रयोगों में काफी संभावना है कि स्तंभ प्रौद्योगिकी के एक काफी नया रूप है। उदाहरण के लिए, सीएफ स्तंभ के केंद्र में एक कम एकाग्रता नमूना इंजेक्शन, दीवार से 'पर्दे' है (परिधीय) मोबाइल चरण एकाग्रतासीएफ स्तंभ के केंद्र के भीतर नमूना रेटिंग, और इस प्रकार संकेत प्रतिक्रिया को अधिकतम। आउटलेट पर ही केंद्रीय 'केंद्रित' नमूना युक्त प्रवाह डिटेक्टर के लिए ले जाया जाता है, संवेदनशीलता में वृद्धि हुई है, ऐसे एमएस के रूप में 6 प्रवाह सीमित डिटेक्टरों पर उच्च प्रवाह दरों का उपयोग उच्च गति के विश्लेषण के लिए आदर्श प्रदान करते हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
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