Introduction
Son yıllarda Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) için kolon teknolojisi çok gelişmiş olan; zirve kapasiteleri büyük ölçüde küçük parçacık boyutlarının kullanılması ve daha verimli çekirdek kabuk parçacıklarına ölçüde sayesinde artmıştır. Ayrılmalar genellikle daha verimli olduğundan zirveleri artık daha keskin ve 1-8 dolayısıyla uzun boylu, çünkü bir akış üzerindeki etkisi duyarlılığında bir artış olmuştur.
Bununla birlikte, radyal yatak heterojenlik tüm sütunlara performansında bir sınırlayıcı faktör hala, ama bu chromatographers yıllardır bu bilinen beri yeni bir hikaye değil. Sütun yatak radyal yönde 9-12 hem heterojen olup, 10,12-15 eksen sütun boyunca. Duvar etkisi özellikle ayırım performansı 7,16-18 kaybı önemli bir katkıda bulunuyor. Shalliker ve Ritchie 7 geçenlerde sütun yatak heterojenite yönlerini gözden geçirilmiş ve dolayısıyla bu Tartışılan olması gerekmezd burada daha. Kâfi demek olsa da, sütun yatak ambalaj yoğunluğu değişim ve duvar etkileri bantları kısmen çorba dolu andı- fişleri sütun aracılığıyla Zehir şekilde çözünen fişin bir bozulma, neden bu oldukça olan ince düz katı diskler 7 den çanaklar genellikle temel öğretim metinlerinde tasvir. Deneyler yatağı boyunca çözünen göç görüntülenmiştir ki böyle yapılmıştır zaman sütun içinde fiş profilleri kısmen boş ve bandın atık bölümü büyük ölçüde örnek fiş duvar bileşenidir. Sonuçta bu diskler, katı ve 12,14,17 düz olsaydı gerekli olandan bu 'kısmen boş' fişleri ayırmak için çok daha fazla tabak almasıdır. Duvar etkileri ve radyal ambalaj yoğunluğu varyasyon ile ilişkili sorunların genişleten grup üstesinden gelmek için, Aktif Akış Teknolojisi (AFT) olarak bilinen kolon teknolojisinin yeni bir form 7,19 tasarlanmıştır. Bu tasarımın amacı neydisütunun 19 radyal merkezi bölgesinde akıtılarak mobil fazın böyle olduğunu, duvar bölge boyunca çözücü salgılayan fiziksel ayırma yoluyla duvar etkilerini ortadan kaldırmak için. AFT sütunların iki ana türü vardır; Paralel Segment Akış (PSF) sütunlar ve Perde Akışı (CF) kolonlar 7. Bu protokol CF kolonların kullanımı ve optimizasyon amaçlı olduğundan, PSF sütunları daha ayrıntılı olarak ele alınmayacaktır.
Perde Akış (CF)
Perde Akış (CF) sütun biçimleri giriş ve sütunun çıkışında hem de AFT son parçaları kullanmaktadır. AFT sonu ekleri bir çok portlu montaj içinde bulunan bir dairesel frit oluşur. Frit üç kısımdan oluşur: bağlantı ucunun orta noktasına, uç teçhizat çevresel bağlantı (lar) ile aynı hizada olan bir gözenekli dış kısmı ve su geçirmez bir halka ile hizalı olan bir gözenekli, radyal merkezi kısım olduğu herhangi bir çapraz engelleyen iki gözenekli kısımları ayıran. frit 19 radyal merkezi ve dış bölgeleri arasındaki akışı ile 1 AFT frit tasarımını göstermektedir ve Şekil 2 CF sütun biçiminde göstermektedir. ek mobil faz, radyal merkezi bölgesi ile eriyiklerin göçü 'perde' girişine çevresel bağlantı noktası üzerinden sokulur iken bu operasyon modu (CF), numune, Ek giriş radyal merkezi bağlantı noktasına enjekte edilir sütun. Bu nedenle örnek, yalnızca geçtiği mobil faza sahip kolonun dış bölge sütunun radyal orta bölgesinde bir yatak girer. (: Periferik bağlantı noktası merkez) 4.6 mm iç çapı (id) kolonu uç parçası girişi için uygun 6,7,16 olan çalışmalar yaklaşık 40:60 bir hacimsel akış hızı oranı göstermiştir. CF sütun kıç çıkışı göreceli kısmına merkezi ve çevresel akışın ayarına izin verir ve hemen hemen arzu edilen herhangi bir Rati için değişik olabilirbasınç yönetimi o. Bir CF sütunun optimizasyonu önemli ölçüde bu tür ayırma verimliliği veya algılama hassasiyeti gibi kolon teknolojisinin çeşitli fonksiyonel yönlerini artırabilir. Bu şekilde, bir "duvara az", "sonsuz çapı" ya da "sanal" sütunu 6,10,18,20 kurulur. CF sütun amacı aktif duvar bölgesine ulaşma numunenin önlemek için kolon boyunca numunenin taşıma yönetmektir. Böylece, dedektöre çıkış üzerine çözünen konsantrasyonu Ultraviyole (UV) algılama 16 kullanırken ve hatta kitle spektral algılama 6 kullanarak daha zaman geleneksel kolon biçiminden daha yaklaşık 2,5 kat daha fazladır duyarlılığını artırarak, maksimize edilir.
algılama hassasiyeti artar beri CF sütunlar ideal düşük konsantrasyon numuneler için uygundur. Bu kütle spektrometresi (MS), 6 olarak hızlı sınırlı dedektörler, akış eşlendiğinde Dahası, idealdir. bir AÖrneğin bir 4.6 mm kimliği biçiminde FT kolon,% 21 orta akışını çıkan ayarlayarak, aynı doğrusal hızlarda çalıştırıldığında, standart 2.1 mm id biçimi sütunu olarak bir dedektörün çözücünün aynı hacimde teslim ayarlanmış olabilir. Aynı şekilde AFT sütun da% 43'e merkezi akışını çıkan ayarlayarak, bir 3.0 mm id sütunu olarak bir dedektörün aynı hacim yükü teslim ayarlı olabilir. Aslında, herhangi "sanal" sütun biçimi analitik gereksinimi 6,18,22 göre üretilebilir. Girişte bu özel olarak tasarlanmış son parçaları kullanarak ve çıkış gerçek bir duvar daha az sütun kurulmuş olmasını sağlar.
Girişin santral ve periferik limanlarına solvent dağıtım sistemi kurmak için iki yol vardır:. Split akış sistemi 6 ve iki pompa sistemi 6,7 3 bu CF sistemi set up her göstermektedir Şekil.
Split-akış sistemi
benna bölünmüş akış sistemi (Şekil 3A) enjektör giden pompa akışı mobil faz bir akış akışı daha sonra bağlanır enjektörüne bağlı bir sıfır ölü hacim T-parçası ile bölünmüş ön enjektörün sütunun giriş sonu montaj merkezi bağlantı noktası. Mobil fazın ikinci akış akışı enjektör by-pass ve sütun girişine çevresel bağlantı noktasına bağlıdır. Merkezi ve periferik için pompa enjektörden, çizgiler kolonuna bağlanmadan önce, yani: akış bölme sırasında, akım akışı oranı 40:60 (çevresel merkezi) ayarlanır.
İki pompa sistemi
CF sütun sütun giriş sonu uydurma iki akış akışı gerektirir. Ayarlamak HPLC aleti, bölünmüş akış otomatik örnekleyici / enjektör türüne bağlı olarak mümkün olmayabilir ve bu nedenle KF sonra 2 pompa (Şekil 3B 21) ile elde edilebilir. Her pompa ayrılan ve merkezi ya da periferal bağlantı ve akış hızı, merkezi bağlantı noktası için akış% 40 ve periferik bağlantı noktası için% 60 temsil etmek üzere ayarlanır, ya bağlanır. Toplam akış oranı 1.0 ml dk-1 ise, örneğin, merkezi bir pompa akış hızı, 0.4 ml min ayarlanır -1 ve periferik pompası 0.6 ml dk -1 ayarlanır.
çalışma modu seçimi HPLC enstrümantasyon ve operasyon kromatografik modunda büyük ölçüde bağlıdır. Örnek yük konumu ve numune arasındaki basınç değişikliği pozisyon bölünmüş akış oranını bozan oluşabilir ve böylece bu durumda kurmak çift pompa optimum CF performans için önerilen olacağını enjekte bazı otomatik numune alma cihazı Örneğin. Ne olursa olsun CF sütunun girişi için seçilen kurmak solvent dağıtım sistemi, CF çıkış optimizasyonu aynı kalır. CF sütunun çıkış merkezi liman Smal ile Ultraviyole-Görünür (UV-Vis) dedektör bağlı olduğuHortumun olası hacmi diye post-kolon ölü hacim etkilerini en aza indirmek için. CF sütunlar dar delik sütunlar taklit beri, kolon çıkışına ve dedektör arasındaki ölü hacim CF sütunun ayırma performansı için zararlıdır. Merkez liman ve böyle verimlilik ve hassasiyet band genişletilmesi, kayıp olarak ölü hacim etkilerini en aza indirmek için UV-Vis dedektör arasındaki boru hacminin küçük miktarda sağlamak için kritik öneme sahiptir. Dolayısıyla, dar delik boru (0.1 mm id) kullanımı kolay uygunsuz ölü hacim eklemeden basınç ayarlamaları izin tavsiye edilir. Boru, aynı zamanda periferal noktasına bağlanır ve atık yöneliktir. CF sütunun çıkışma üzerine bölütleme oranı analisti amaca uygun herhangi bir orana ayarlanabilir. 4.6 mm id CF kullanıldığında, örneğin, ya 43:57 ya 21:79 (merkezi: periferik) olarak oranını ayarlamak için sık sık uygun bir 'sanal' 3,0 mm id sütunu veya 2.1 mm id sütunu taklit,saygıyla. Bu şekilde ayırma performansı kolayca tezgah işaretlenmiş olduğunu. segmentasyon oranı merkez bağlantı noktasına bağlı ve bir dönem zamanla çevresel port çıkan akış olduğunu dedektör çıkan akış miktarını tartılması ile ölçülür. Her bir bağlantı noktası üzerinden yüzde akışı daha sonra tespit edilebilir ve oranlar tüpüne eklenmiş uzunluğunu değiştirerek ya da başka bir iç çapa (id) sahip olan boru sistemi kullanılarak ayarlanabilir.
Bu video protokolü gelişmiş kromatografik performans için CF kolonun çalışma ve optimizasyon prosedürleri ayrıntıları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: (metanol, yani MSDS) kullanmadan önce tüm malzeme ve reaktifler için malzeme güvenlik veri sayfaları (MSDS) bakınız. çözücüler ve Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) yıkayıcı işlerken tüm uygun güvenlik uygulamalarının kullanımını sağlamak. HPLC, analitik terazi ve dedektör enstrümantasyon mühendislik kontrollerinin uygun kullanımını sağlamak ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı parmak ayakkabı) kullanımını sağlamak.
Not: Bu protokol UV-Vis detektörü ile birleştiğinde bir HPLC sistemi üzerinde bir CF sütunu nasıl kullanılacağına ilişkin talimatlar yer almaktadır. protokol okuyucu varsayarak kromatografi temel bilgi ve deneyime sahiptir yazılmıştır.
HPLC Enstrüman 1. Kur
Not: çözücülerin seçimi, dedektör dalga boyu, Bu bölümde yani analistlerin ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir ve akış hızı oİlgili örnek uygundur.
- Mobil faz olarak B hattı hat A için% 100 saf su ile HPLC aleti (örneğin, Milli-Q su) ve% 100 metanol hazırlamak ve üretici şartının pompaları temizleyin.
- 254 nm UV-Vis detektörü ayarlayın.
- set-up öncesi bir enjeksiyon akış bölme modunu, ya da bir çift pompa akış set-up birini seçin. Bölünmüş akış modu için Adım 3'e geçin çift pompası modu için, 2. Adıma geçin.
2. Split-akış Sistem Kurulumu
- Otomatik numune enjektör vanasından pompa hattını ayırın.
- Pompa hattına T-parça takın.
- T parçasının her porta 0.13 mm ID tüp 15 cm parça eklemek.
- Otomatik numune vana enjektör T-parça bir tüp bağlayın.
- 1.0 ml dk pompayı -1.
- % 40 KF sütunun girişine, ayarlamak için akış segmentasyon oranını pompa hatları bağlamadan önce: 6 % 0 (merkez hattı: periferik çizgi) olarak adım 2.7 izler.
- Bölünmüş akış sistemi üzerinde CF giriş oranının Tuning
- bir analitik terazi kullanılarak iki boş toplama gemilerin kitle ölçün ve bir toplama merkezi damar ve (periferik bağlantı noktasına T-parça hattı için bağlantı noktası ve bir merkezi otomatik numune hat için bir tane) periferik diğerini etiket .
- 1.0 dakika boyunca, olan kütle 2.7.1 ölçülmüştür toplama kabı içine (kolon bağlanacak noktasında) enjektör gelen hat çıkan mobil faz toplanır.
- Analitik ölçekte toplama kabı yeniden tartın ve toplanan mobil faz kütlesini belirler.
- Tekrarlayın periferik bağlantı noktasına bağlı olan T-parçasından hattı çıkan eluent için 2.7.3 için 2.7.2 adımları.
- Akış oranını belirlemek (mi dak-1), aşağıdaki denklemlere göre akış her bir çizginin:
1 "src =" / files / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/> - % 40 akış oranını ayarlayın:% 60 (±% 2) (merkez noktasına enjektörden hattı: periferal noktasına T-parça çizgi). Merkezi bağlantı noktası akış oranına enjektörden hattı% 40 üzerinde ise, boru iç çapı azaltarak veya bunun uzunluğunu arttırarak basınç düşüşünü artırır. Merkezi bağlantı noktası akış oranına enjektörden hattı 40% altında ise, boru iç çapı artırmak veya borunun uzunluğunu azaltır.
- Akış oranları ayarlanmış sonra pompa kapalı akış açın.
- Kolon girişinin merkez liman ve kolon girişinin periferal portuna T-parça hattına enjektörden hattı bağlayın.
- Yavaş yavaş 1.0 ml dak akış hızı -1% 100 hat B'de rampa
- izin vererek kolon (4.6 mm id x 100 mm uzunluk) dengelenmesi100% metanol (hat B) Hareketli faz, 1.0 ml dk sütun aracılığıyla akan akış -1 10 dakika karıştırıldı. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre tartılır.
- CF çıkış ayarı için 4. 'CF çıkış akımının Tuning' Adım gidin.
3. İkili Pompa Sistem Kurulumu
- enjektöre HPLC sistemi pompası bağlayın ve sonra sütunun merkezi giriş portuna enjektörden hattı bağlayın.
- Sütunun giriş periferik bağlantı noktasına doğrudan ek pompası bağlayın. bu ikinci pompa enjektör by-pass edip unutmayın.
- 0.4 ml dk -1% 100 Metanol (hat B) (1.0 ml dk -1 toplam debi% 40 temsilcisi) merkezi bağlantı noktasına bağlı sistem pompanın debisini rampa.
- Aşama 3.3 ile aynı zamanda, toplam akış bölgesinin% 60 0.6 ml dak-1 (temsilcisine periferal pompa akış hızını rampa1.0 ml dk -1) 100% Metanol (hat B).
- 1.0 ml dk sütun aracılığıyla akan akış -1, 10 dakika boyunca% 100 metanol (hat B) Hareketli faz vererek kolonu (4.6 mm iç çap x 100 mm uzunluk) dengelenmesi. Bu sefer kullanıcı istihdam diğer sütunların boyutlarına göre tartılır.
- CF çıkış ayarı için 4. 'CF çıkış akımının Tuning' Adım gidin.
CF Outlet Akış 4. Tuning
- 0.13 mm ID tüp 15 cm parça kullanılarak UV-Vis detektörü merkezi çıkış portunu bağlayın.
- CF sütunun periferal çıkış ağzına 0.13 mm ID tüp 15 cm parça bağlayın.
- analitik terazi iki boş toplama gemilerin kitle tartılır ve bir gemi santral ve diğer çevresel etiket.
- 1.0 dakika boyunca, kütle 4.2 olarak ölçüldü merkezi toplama kabı etiket, içine UV-Vis detektörü (merkezi akış) çıkan mobil faz toplamak.
- Analitik ölçekte Toplanan geçen madde ihtiva eden toplama kabı yeniden tartın ve toplanan mobil faz kütlesini belirler.
- Tekrarlayın 4.4 çevresel çıkış noktasından hattı çıkan eluent 4.5 için yineleyin.
- Aşağıdaki denklemlere göre akışının her hattından akışı yüzdesini belirlemek:
- UV-Vis merkez akış yüzdesi% 21 üzerinde ise, basınç düşüşünü artırır.:% 79 (±% 2) (hattından periferik çıkış akımını UV-Vis merkez çıkış akışı:)% 21 akış oranını ayarlayın UV-Vis detektörü çıkış bağlanmış boru iç çapı azaltarak veya bunun uzunluğunu arttırır. UV-Vis gelen orta akış oranı% 21 altında ise, UV-Vis detektörü çıkış bağlanmış boru iç çapı artan, veya borunun uzunluğunu azaltır. boru uzunluğu değişmiştir her zaman, tekrar4.7 4.3 adımları tekrarlayın.
Not: "sanal" 2.1 mm İD modunda CF kolon analiz için hazır hale gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AFT sütunlar sütun yatak heterojenitesini üstesinden gelmek ve ayırma performansını artırmak için birden çok sütun son parçaları uzmanlaşmış bir frit tasarımı (Şekil 1) kullanılarak geliştirilmiştir. CF kromatografi sütunları (Şekil 2) ayrılması performansına arası laboratuar çalışması bu protokol 23 3. bölümünde açıklandığı gibi (Şekil 3B) kurmak çift pompa sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Üç bileşenli test karışımı CF sütunun orta çıkış akışının% 21 dedektör yönelik bir 'sanal' 2.1 mm id yoluyla altında analiz edildi. Üç bileşen test karışımının ayrılması, standart sütun için bir CF kolon nisbetle verimliliği ve hassasiyet açısından geliştirilmiş performans göstermektedir. üç bileşenli test karışımı fenetol, bütilbenzen ve pentilbenzen bulunan ve geleneksel 4.6 ve 2.1 mm id sütun ve bir 4.6 üzerinde analiz edildi 22:78 (merkezi: periferik) bir segmentasyon oranıyla mm id CF kolonu 2.1 mm id (Şekil 4) taklit etmek. Ayırma verimliliği plaka sayısı (N) ve duyarlılık açısından değerlendirilmiştir. Analiz için CF sütunun kullanımı alt saptama sınırı (Şekil 5) ve duyarlılıkta bir artış göstermiştir (Şekil 4 ve 6), geleneksel sütun analizleri ile karşılaştırıldığında. Aynı zamanda bağımsız laboratuar veya istihdam edilmektedir HPLC sistemine tipi, CF sütun için ayırma performans sonucu CF kromatografi kolonları 23 kullanıldığında tüm gelişmiş ayırma performansı elde nispeten aynı olduğu görülmüştür.
Aktif Akış Teknolojisi kolon uç parçası frit tasarımı 1. İllüstrasyon Şekil. OAD / 53471 / 53471fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. AFT sütun -. CF sütun biçimi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
(A) Bölünmüş akış sistemi kurulumu ve (B) 2 pompa sistemi kurulumu CF sütun giriş akışının Şekil 3. Set up. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/53471fig4.jpg "/>
Şekil 4. Ultimate 3000 sistemi kullanılarak elde edilen üç bileşen testi karışımının tipik bir ayrılık. (A) Konvansiyonel 4.6 mm id kolon, (b) Konvansiyonel 2.1 mm id kolonu, (c) Perde akış kolonu% 22 çıkış segmentasyon ile çalışan oranı. Çözünen: (i) fenetol, (ii) bütilbenzen ve (iii) pentil. Bu rakam 23 ile çıkarılan edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. elüsyon bandı (a) geleneksel kolon üzerinde saptama sınırının en bütilbenzen profilleri, ve (b) perde akışı kolonu sistemi: 2.0 ml / dakika, 5 ul enjeksiyon, 254 nm'de bulgulama de Shimadzu.. Bu rakam elde edilmiştir
Nihai 3000 sistemi üzerinde elde bütilbenzen elüsyonu profilleri Şekil 6. karşılaştırması. (A) geleneksel 4.6 mm kolon, (b), geleneksel 2.1 mm İD kolonu, (c)% 22 çıkış segmentasyonuna perde akışı sütunu oranı. Bu rakam 23 ile çıkarılan edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma verimliliği ve duyarlılık açısından analitik performansını test etmek için CF kromatografi kolonlarının laboratuvarlar arası analizini içeriyordu. 3 'kısmında tarif edildiği gibi CF kolonu ikili pompa sistemi ile oluşturulmuştur. (: Periferik merkezi) CF sütunun girişine çift pompa sistemi 40:60 akış oranını elde etmek için 'kurdu. 40:60 (merkez: Periferik) akış oranı, sırasıyla,% 40 ve toplam akış hızının% 60 temsil değeri her bir pompanın akış oranının ayarlanması ile elde edildi. CF kolon çıkış 'bölümünde açıklanan prosedürü izleyerek 2.1 mm'lik bir kimliğe sahip bir' sanal 'sütununda ayarlı, 4. CF çıkış akışının Tuning '. Fenetol, bütilbenzen ve pentil ihtiva eden bir numune karışımı 4.6 mm CF kolonu (22:78) ve geleneksel 4.6 ila 2.1 mm ID sütunlar arasında bir ayırma performansı karşılaştırma için bir test standardı olarak kullanılmıştır. Şekil 4 kromatografisi yolu bir şablonudurTest karışımının hic ayrılması üç sütun her kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu şekilde görülen başlıca fark, CF kolonu kullanılarak elde edilen ayrılması için sinyal cevap olarak artmasıdır. 4.6 ila 2.1 mm ID, geleneksel sütun için sinyal yanıtı Kromatografik koşullar sütun kesit yüzeyi ölçeklenerek gibi beklendiği gibi hemen hemen aynı idi.
Doğrusallık ve algılama sınırları da CF ve standartların bir dizi hazırlanmış ve farklı akış hızlarında farklı HPLC sistemlerinde çoğaltır analiz edilmiştir operasyonun, geleneksel modları arasında değerlendirildi. Ne olursa olsun hangi HPLC sistemi kullanıldı ve hangi debisi analizi sonucu esas CF için sinyal yanıtı her zaman diğer geleneksel sütunları anlamlı olarak daha fazla idi nerede, aynıydı de oldu. Sinyal tepki kazançları geleneksel sütunlar daha tipik olarak 1,7 ve 2,8 kat daha yüksekti. 5 katÖlçümlerin hassasiyetini iyileşme - düşük standart serisi için pik yüksekliğinin (yani, nispi standart sapma MSB%), geleneksel 2.1 mm İD sütunu ile karşılaştırıldığında% 22 işlem CF modu için gözlenmiştir. CF nedeniyle CF ile elde edilen duyarlılık artışı zirve ölçümlerin hassasiyetini artırır MSB değeri daha düşük sinyal yanıtı büyük. gelişmiş sinyal yanıt zirve hassas bir sonucu da geliştirilmiş olarak bantları kuyruk az ve dolayısıyla zirve entegrasyon daha hassas yani Böylece, aynı zamanda verimliliği daha yüksektir. 22:78 bir çıkış segmentasyon oranı (merkezi: periferik) ile gözaltı ve miktar kullanarak CF sütun sınırları. Ayrıca geleneksel 2.1 mm id kolonuna 23 den fazla 2,3 kat düzeldi Şekil 5 bütilbenzen için algılama yanıt yakın sınırını göstermektedir CF koşulları ve geleneksel şartlar altında yoğun.
com için önemli bir yönüŞekil 4'te açık değildir CF ve geleneksel kolon arasındaki hamur CF koşullarında örneklerde analitler için pik hacim azalması. 4 sadece bir kısmı KF modunda, ancak, çünkü zamana göre tepe noktalanna Şekil toplam akış Şekil 6. pik genişliği hacmine göre ayarlanmış olabilir, kullanılan sanal '2.1 mm İÇ taklit CF için en yüksek hacim (22:78) ile ilgili olarak, geleneksel bir 4.6 mm kolon bütilbenzen elüsyon profilini karşılaştırır olan ve geleneksel bir 2.1 mm id CF ve geleneksel 2.1 mm sütunlar arasındaki zirve hacmi (22:78) Ancak, konvansiyonel 4.6 mm sütunun tepe hacmi geleneksel 2.1 mm ve CF hem yaklaşık 5 kat daha büyük olduğu, hemen hemen aynıydı . Önemli olarak, CF modunda en yüksek hacmi azalma sinyal tepkisinin bir azalmaya neden yoktu, ama daha çok geleneksel olan kolonların sayısına göre yaklaşık 3 kat bir artış regardliç çapı 23 ess. pik hacminde bir azalma, UV-Vis tespiti için önemli olmayabilir, ancak aynı örnek, kütle spektrometresine veya buharlaştırarak ışık saçma detektörü için, akış hızı bağımlı veya sınırlı algılama işlemleri için söylenemez.
dar-delik geleneksel sütunların böyle operasyon CF moduna dezavantajı önemli ölçüde sinyal yoğunluğundaki bant genişlemesine ve çürümesine yol açarak ayırma performansı düşürebilir post-kolon ölü hacim etkisi, onun duyarlılığıdır. Bununla birlikte, girişteki ölü hacim daha az önemlidir. Böylece, post-kolon boru nedeniyle bakım optimum CF ayırma performansı için gereklidir. CF kromatografisi gelecek uygulamalarda büyük bir potansiyele sahiptir kolon teknolojisi oldukça yeni bir şeklidir. Örneğin, CF sütunun merkezine düşük yoğunluklu numune enjeksiyonu, duvar 'perdeli "bir (periferik) mobil faz sonra konsantrasyonlarCF sütunun merkezi içinde örnek reytinge ve böylece sinyal yanıtı maksimize. Prize bağlı 'konsantre' örnek içeren sadece merkezi akış gibi MS 6 gibi akış sınırlı dedektörleri yüksek akış oranları kullanılarak yüksek hızlı analizi için ideal hassasiyetinde bir artış sağlayarak, dedektör alınır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HPLC instrument | |||
| Additional Pump | Required if 2 pump CF system set up is to be used. | ||
| Curtain Flow HPLC column | Thermo Fisher Scientific | Not Defined | Soon to be commercialized |
| Methanol | Any brand | HPLC Grade | |
| PEEK tubing | Any brand | Various lengths and i.d. | |
| PEEK tube cutter | Any brand | ||
| Analytical Scale Balance | Any brand | ||
| Stop watch | Any brand | ||
| Eluent collection vessels | Any brand | 1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels | |
| T-piece | Any brand |
References
- Camenzuli, M., et al. The use of parallel segmented outlet flow columns for enhanced mass spectral sensitivity at high chromatographic flow rates. Rapid Commun. Mass Sp. 26 (8), 943-949 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Enhanced separation performance using a new column technology: Parallel segmented outlet flow. J. Chromatogr. A. 1232 (0), 47-51 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Gradient elution chromatography with segmented parallel flow column technology: A study on 4.6mm analytical scale columns. J. Chromatogr. A. 1270 (0), 204-211 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Shalliker, R. A. Improving HPLC separation performance using parallel segmented flow chromatography. Microchem. J. 111 (0), 3-7 (2013).
- Camenzuli, M., et al. Parallel segmented outlet flow high performance liquid chromatography with multiplexed detection. Anal. Chim. Acta. 803 (0), 154-159 (2013).
- Kocic, D., et al. High through-put and highly sensitive liquid chromatography-tandem mass spectrometry separations of essential amino acids using active flow technology chromatography columns. J. Chromatogr. A. 1305 (0), 102-108 (2013).
- Shalliker, R. A., Ritchie, H. Segmented flow and curtain flow chromatography: Overcoming the wall effect and heterogeneous bed structures. J. Chromatogr. A. 1335 (0), 122-135 (2014).
- Shellie, R., Haddad, P. Comprehensive two-dimensional liquid chromatography. Anal. Bioanal. Chem. 386 (3), 405-415 (2006).
- Abia, J. A., Mriziq, K. S., Guiochon, G. A. Radial heterogeneity of some analytical columns used in high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 1216 (15), 3185-3191 (2009).
- Knox, J. H., Laird, G. R., Raven, P. A. Interaction of radial and axial dispersion in liquid chromatography in relation to the "infinite diameter effect". J. Chromatogr. A. 122 (0), 129-145 (1976).
- Miyabe, K., Guiochon, G. Estimation of the column radial heterogeneity from an analysis of the characteristics of tailing peaks in linear chromatography. J. Chromatogr. A. 830 (1), 29-39 (1999).
- Shalliker, R. A., Scott Broyles, B., Guiochon, G. Axial and radial diffusion coefficients in a liquid chromatography column and bed heterogeneity. J. Chromatogr. A. 994 (1-2), 1-12 (2003).
- Gritti, F., Guiochon, G. Effects of the thermal heterogeneity of the column on chromatographic results. J. Chromatogr. A. 1131 (1-2), 151-165 (2006).
- Shalliker, R. A., Wong, V., Broyles, B. S., Guiochon, G. Visualization of bed compression in an axial compression liquid chromatography column. J. Chromatogr. A. 977 (2), 213-223 (2002).
- Tallarek, U., Albert, K., Bayer, E., Guiochon, G. Measurement of transverse and axial apparent dispersion coefficients in packed beds. AICHE J. 42 (11), 3041-3054 (1996).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. Active flow management in preparative chromatographic separations: A preliminary investigation into enhanced separation using a curtain flow inlet fitting and segmented flow outlet. J. Sep. Sci. 35 (3), 410-415 (2012).
- Shalliker, R. A., Broyles, B. S., Guiochon, G. Physical evidence of two wall effects in liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 888 (1-2), 1-12 (2000).
- Shalliker, R. A., Camenzuli, M., Pereira, L., Ritchie, H. J. Parallel segmented flow chromatography columns: Conventional analytical scale column formats presenting as a 'virtual' narrow bore column. J. Chromatogr. A. 1262 (0), 64-69 (2012).
- Camenzuli, M., Ritchie, H. J., Ladine, J. R., Shalliker, R. A. The design of a new concept chromatography column. Analyst. 136 (24), 5127-5130 (2011).
- Foley, D., et al. Precision and Reliability: an Intercontinental Study of Curtain Flow Chromatography. Thermo Scientific. , (2013).
- Pravadali-Cekic, S. Multidimensional Approaches for the Analysis of Complex Samples using HPLC. University of Western Sydney. , PhD thesis (2014).
- Soliven, A., et al. Improving the performance of narrow-bore HPLC columns using active flow technology. Microchem. J. 116 (0), 230-234 (2014).
- Foley, D., et al. Curtain flow chromatography ('the infinite diameter column') with automated injection and high sample through-put: The results of an inter-laboratory study. Microchem. J. 110 (0), 127-132 (2013).
