Summary
Mikrowellen-Technologie ermöglicht extrem schnelle Synthese von Eisenoxid-Nanopartikeln für Atherosklerose Plaquecharakterisierung. Die Verwendung eines Aminobisphosphonat in der Außenseite des Nanopartikels bietet eine schnelle Anreicherung in der atherosklerotischen Bereich.
Abstract
Eine schnelle und reproduzierbare mikrowellengesteuertes Protokoll wurde für die Synthese von Neridronat-funktionalisierten Nanopartikel entwickelt. Ausgehend von der Synthese von hydrophoben Nanopartikeln, ist unsere Methode basiert auf einer Anpassung von Verfahren zur thermischen Zersetzung Mikrowellen angetrieben Synthese. Die neue Methodik erzeugt eine Verringerung der Reaktionszeiten im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren. Darüber hinaus erhöht die Verwendung der Mikrowellentechnik, die Reproduzierbarkeit der Reaktionen, was wichtig vom Standpunkt der klinischen Anwendungen. Die Neuheit dieses Eisenoxid-Nanopartikel ist die Befestigung von Neridronat. Die Verwendung dieses Moleküls führt ein Bisphosphonat - Einheit in Richtung der Außenseite des Nanopartikels , das Ca 2+ Bindungseigenschaften in vitro und in vivo eine selektive Anreicherung in der Atherom Plaque liefert. Das Protokoll ermöglicht die Synthese und Plaque-Erkennung in etwa 3 Stunden seit der ersten Synthese von organic Vorläufer. Ihre Anreicherung in der atherosklerotischen Bereich in weniger als 1 Stunde liefert ein Kontrastmittel, insbesondere geeignet für klinische Anwendungen.
Introduction
Atherosklerose ist eine multifaktorielle chronische entzündliche Erkrankung der Wandung arterielle aus einem deregulierten Lipidstoffwechsel und einem fehlerhaften Entzündungsreaktion. Aufgrund der Prävalenz und die wirtschaftlichen und sozialen Kosten von kardiovaskulären Erkrankungen dieser und verwandten besteht ein wachsendes Interesse an der Pathologie mit neuen Werkzeugen in Adressieren, von denen Nanotechnologie eine der vielversprechendsten ist. 1-3 Jedoch gibt es sehr wenige Beispiele für schnelle Herstellung und Charakterisierung von Sonden , die für die Übersetzung in die Klinik 4 in diesem Protokoll verwenden wir eine Mikrowellensynthese von Eisenoxid - Nanopartikel zur weiteren Funktionalisierung mit einem Bisphosphonat und in vivo Detektion von Atherosklerose in ApoE basisch ist -. / -. Mäuse in 1 Std 5 Eisenoxid-Nanopartikel (IONP) sind eine bekannte Nanomaterial und seine Verwendung als Kontrastmittel für Magnetic Resonance Imaging (MRI) hat sich für den Nachweis verschiedener Krankheits etablierts in den letzten Jahren. 6-8
Mikrowellensynthese (MWS), ermöglicht Nanopartikel in extrem kurzen Zeiten mit hoher Reproduzierbarkeit und verbesserte Ausbeuten zu synthetisieren. 9,10 In unserem Protokoll erhalten wir IONP mit Plaque - Fähigkeiten in drei Schritten Targeting. Die letzte ist die Befestigung eines Aminobisphosphonat, Neridronat, die aufgrund ihrer Calciumbindungseigenschaften in unserer Strategie Schlüssel. Aufgrund ihrer natürlichen analogen Pyrophosphat (PPi), Neridronat wurde bei der Behandlung von Osteogenesis imperfecta (OI) und der Paget-Knochenkrankheit (PDB) für ihre hohe Affinität zu Knochenmineral verwendet. 11-13
Die drei Schritte des Protokolls sind in Schema 1 zusammengefasst ersten und zweiten Stufen durchgeführt werden Mikrowellentechnik. Erster Schritt bereitzustellen Ölsäure überzogenem Eisenoxid - Nanoteilchen (OA-IONP) durch eine Modifikation der veröffentlichten Verfahren. 14 Das Protokoll ist eine Anpassung an Mikrowellensynthese des traditthermische Zersetzung ional Synthese. 15,16 Eine Mischung , die Fe (acac) 3, Ölsäure, Oleylamin und 1,2-Dodecandiol wird in Benzylalkohol gelöst und bei zwei Erwärmungsverfahren unterworfen. Reinigung wird durchgeführt, mit EtOH gewaschen und Sammeln der Teilchen mit einem Nd-Fe-B-Magneten um den Überschuss an oberflächenaktiven Mitteln in dem Überstand zu entfernen. Dann OA-IONP in CHCl 3 stabilisiert. Wie erwartet, aufgrund der sehr schnelle Erwärmung, zeigte die erwarteten Ergebnisse, dass die durch Mikrowellen kleiner synthetisierten Nanopartikel in Form von Kern (3,7 ± 0,8 nm) und hydrodynamischen Größe (7,5 nm) im Vergleich zu herkömmlichen thermischen Zersetzung; jedoch Nanopartikel noch eine hervorragende Kristallinität präsentieren.
Der zweite Schritt besteht in einer direkten chemischen Modifikation der Doppelbindung, die in der Ölsäure, ein starkes Oxidationsmittel wie KMnO 4 unter Verwendung der ursprünglichen Methode entwickelt , in unserer Gruppe für MW Bedingungen geändert wurde.17 Eine erste Stufe bildet , die Komplexe zwischen MnO 4 - und die Doppelbindung. Dann wird eine zweite Stufe in sauren Bedingungen produzieren die Spaltung des Moleküls Ölsäure Azelainsäure-IONP geben. Nach diesen zwei Stufen von 9 min jedem wird die Probe gereinigt, zuerst Waschen mit NaHSO 3 1% des Überschusses an MnO 4 zu reduzieren - zu MnO 2 und dann mit NaOH 1% zu neutralisieren , um die Säure.
Nach dem Reinigungsschritt, Azelain--IONP werden in 10 mM Phosphatpuffer pH = 7,2 stabilisiert. Dieser Puffer ist die beste Umgebung für die kolloidale Stabilität der Teilchen in ähnlicher Weise zu dem, was in der ursprünglichen, thermische Reaktion geschah. 18 die Verwendung von Mikrowellen für die direkte Oxidation der Doppelbindung enthalten in OA-IONP ist ein sehr gutes Beispiel für die Vorteile dieser Technik bei der Synthese von Nanopartikeln. Bei der klassischen Methode die Reaktion 24 Stunden dauert, nimmt die Nutzung von Mikrowellen die Reactipünktlich zu 18 min. Darüber hinaus zeigt die Mikrowellen-unterstütztes Protokoll eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit Nanopartikeln mit 30 ± 5 nm der hydrodynamischen Größe nach 4 Wiederholungen gibt. Neben der Änderung der hydrodynamischen Größe ist das Zeta-Potential ein guter Parameter, um schnell die erfolgreiche der Reaktions überprüfen. Aufgrund des Vorhandenseins der neuen Carboxylgruppen in Azelaic-IONP, ist der Wert für das Zeta-Potential -44 mV herum, sehr ähnlich dem Wert, der durch die thermische Ansatz erhalten.
Zur Befestigung von Neridronat zu Azelaic-IONP, traditionelle EDC / Sulfo-NHS Konjugation verwendet wird. 19 Dieser Syntheseansatz ist gut etabliert , da unter Verwendung eines aktivierten Carboxylats mit dem Sulfo-NHS gewährleistet kolloidale Stabilität während der Reaktion. Nach der Eliminierung von Phosphatpuffer die Reaktion mit Neridronat wird in 1 mM HEPES-Puffer (pH ~ 7) durchgeführt. Die Reaktion macht Neridronat-IONP mit einem hydrodynamischen Größe von 40 ± 4 nm in einer engen Größen distribution und -24,1 mV von Zeta-Potential.
Das Verfahren ist für die schnelle Synthese von IONP für in vivo Visualisierung von atherosklerotischen Plaques beschrieben , obwohl die Durchführbarkeit des Verfahrens die Befestigung jedes Peptid / Antikörper mit freien Aminen ermöglicht, die gleichen Bedingungen verwendet, für verschiedene Zwecke innerhalb der T 2 -gewichteten MRT - Kontrastmittel Feld.
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Protocol
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Vorbereitung 1 mM HEPES-Puffer, 23,8 mg HEPES in 100 ml destilliertem Wasser gelöst. Den pH-Wert auf 7.
- Herstellung von 10% NaHSO 3 Auflösen von 10 g NaHSO 3 in 100 ml destilliertem Wasser. Rühre das Gemisch 15 min.
- Bereiten NaOH Lösung Lösen von 1 g NaOH in 100 ml Wasser. Man rührt 10 min.
- Herstellung von 10 mM Phosphatpuffer , 600 mg NaH 2 PO 4 in 1 l Wasser auflöst. In sorgfältig 0,34 ml Phosphorsäure und Rühren für 30 min. Stellen Sie den pH-Wert auf 2,9 (Akzeptanzbereich 2,7-3,0).
- Den pH - Wert auf 7.2 Herstellung von 10 mM Phosphatpuffer , 269 mg NaH 2 PO 4 und 1,09 g Na 2 HPO 4 zu destilliertem Wasser gelöst wird ein Volumen von 1 l zu machen.
2. Synthese von Oleic Acid beschichtete Nanopartikel (OA-IONP)
- In einem Mikrowellen angepasst Kolben mit 0,5 g Fe (acac) 3, 1,4 ml Oleic Säure, 0,6 ml Oleylamin und 1,19 g 1,2-hexadodecanediol. 10 ml Phenylether vorsichtig durch die Kolbenwand eine Messpipette.
- Führen Sie den Kolben in den Mikrowellenreaktor und starten Sie das Mikrowellen Protokoll.
HINWEIS: Mikrowellen-Software ermöglicht es, die Größe für verschiedene Parameter wie Temperatur, Druck, Rühren Geschwindigkeit, Leistung und Reaktionszeit zu wählen. Darüber hinaus hat er die Möglichkeit, drei verschiedene Stufen in dem gleichen Protokoll zu laden abstimmbaren Synthese ermöglicht. Sobald die geladene synthetische Protokoll beginnt, erwärmt Mikrowellen die Probe so schnell wie möglich (Ramping-Prozess) und hält sie während der gewählten Reaktionszeit (Laufverfahren). Wahl der Leistung bestimmt die Zeit von Ramping. - Legen Sie eine dynamische Studie in der Mikrowelle. Das Protokoll enthält drei Phasen:
- Stufe 1: Stellen Sie die Temperatur auf 60 ° C, Zeit 2 min, Druck 250 psi und 150 W Leistung. Stir Geschwindigkeit hat in hoher Position und maximale Leistung in auf zu sein.
- Hirsche 2: die Temperatur auf 200 ° C, Zeit 20 min, Druck 250 psi und 300 W Leistung eingestellt. Stir Geschwindigkeit hat in hoher Position und maximale Leistung in auf zu sein.
- Stufe 3: Stellen Sie die Temperatur auf 250 ° C, Zeit 10 min, Druck 250 psi und 300 W Leistung. Stir Geschwindigkeit hat in hoher Position und maximale Leistung in auf zu sein.
- Nach der Protokoll Schlichten, kann der Kolben bei Raumtemperatur abkühlen lassen.
HINWEIS: Kühlphase mit oder ohne Gasstrom durchgeführt werden kann. Beide Fälle liefern dieselben Ergebnisse. Aggregate werden in der Rührstab und in der Wand des Kolbens, waschen Sie es mit EtOH und auf den Erlenmeyer setzen. - Übertragen Sie das Reaktionsgemisch in einen Erlenmeyer mit einer Glaspipette und 10 ml EtOH 98%. Setzen Sie ein Nd-Nb-B-Magneten unter dem Kolben, warten Sie 5 Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Glaspipette.
- In 10 ml EtOH, beschallen die Probe bei RT für 2 Minuten und 40 kHz, legen Sie die Probe auf den Magneten und die Beseitigung der Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt bei least dreimal.
- Disperse Öl Nanopartikel in 30 ml CHCl 3 und beschallen bei 40 kHz für 5 min bei RT. Schauen Sie sich die hydrodynamischen Größe in der Zetasizer gemäß den Anweisungen des Herstellers. Setzen 0,5 ml OA-IONP in der Glasküvette und fügen Sie 0,5 ml CHCl 3. Akzeptanzbereich 7-10 nm, ausgedrückt als Z-Durchschnittsgröße in der Intensität.
HINWEIS: OA-IONP können in Hexan gut dispergiert werden.
3. Synthese von Azelainsäure Nanopartikel (Azelainsäure-IONP)
- Man löst 44,3 mg KMnO 4 und 150,4 mg BTACl in einem Gemisch aus H 2 O: CHCl 3 (3: 2 ml). Fügen Sie die resultierende Lösung in ein 5 ml Aliquot von OA-IONP im Mikrowellenkolben angepasst.
- Starten Sie das Mikrowellen Protokoll für Azelainsäure-IONP. Eingestellte Temperatur bei 105 ° C, Zeit 9 min, der Druck 250 psi und Leistung bei 300 W. Setzen 10 ml Phosphatpuffer pH = 2,9, in den Kolben und wiederholen Sie die Mikrowellen Protokoll. Nach dem Schritt Abkühlen erholen, die Nanopartikelunter Verwendung eines Magneten und den Überstand entfernen.
- 5 ml 10% NaHSO 3 in einen Erlenmeyerkolben, beschallen bei 40 kHz für 2 min bei 25 ° C, zu sammeln , die Partikel unter Verwendung eines Magneten und den Überstand entfernen. (Der Schritt wird 2-mal wiederholt.) Waschen der Nanopartikel noch dreimal mit 1% NaOH und schließlich wieder zu dispergieren sie in 5 ml Phosphatpuffer pH = 7,2.
- Schauen Sie sich die hydrodynamische Größe und Zeta-Potential. Setzen 0,7 ml Azelaic-IONP in die Einweg-Kapillar-Zelle gefaltet und legen Sie es auf den Zetasizer.
HINWEIS: Akzeptanzbereich für Größe 25-35 nm als Z-Durchschnittsgröße in der Intensität ausgedrückt. Akzeptanzbereich für Z-Potential -45 ± 5 mV. Größere Nanopartikel (~ 70 nm) mit Phosphatpuffer pH> 7 statt pH = 2,9 (ref Chem Eur J 2008) erhalten werden.
4. Synthese von Neridronat Nanopartikel (Neridronat-IONP)
- Hinzufügen 12 mg EDC und 15 mg Sulfo-NHS in einer Zentrifuge mit 2 ml Aliquot von Azelainsäure-IONP. Stellendas Gemisch in einem Vortex bei RT für 35 min.
- Setzen Sie ein Magnet unter der Zentrifuge, die Nanopartikel zu destabilisieren, den Überstand aspirieren und waschen Sie die Partikel mit 1,5 ml HEPES 1 mM pH = 7 Puffer. (Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.) Danach werden 5 mg Neridronat und schütteln Sie die Mischung in einem Wirbel für 2 Std.
- Separate Nanopartikel mit einem Magneten und Waschen (3 x 2 ml) mit 1 mM HEPES pH = 7 Puffer. Neridronat-IONP in 2 ml 1 mM HEPES-Puffer pH = 7 schließlich dispergieren.
- Schauen Sie sich die hydrodynamische Größe und Zeta-Potential. Setzen 0,7 ml Neridronat-IONP in die Einweg-gefalteten Kapillarzelle und legen Sie es auf die Zetasizer (Geräte-Setup sehen).
HINWEIS: Akzeptanzbereich für Größe 40-45 nm als Z-Durchschnittsgröße in der Intensität ausgedrückt. Akzeptanzbereich für Z-Potential von -20 ± 5 mV.
5. In - vivo - Nachweis von Atherom Plaque in ApoE - / - Mäuse von MRI
- Vorbereitung für die MRI-Akquisition
HINWEIS: Mehrere Extra-Systeme für Tierversuche erforderlich sind. Es wird also erforderlich:- Verwenden Sie geeignete Ausrüstung, um die Tiere zu betäuben.
- Besorgen Sie sich einen geschlossenen Kreislauf zirkulierenden Warmwassersystem mit einem externen Warmluft die Temperatur des Tieres stabil zu halten.
HINWEIS: In diesem Fall wird die MRI kompatiblen Überwachung und Gating-System registriert die Temperatur des Tieres innerhalb des MRI-Magneten. - Überwachen Sie die Außentemperatur in der Nähe des Tieres, der Körper (Rektalthermometers) Temperatur des Tieres, der Atmungssensor unter dem Körper des Tieres in der Nähe des Thorax befindet sich eine integrierte Schnittstelle in der MRI-Konsole.
- MRI-Experiment
- Anästhesieren, die Tiere mit Isofluran verdampft (2% für die Induktion während zwei bis drei Minuten und 1-1,5% für die Wartung während des Experiments MRI) mit einem 100% Sauerstoffleitung.
- Legen Sie das Tier in der Mitte des Magneten mit Hilfe eines Profilerfassung.
- Nach dem Schritt 5.2.2, tune die HF-Spule auf 300 MHz (7 T) Resonanzfrequenz und entsprechen der charakteristischen Impedanz der Spule 50 Ohm für einen optimalen Signalempfang.
HINWEIS: Achten Sie auf die externe Verkabelung und Anbindung an das Messsystem über den Adapter / Splitter individuell auf jeden Teil der Sendespule gehen (in unserem Fall war es eine Quadratur-Spule). - Nach der Einstellung der und um die Spulen passende, stecken die Spulen in den Scanner.
- Für HF-Impuls Kalibrierung (Form und Länge) und Mittenfrequenzjustierschaltung führen sowohl Impuls Kalibrierung und das Zentrum der Frequenz manuell. Führen Sie die 90 ° Impuls Kalibrierung, grob Shim (siehe unten), Mittenfrequenz und Empfänger Verstärkungseinstellungen manuell.
- Führen Sie genaue Position eines Gradienten-Echo mit (FLASH oder GRE) Localizer-Scan (3 Ebene Scout Erfassung: axial, koronal und sagittal, auch genannt TriPilot.
- Führen Sie den Magneten Shim die Magnetfeldhomogenität im cen zu optimierenter des Magneten. Führen Sie diesen Schritt manuell (siehe 5.2.3) unter Verwendung eines ein oder Einzelimpuls FID-Sequenz und stellen Sie die erste und die zweite Aufträge Unterlegscheiben oder jede automatische Shim-Sequenz im System
HINWEIS: Ein gut unterfüttert Magnetfeld wird durch die T2 * (als größer, desto besser) oder schmalen FWHM der Spektren leicht erkannt und gemessen werden.
- MRI - Datenerfassung der Plaque 5
- Inject 100 ul (1 mg [Fe] ml -1) von Neridronat Nanopartikel intravenös in die Schwanzvene und Bilder aufzunehmen , 1 Stunde nach der Injektion. Legen Sie die Parameter für die MRI-Akquisition von atherosklerotischen Plaques an der Bauchaorta suchen (renale Bifurkation).
- Setzen Sie Multi-Slice, 10 bis 20 Scheiben in Verschachtelungsmodus Artefakte zu minimieren.
- Erwerben Sie hochauflösende Fast-Spin-Echo-T1-gewichteten MRT in koronalen oder axialen Ansicht mit den folgenden Parametern: FOV 60 x 30 mm (koronale), 30 x 30 mm (axial), Dicke 0,8 mm in Scheiben schneiden (mit dem kleinen Gradientenspule configuration dies kann auf 0,6 mm reduziert werden), 400 ms TR, 8 msec TE, 256 x 256 Erfassung und Rekonstruktion Matrixdaten, 6 (große Steigung) bis 8 (kleine Steigung) Signalmittelwerte für 5-8 min durchschnittliche Akquisitionszeiten.
HINWEIS: TE ist besonders kritisch, und das Vorhandensein von Blut Signal und Strömungs- und chemische Verschiebung Artefakte, die die Anwendungen begrenzen. In diesen Fällen fließen unempfindlich schnelle Spin-Echo-T2-IR-Artefakte zu reduzieren helfen können und die Akquisition von komplementären Daten in genau der gleichen Stelle helfen können, um die Plaque zu charakterisieren. Zusätzlich kann eine Vorsättigung Puls das Fett umgebenden Gewebes der Arterienwand zur besseren Abgrenzung von der äußeren Begrenzung der Wand und der chemischen Verschiebung Artefaktreduktion zu reduzieren verwendet werden. - Übertragen Sie die Bilder in einem Standardformat wie Dicom und Blick in geeigneten Software (zB Osirix Imaging Software oder AMID: Medical Imaging Data Examiner) unter Verwendung von 5. Quantifizierung der Kontrastwirkung manuell ves begrenzensel Bereich, Wandstärke, Lumenfläche und Plaque - Last 5.
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Representative Results
In diesem Protokoll wird die Synthese von drei verschiedenen IONP beschrieben. Ausgehend von hydrophoben OA-IONP wässrige stabile Nanopartikel werden mit Hilfe von Mikrowellengesteuerten Synthese erhalten. Alle Nanopartikel präsentiert ultrakleine hydrodynamischen Größe (AVW <50 nm) in einer sehr engen Größenverteilung (Abbildung 1c). Die Verwendung von Mikrowellentechnologie macht ultra-kleine Nanopartikel im Hinblick auf die Kerngrößen. Da Mikrowelle eine schnelle Erwärmung erzeugen, um die Rate der Keim Anstieg im Vergleich zu anderen Methoden geben kleinere Größen im Kern der Nanopartikel. Jedoch immer noch die Teilchen ausgezeichnete Kristallinität präsentieren , wie in den TEM - Bildern dargestellt ist , wo die Gitterfransen auf die Fe 3 O 4 Kerne deutlich (Abbildung 1a, b) zu sehen ist. Weitere wichtige Aspekt des Verfahrens ist die Reproduzierbarkeit. Nach vier Wiederholungen der Synthese von Azelainsäure-IONP, die gleichen Ergebnissein der hydrodynamischen Größe und Verteilung erhalten (Figur 1d).
Nach Funktionalisierung wurden die Ca 2+ Bindungseigenschaften aufgrund von Bisphosphonaten in Neridronat Nanoteilchen kontrolliert 2+ diese Nanopartikel mit unterschiedlichen Mengen an Ca inkubiert. Es war , dass T 2 Relaxationszeit Inkrementen linear mit der Menge an Ca 2+ und die Zeit der Inkubation gezeigt aufgrund der Bildung von Clustern von mit Nanopartikeln während Nanopartikel ohne Ca 2+ stabil (Abbildung 1 e) verblieb, unsere ursprüngliche Hypothese entspricht.
In vivo MRI - Experimente wurden in 48 Wochen alten ApoE ausgeführt - / - Mäusen. Carotis und Bauchaorta basalen Bilder wurden zuerst genommen. Lesion aufgrund der Bildung der atherosklerotischen Plaque deutlich zu sehen ist. Dann wurden 100 & mgr; l (1 mg [Fe] ml -1 (Abbildung 2) dargestellt ist, 1 Stunde nach der Injektion das Signal der Plaque zu den basalen Bilder hypointens im Vergleich bilden. Auswahl von zwei ROIs (region of interest) erlaubt die Quantifizierung des Intensitätssignals im Bereich Läsion für den Vergleich zwischen den basalen und 1 Stunde nach der Injektion Bilder. Die Plakette zu Muskel - Verhältnis unterscheidet sich deutlich zwischen ihnen (p <0,05, Abbildung 2b).
Zusätzlich Signal in der Leber wurde in Mäusen nach Injektion von 100 & mgr; l Neridronat Nanopartikel überwacht zu beurteilen, ob die Verringerung der Intensität Zirkulationszeit im Blut zurückzuführen ist und nicht durch selektive Akkumulation. Wie die Grafik zeigt (Abbildung 2c), wurden Nanopartikel vollständig aus dem Verkehr geräumt nach 20 Minuten die selektive Anreicherung der Bestätigungvon Neridronat Nanopartikel in Richtung atherosklerotischen Plaque. Endgültige ex vivo Bildgebung und Histologie durchgeführt. Die Mäuse wurden getötet und die Aorten entnommen. Imaging von Aorten mit und ohne Nanopartikel zeigten Unterschiede im Signal in Übereinstimmung mit in vivo - Experimenten (Abbildung 2d).
Schema 1:. Syntheseschritte gefolgt in das Protokoll und die grundlegende Charakterisierung an jedem Punkt von DLS Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 1: Characterization von Nanopartikeln (a) TEM - Aufnahmen, bei zwei Vergrößerungen für OA-IONP. (B) TEM - Aufnahmen, bei zwei Vergrößerungen für Neridronat-IONP; (C) hydrodynamischen Größe für Nanopartikel OA-IONP, Azelainsäure-IONP und Neridronat-IONP; (D) hydrodynamischen Größe für Azelainsäure-IONP in vier verschiedenen Synthese und (e) Entwicklung der T 2 Relaxationszeit in einer Lösung von Neridronat-IONP als Funktion der Zeit und der Calciumkonzentration (ref TEM protocol: NIST - NCL Joint Assay - Protokoll PCC-X, die Größe von Nanopartikeln Transmissions - Elektronenmikroskopie) Mess. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: MRT - Datender Plaque (a) In - vivo - MRT von ApoE - / - Maus vor (oben) und eine Stunde nach der iv Injektion von Neridronat-IONP (unten). (B) Plaque Muskel relative Signalintensität vor (basal) und eine Stunde nach der iv Injektion von Neridronat-IONP; (C) Leber Muskel relative Signalintensität zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Injektion von Neridronat-IONP und (d) ex vivo Bilder der Aorta für zwei Mäuse mit und ohne die Injektion von Nanopartikeln 5. Bitte klicken Sie hier um ein , um zu vergrößern Version dieser Figur.
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Discussion
Eisenoxid-Nanopartikel (IONP) sind eine der wichtigsten Nanomaterialien und es hat sich für verschiedene Anwendungen vor langer Zeit verwendet worden. Die Verwendung dieser Materialien als Kontrastmittel für die Magnetresonanztomographie (MRT) ist ein gut eingeführtes Gebiet. Allerdings nehmen die Synthesewege oft mehrere Zeit und die Einstellung ist kompliziert. Aufgrund dramatisch Reaktionszeiten zu reduzieren und verbessert die Reproduzierbarkeit scheint die Verwendung von Mikrowellengesteuerten Synthese eine gute Alternative für die Herstellung von qualitativ hochwertigen Nanopartikel sein. In dem oben beschriebenen Protokoll, Mikrowellentechnik wurde für die Synthese von zwei unterschiedlichen Nanoteilchen verwendet. Mikrowellen ermöglichen eine Feinabstimmung der wichtigsten Parameter, die die endgültigen Eigenschaften der Partikel beeinflussen. Es ist wichtig, daß die physikalischen Eigenschaften der Nanopartikel zu beachten, ändert sich, wenn eine der beschriebenen Bedingungen verändert werden. Da einige Chemikalien in dem Syntheseverfahren verwendet werden, die purification Schritte sind entscheidend hochwertige Nanopartikel zu erhalten.
In OA-IONP Überschuss an oberflächenaktiven Mittel werden verwendet, um genügend Stabilität in den Nanopartikeln zu bekommen. Nach der Synthese sind drei Reinigungsschritte zwingend, es zu entfernen. Für die Synthese von Azelainsäure-IONP zwei unterschiedliche Mikrowellenstufen erforderlich sind. In der zweiten Stufe kann die endgültige Größe der Teilchen aus ultrakleinen IONP (D h <50 nm) unter Verwendung von pH = 2,9 bis größer hydrodynamischen Größe (D h> 50 nm) unter Verwendung von physiologischen pH eingestellt werden. Bei der Reinigung der Azelainsäure-IONP, ist die Menge an NaOH verwendet wesentlich. Genügend Menge an NaOH hinzugefügt werden, um die Nanopartikel zu stabilisieren, jedoch zu viele NaOH das Tensid aus der Nanoteilchen Rendering instabilen Material desorbieren kann.
IONP besitzen kurze Zirkulationszeit in Blut typischerweise die eines der Hauptnachteile ist. Für die Verwendung als Kontrastmittel müssen Nanopartikel CIRculate Blut genug Zeit in den gewünschten Bereich zu erreichen. Zur Erhöhung der Zirkulationszeit im Blut verschiedene Ansätze klassisch durchgeführt. Diese Strategien basieren hauptsächlich auf die Anbringung eines pegylierten Rest, soweit die Zirkulationszeit des Nanopartikels. Jedoch im Fall von Neridronat-IONP wird die Anhäufung sehr schnell hergestellt werden. Die Verwendung eines Aminobisphosphonat als Biomolekül auf den Nanopartikeln Atherom Plaque Ziel ist ein neues Konzept, das auf den Calcium Fähigkeiten dieser Arten von Verbindungen. Seine Akkumulation im Läsionsbereich in weniger als einer Stunde zeigt die hohe Affinität von Neridronat-IONP zu Calcium in der Atherom Plaque enthielt.
Zur Visualisierung von Atherom Plaque, sind viele fortschrittliche Bildgebungstechniken in der Regel eingesetzt. Unter ihnen ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und MRI sind die standardisierten Techniken. PET bietet die besten Ergebnisse in Bezug auf die funktionale Information aufgrund der hohen Empfindlichkeit undMRT die besten Ergebnisse in anatomischen Informationen aufgrund der hohen Auflösung. Obwohl PET die ideale Wahl sein könnte, eine synthetische Sonde, die Auflösung dieser Technik bei Kleintieren (~ 1 mm) schränkt seine Verwendung zu folgen, um kleinere Verkalkungen in atherosklerotischen Läsionen sichtbar zu machen. Die MRT ist eine ideale Alternative eine bessere Auflösung (~ 0,1 & mgr; m). Die geringere Empfindlichkeit dieser Technik vermeidet nicht die Visualisierung des Kontrastmittels in dem interessiere Region und die bessere Auflösung ermöglicht kleine Verkalkungen zu identifizieren. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse, dass die Kombination der einzigartigen schnellen Anhäufung von Neridronat-IONP mit der hohen Auflösung von MRI ist ein ideales Szenario für den Nachweis von Atherom Plaque bei Kleintieren.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microwave Explorer/Discover Hybrid-12 | CEM Corporation, USA | Any microwave for chemical synthesis can be used | |
| Disposable PD-10 desalting columns | GE Healthcare life sciences | 17-0851-01 | Any size exclusion column will work |
| Amicon®Ultra-0.5 ml | Merck Millipore Ltd | ||
| Calibrated pH meter | SI analytics | 285105127 | |
| Neodymium magnet | Aiman Gz | ND010B | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340000 | |
| ZetaSizer Nano ZS | Malvern Instruments | ||
| Standard (macro) cell Optical glass | Labbox | 11718 | |
| Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070 | Malvern | ||
| Bruker Minispec mq60 | Bruker |
References
- Patel, D. N., Bailey, S. R. Nanotechnology in cardiovascular medicine. Catheter. Cardiovasc. Interv. Off. J. Soc. Card. Angiogr. Interv. 69, 643-654 (2007).
- Zhao, X., Zhao, H., Chen, Z., Lan, M. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging contrast agent. J. Nanosci. Nanotechnol. 14, 210-220 (2014).
- Lee, D. E., et al. Multifunctional nanoparticles for multimodal imaging and theragnosis. Chem. Soc. Rev. 41, 2656 (2012).
- Osborne, E. A., et al. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology. 23, (2012).
- Pellico, J., et al. Microwave-driven synthesis of bisphosphonate nanoparticles allows in vivo visualisation of atherosclerotic plaque. RSC Adv. 5, 1661-1665 (2015).
- Lin, M. M., Kim, D. K., El Haj, A. J., Dobson, J. Development of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONS) for translation to clinical applications. IEEE Trans. Nanobioscience. 7, 298-305 (2008).
- Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
- Liu, F., Laurent, S., Fattahi, H., Vander Elst, L., Muller, R. N. Superparamagnetic nanosystems based on iron oxide nanoparticles for biomedical imaging. Nanomed. 6, 519-528 (2011).
- Carenza, E., et al. Rapid synthesis of water-dispersible superparamagnetic iron oxide nanoparticles by a microwave-assisted route for safe labeling of endothelial progenitor cells. Acta Biomater. 10, 3775-3785 (2014).
- Osborne, E. A., et al. Rapid microwave-assisted synthesis of dextran-coated iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. Nanotechnology. 23, 215602 (2012).
- Gatti, D., Rossini, M., Viapiana, O., Idolazzi, L., Adami, S. Clinical development of neridronate: potential for new applications. Ther. Clin. Risk Manag. 9, 139-147 (2013).
- Drake, M. T., Clarke, B. L., Khosla, S. Bisphosphonates: mechanism of action and role in clinical practice. Mayo Clin Proc. 83, 1032-1045 (2008).
- Devogelaer, J. P. Treatment of bone diseases with bisphosphonates, excluding osteoporosis. Curr. Opin. Rheumatol. 12, 331-335 (2000).
- Pascu, O., et al. Surface Reactivity of Iron Oxide Nanoparticles by Microwave-Assisted Synthesis; Comparison with the Thermal Decomposition Route. J. Phys. Chem. C. 116, 15108-15116 (2012).
- Sun, S., Zeng, H. Size-Controlled Synthesis of Magnetite Nanoparticles. J. Am. Chem. Soc. 124, 8204-8205 (2002).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of highly crystalline and monodisperse maghemite nanocrystallites without a size-selection process. J. Am. Chem. Soc. 123, 12798-12801 (2001).
- Herranz, F., Morales, M. P., Roca, A. G., Vilar, R., Ruiz-Cabello, J. A new method for the aqueous functionalization of superparamagnetic Fe 2 O 3 nanoparticles. Contrast Media Mol. Imaging. 3, 215-222 (2008).
- Herranz, F., Morales, M. P., Roca, A. G., Desco, M., Ruiz-Cabello, J. A new method for the rapid synthesis of water stable superparamagnetic nanoparticles. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 14, 9126-9130 (2008).
- Herranz, F., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles conjugated to a grass pollen allergen and an optical probe. Contrast Media Mol. Imaging. 7, 435-439 (2012).
