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Bioengineering

Atherosclerosis की तेजी से जांच के लिए आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के माइक्रोवेव संचालित संश्लेषण

Published: March 22, 2016 doi: 10.3791/53472
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1
1Advanced Imaging Unit, Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III and CIBER de Enfermedades Respiratorias, 2Universidad Complutense de Madrid

Summary

माइक्रोवेव प्रौद्योगिकी atherosclerosis पट्टिका लक्षण वर्णन के लिए लोहे के आक्साइड नैनोकणों के बहुत तेजी से संश्लेषण सक्षम बनाता है। nanoparticle के बाहरी हिस्से में एक aminobisphosphonate के उपयोग atherosclerotic क्षेत्र में एक तेजी से संचय प्रदान करता है।

Abstract

एक तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माइक्रोवेव संचालित प्रोटोकॉल neridronate-क्रियाशील नैनोकणों के संश्लेषण के लिए विकसित किया गया है। हाइड्रोफोबिक नैनोकणों के संश्लेषण से शुरू, हमारे विधि माइक्रोवेव संचालित संश्लेषण के लिए थर्मल अपघटन विधि से एक अनुकूलन पर आधारित है। नई पद्धति पारंपरिक प्रक्रियाओं के साथ तुलना में प्रतिक्रिया समय में कमी पैदा करता है। इसके अलावा, माइक्रोवेव प्रौद्योगिकी के उपयोग प्रतिक्रियाओं के reproducibility बढ़ जाती है, कुछ नैदानिक ​​अनुप्रयोगों की दृष्टि से महत्वपूर्ण है। इस लोहे के आक्साइड nanoparticle की नवीनता Neridronate का लगाव है। इस अणु के उपयोग nanoparticle कि सीए 2 प्रदान करता है मेदार्बुद पट्टिका में vivo में बाध्यकारी विट्रो और चयनात्मक संचय में संपत्ति के बाहर की दिशा में एक बिसफ़ॉस्फ़ोनेट आधा भाग होता है। प्रोटोकॉल संगठन से प्रारंभिक संश्लेषण के बाद संश्लेषण और के बारे में 3 घंटे में पट्टिका का पता लगाने के लिए अनुमति देता हैग व्यापारियों। कम से कम 1 घंटे में atherosclerotic क्षेत्र में उनके संचय नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त एक विपरीत एजेंट प्रदान करता है।

Introduction

Atherosclerosis धमनियों की दीवार एक अविनियमित लिपिड चयापचय और एक दोषपूर्ण भड़काऊ प्रतिक्रिया से उत्पन्न एक multifactorial जीर्ण सूजन की बीमारी है। व्यापकता और इस और संबंधित हृदय रोगों की आर्थिक और सामाजिक लागत के कारण वहाँ नए उपकरणों, जिनमें से नैनो सबसे होनहार में से एक है के साथ विकृति के समाधान में रुचि बढ़ रही है। लेकिन वहाँ 1-3 तेजी से बहुत कुछ उदाहरण हैं उत्पादन और जांच के लक्षण वर्णन जो क्लिनिक में अनुवाद के लिए बुनियादी है 4 इस प्रोटोकॉल हम एक बिसफ़ॉस्फ़ोनेट के साथ और ApoE में atherosclerosis के विवो का पता लगाने में आगे functionalization के लिए लोहे के आक्साइड nanoparticle की एक माइक्रोवेव संश्लेषण का उपयोग करें -। / -। 1 घंटे में चूहों 5 आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONP) एक प्रसिद्ध nanomaterial और चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए एक विपरीत एजेंट के रूप में इसके उपयोग के विभिन्न रोग का पता लगाने के लिए स्थापित किया गया हैंपिछले वर्षों में एस। 6-8

माइक्रोवेव संश्लेषण (मेगावाट बिजली), उच्च reproducibility और बढ़ाया पैदावार के साथ बेहद कम समय में नैनोकणों synthesizing अनुमति देता है। 9,10 हमारे प्रोटोकॉल में हम पट्टिका तीन चरणों में हमले करने की क्षमता के साथ IONP प्राप्त करते हैं। अंतिम एक एक aminobisphosphonate, Neridronate है, जो अपनी कैल्शियम बाध्यकारी गुणों के कारण हमारी रणनीति में महत्वपूर्ण है के लगाव है। उनके प्राकृतिक एनालॉग पाइरोफॉस्फेट (पीपीआई) के कारण, Neridronate osteogenesis अपूर्णता (पुराना) और हड्डी के Paget रोग (पीडीबी) अस्थि खनिज के प्रति अपनी उच्च आत्मीयता के लिए के उपचार में इस्तेमाल किया गया है। 11-13

प्रोटोकॉल के तीन चरणों योजना 1. कदम एक और दो माइक्रोवेव प्रौद्योगिकी का उपयोग किया जाता है में संक्षेप हैं। पहला कदम प्रकाशित तरीकों में से एक संशोधन द्वारा ओलिक एसिड लेपित लोहे के आक्साइड नैनोकणों (OA-IONP) प्रदान करते हैं। 14 प्रोटोकॉल tradit के माइक्रोवेव संश्लेषण के लिए एक अनुकूलन हैional थर्मल अपघटन संश्लेषण। 15,16 युक्त फे (acac) एक मिश्रण 3, ओलिक एसिड, oleylamine और 1,2-dodecanediol बेंजाइल अल्कोहल में भंग कर दिया और दो ​​हीटिंग प्रक्रियाओं पर अधीन है। शुद्धीकरण EtOH के साथ धोने और सतह पर तैरनेवाला में surfactants की अतिरिक्त समाप्त करने के लिए एक एन डी Fe-B चुंबक के साथ कण इकट्ठा किया जाता है। फिर, OA-IONP CHCl 3 में स्थिर हो जाता है। उम्मीद के रूप में बहुत तेजी से हीटिंग की वजह से प्रत्याशित नतीजे बताते हैं कि नैनोकणों माइक्रोवेव द्वारा संश्लेषित कोर (3.7 ± 0.8 एनएम) और hydrodynamic आकार (7.5 एनएम) पारंपरिक थर्मल अपघटन के साथ तुलना में करने के मामले में छोटे होते हैं; हालांकि, नैनोकणों अभी भी एक उत्कृष्ट स्फटिकता प्रस्तुत करते हैं।

दूसरा कदम, डबल बांड, ओलिक एसिड में मौजूद एक सीधा रासायनिक संशोधन में होते हैं KMnO 4, विकसित में हमारे समूह मेगावाट की स्थिति के लिए संशोधित किया गया था मूल कार्यप्रणाली की तरह एक मजबूत ऑक्सीडेंट का उपयोग कर।और डबल बंधन - 17 A पहले चरण MnO 4 के बीच परिसरों रूपों। फिर, अम्लीय परिस्थितियों में एक दूसरे चरण, ओलिक एसिड अणु Azelaic एसिड IONP देने की दरार पैदा करते हैं। 9 मिनट प्रत्येक के इन दो चरणों के बाद, नमूना NaHSO साथ शुद्ध होता है, पहली धोने 3 1% MnO 4 से अधिक कम करने के लिए - MnO 2 के लिए और फिर NaOH के साथ 1% एसिड बेअसर करने के लिए।

शुद्धि कदम के बाद, Azelaic-IONP 10 मिमी फॉस्फेट बफर पीएच = 7.2 में स्थिर हो जाता है। यह बफर इसी तरह क्या मूल, थर्मल प्रतिक्रिया में हुआ कणों की कोलाइडयन स्थिरता के लिए सबसे अच्छा माहौल है। 18 डबल बांड OA-IONP में निहित प्रत्यक्ष ऑक्सीकरण के लिए माइक्रोवेव का उपयोग लाभ का एक बहुत अच्छा उदाहरण है नैनोकणों के संश्लेषण में इस तकनीक का उपयोग करने का। शास्त्रीय विधि प्रतिक्रिया 24 घंटा लेता है के साथ, माइक्रोवेव के उपयोग में कमी reacti18 मिनट के लिए समय पर। इसके अलावा, माइक्रोवेव संचालित प्रोटोकॉल एक उत्कृष्ट reproducibility 4 repetitions के बाद साथ hydrodynamic आकार के 30 ± 5 एनएम नैनोकणों देने से पता चलता। hydrodynamic आकार में परिवर्तन के अलावा, जीटा संभावित एक अच्छा पैरामीटर जल्दी प्रतिक्रिया की सफल जांच करने के लिए है। Azelaic-IONP में नए कार्बोक्जिलिक समूहों की उपस्थिति के कारण, जीटा संभावित लिए मूल्य चारों ओर -44 एम वी, बहुत थर्मल दृष्टिकोण से प्राप्त मूल्य के समान है।

Azelaic-IONP को neridronate की कुर्की के लिए, पारंपरिक ईडीसी / sulfo एनएचएस विकार प्रयोग किया जाता है। 19 यह सिंथेटिक दृष्टिकोण अच्छी तरह से स्थापित है के साथ एक सक्रिय कार्बोक्सिलेट रोजगार के बाद से sulfo एनएचएस प्रतिक्रिया के दौरान कोलाइडयन स्थिरता सुनिश्चित करता है। बाद फॉस्फेट बफर के उन्मूलन neridronate के साथ प्रतिक्रिया 1 मिमी HEPES बफर में किया जाता है (पीएच ~ 7)। प्रतिक्रिया एक संकीर्ण आकार distr में 40 ± 4 एनएम के एक hydrodynamic आकार के साथ Neridronate-IONP rendersibution और जीटा-क्षमता का -24.1 एम वी।

प्रक्रिया के भीतर टी 2 भारित विपरीत एजेंट एमआरआई atherosclerotic पट्टिका के vivo दृश्य के लिए IONP की तेजी संश्लेषण के लिए वर्णन किया गया है, हालांकि विधि की व्यवहार्यता मुक्त amines के साथ किसी भी पेप्टाइड / एंटीबॉडी की कुर्की की अनुमति देता है, एक ही शर्तों का उपयोग विभिन्न प्रयोजनों के लिए, खेत।

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Protocol

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. 1 मिमी HEPES बफर आसुत जल की 100 मिलीलीटर में HEPES की 23.8 मिलीग्राम भंग तैयार करें। पीएच 7 करने के लिए समायोजित करें।
  2. तैयार 10% NaHSO 3 आसुत जल की 100 मिलीलीटर में NaHSO 3 की 10 ग्राम भंग। 15 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ।
  3. NaOH समाधान पानी की 100 मिलीलीटर में NaOH के 1 ग्राम भंग तैयार करें। 10 मिनट के लिए हलचल।
  4. 10 मिमी फॉस्फेट बफर पानी का 1 एल में नः 2 4 पीओ के 600 मिलीग्राम भंग तैयार करें। फॉस्फोरिक एसिड के ध्यान से 0.34 मिलीलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए हलचल। 2.9 पीएच (स्वीकृति रेंज 2.7-3.0) समायोजित करें।
  5. 10 मिमी फॉस्फेट बफर नः 2 4 पीओ के 269 मिलीग्राम और आसुत जल को ना 2 4 HPO की 1.09 ग्राम भंग 1 एल की मात्रा 7.2 पीएच को समायोजित करने के लिए तैयार करें।

2. ओलिक एसिड के संश्लेषण लेपित नैनोकणों (OA-IONP)

  1. एक माइक्रोवेव अनुकूलित फ्लास्क में फे (acac) 3 की 0.5 ग्राम, जोड़ने olei के 1.4 मिलीलीटरग एसिड, oleylamine की 0.6 मिलीग्राम और 1,2-hexadodecanediol के 1.19 छ। एक स्नातक की उपाधि प्राप्त पिपेट का उपयोग सावधानी से कुप्पी दीवार के माध्यम से फिनाइल ईथर के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. माइक्रोवेव रिएक्टर में कुप्पी का परिचय और माइक्रोवेव प्रोटोकॉल शुरू करते हैं।
    नोट: माइक्रोवेव सॉफ्टवेयर तापमान, दबाव, सरगर्मी गति, शक्ति और प्रतिक्रिया समय की तरह अलग अलग मापदंडों के लिए परिमाण को चुनने के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह एक ही प्रोटोकॉल ट्यून करने योग्य संश्लेषण अनुमति देने में तीन अलग-अलग चरणों में लोड करने के लिए संभावना है। एक बार भरा हुआ सिंथेटिक प्रोटोकॉल शुरू होता है, माइक्रोवेव संभव (ramping प्रक्रिया) के रूप में उपवास के रूप में नमूना तपता और चुने प्रतिक्रिया समय (दौड़) की प्रक्रिया के दौरान यह रखता है। बिजली के निर्वाचन ramping का समय निर्धारित करता है।
  3. माइक्रोवेव में एक गतिशील अध्ययन के भार। प्रोटोकॉल तीन चरणों में शामिल हैं:
    1. चरण 1: 60 डिग्री सेल्सियस, समय 2 मिनट, दबाव 250 साई और 150 बिजली के डब्ल्यू करने के लिए तापमान निर्धारित किया है। हलचल गति उच्च स्थिति और पर में अधिकतम शक्ति में हो गया है।
    2. हिरणई 2: 200 डिग्री सेल्सियस, समय 20 मिनट, दबाव 250 साई और 300 बिजली के डब्ल्यू करने के लिए तापमान निर्धारित किया है। हलचल गति उच्च स्थिति और पर में अधिकतम शक्ति में हो गया है।
    3. चरण 3: 250 डिग्री सेल्सियस, समय 10 मिनट, दबाव 250 साई और 300 बिजली के डब्ल्यू करने के लिए तापमान निर्धारित किया है। हलचल गति उच्च स्थिति और पर में अधिकतम शक्ति में हो गया है।
  4. प्रोटोकॉल खत्म करने के बाद, फ्लास्क कमरे के तापमान पर ठंडा करने के लिए अनुमति देते हैं।
    ध्यान दें: नीचे ठंडा करने की प्रक्रिया के साथ या गैस धारा के बिना किया जा सकता है। दोनों ही मामलों में एक ही परिणाम प्रदान करते हैं। समुच्चय हलचल पट्टी में दिखाई देते हैं और कुप्पी की दीवार में, EtOH के साथ इसे धोने और Erlenmeyer पर डाल दिया।
  5. एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक Erlenmeyer की प्रतिक्रिया मिश्रण स्थानांतरण और EtOH 98% के 10 मिलीलीटर जोड़ें। कुप्पी के नीचे एक एन डी नायब-बी चुंबक रखो, 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और एक गिलास विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  6. , EtOH के 10 मिलीलीटर जोड़ें 2 मिनट और 40 किलोहर्ट्ज़ के लिए आरटी पर नमूना sonicate, चुंबक पर नमूना डाल दिया है और सतह पर तैरनेवाला को समाप्त। एल ई ऐज़ में इस चरण को दोहराएँटी तीन बार।
  7. आरटी पर 5 मिनट के लिए 40 kHz पर CHCl 3 और sonicate के 30 मिलीलीटर में ओलिक नैनोकणों फैलाने। निर्माता के निर्देशों के अनुसार Zetasizer में hydrodynamic आकार की जाँच करें। कांच क्युवेट में OA-IONP के 0.5 मिलीलीटर रखो और CHCl 3 के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें। स्वीकृति रेंज 7-10 एनएम तीव्रता में जेड औसत आकार के रूप में व्यक्त किया।
    नोट: OA-IONP हेक्सेन में अच्छी तरह से फैलाया जा सकता है।

3. Azelaic एसिड नैनोकणों के संश्लेषण (Azelaic एसिड-IONP)

  1. CHCl 3 (3: 2 मिलीलीटर) KMnO 4 की 44.3 मिलीग्राम और एच 2 ओ का एक मिश्रण में BTACl के 150.4 मिलीग्राम भंग। OA-IONP की एक 5 मिलीलीटर विभाज्य परिणामी समाधान जोड़ें में माइक्रोवेव कुप्पी अनुकूलित।
  2. Azelaic एसिड IONP के लिए माइक्रोवेव प्रोटोकॉल शुरू करो। 105 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर, समय 9 मिनट, 300 डब्ल्यू पर दबाव 250 साई और सत्ता स्थापित फ्लास्क में फॉस्फेट बफर पीएच के 10 मिलीलीटर = 2.9 रखो और माइक्रोवेव प्रोटोकॉल दोहराएँ। कदम ठंडा करने के बाद, नैनोकणों की वसूलीएक चुंबक का उपयोग और सतह पर तैरनेवाला को समाप्त।
  3. 10% NaHSO 3 के 5 मिलीलीटर 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 40 kHz पर एक Erlenmeyer फ्लास्क, sonicate को जोड़ें, एक चुंबक का उपयोग कणों को इकट्ठा करने और सतह पर तैरनेवाला को समाप्त। (चरण 2 बार दोहराया जाता है।) 1% NaOH के साथ नैनोकणों तीन बार धोएं और अंत में यह फॉस्फेट बफर पीएच के 5 मिलीलीटर = 7.2 में फिर से फैलाने के।
  4. hydrodynamic आकार और जीटा संभावित जाँच करें। डिस्पोजेबल मुड़ा केशिका सेल में Azelaic-IONP के 0.7 मिलीलीटर रखो और Zetasizer पर डालें।
    नोट: आकार 25-35 के लिए स्वीकृति रेंज एनएम तीव्रता में जेड औसत आकार के रूप में व्यक्त किया। जेड संभावित -45 ± 5 एम वी के लिए स्वीकृति सीमा होती है। बड़ी नैनोकणों (~ 70 एनएम) फॉस्फेट बफर पीएच> 7 बजाय पीएच = 2.9 (रेफरी केम निम्न जे 2008) के साथ प्राप्त किया जा सकता है।

4. Neridronate नैनोकणों के संश्लेषण (Neridronate-IONP)

  1. Azelaic-IONP के 2 मिलीलीटर विभाज्य के साथ एक अपकेंद्रित्र में ईडीसी के 12 मिलीग्राम और Sulfo एनएचएस की 15 मिलीग्राम जोड़ें। डाल35 मिनट के लिए आरटी पर एक भंवर में मिश्रण।
  2. नैनोकणों को अस्थिर सतह पर तैरनेवाला aspirate और HEPES 1 मिमी पीएच = 7 बफर के 1.5 मिलीलीटर के साथ कणों को धोने के लिए सेंट्रीफ्यूज के नीचे एक चुंबक रखो। (इस कदम दो बार दोहराएँ।) बाद में, neridronate की 5 मिलीग्राम जोड़ने के लिए और 2 घंटे के लिए एक भंवर में मिश्रण हिला।
  3. 1 मिमी HEPES पीएच = 7 बफर के साथ एक चुंबक और धोने (3 एक्स 2 एमएल) के साथ अलग-अलग नैनोकणों। अंत में, 1 मिमी HEPES पीएच = 7 बफर के 2 मिलीलीटर में Neridronate-IONP फैलाने के।
  4. hydrodynamic आकार और जीटा संभावित जाँच करें। डिस्पोजेबल मुड़ा केशिका सेल में Neridronate-IONP के 0.7 मिलीलीटर रखो और (उपकरण सेटअप देखें) Zetasizer पर डालें।
    नोट: आकार 40-45 के लिए स्वीकृति रेंज एनएम तीव्रता में जेड औसत आकार के रूप में व्यक्त किया। जेड संभावित -20 ± 5 एम वी के लिए स्वीकृति सीमा होती है।

5. ApoE में मेदार्बुद पट्टिका का पता लगाने में विवो - / - एमआरआई द्वारा चूहों

  1. एमआरआई अधिग्रहण के लिए तैयारी
    नोट: कई पूर्वपशु प्रयोग के लिए टीआरए सिस्टम की जरूरत है। इस प्रकार, यह आवश्यकता होगी:
    1. जानवरों anesthetize करने के लिए उचित उपकरण का प्रयोग करें।
    2. पशु स्थिर का तापमान बनाए रखने के लिए एक बाहरी गर्म हवा के साथ एक क्लोज सर्किट-घूम गर्म पानी की व्यवस्था प्राप्त करते हैं।
      नोट: इस मामले में एमआरआई संगत निगरानी और gating प्रणाली एमआरआई चुंबक अंदर जानवर का तापमान पंजीकृत करता है।
    3. जानवर की निकटता में बाहरी तापमान पर नजर रखने, पशु, श्वसन एमआरआई कंसोल में एक एकीकृत इंटरफेस का उपयोग कर छाती के पास जानवर के शरीर के नीचे स्थित सेंसर के शरीर (गुदा थर्मामीटर) तापमान।
  2. एमआरआई प्रयोग
    1. एक 100% ऑक्सीजन लाइन के साथ (दो या तीन मिनट और एमआरआई प्रयोग के दौरान रखरखाव के लिए 1-1.5% के दौरान शामिल करने के लिए 2%) वाष्पीकृत isoflurane के साथ जानवरों anesthetize।
    2. एक प्रोफाइल अधिग्रहण की मदद से चुंबक के केंद्र में पशु रखें।
    3. कदम 5.2.2 के बाद, धुन 300 मेगाहर्ट्ज (7 टी) अनुनाद आवृत्ति आरएफ कुंडल और इष्टतम संकेत स्वागत के लिए 50 ओम के लिए तार की विशेषता प्रतिबाधा मेल खाते हैं।
      नोट: बाहरी तारों और व्यक्तिगत रूप से ट्रांसमीटर कुंडली के प्रत्येक भाग के लिए एडाप्टर / फाड़नेवाला के माध्यम से माप प्रणाली के लिए जा रहा कनेक्शन पर ध्यान दे (हमारे मामले में यह एक वर्ग निकालना कुंडल था)।
    4. ट्यूनिंग और कॉयल मिलान के बाद, स्कैनर में कॉयल प्लग।
    5. आरएफ नाड़ी अंशांकन (आकार और लंबाई) और केंद्र आवृत्ति समायोजन के लिए दोनों पल्स अंशांकन और मैन्युअल आवृत्ति के केंद्र प्रदर्शन करते हैं। 90 ° पल्स अंशांकन, मोटे shimming (देखें नीचे), केंद्र आवृत्ति और रिसीवर लाभ समायोजन मैन्युअल प्रदर्शन करना।
    6. अक्षीय, राज्याभिषेक और बाण, यह भी कहा जाता tripilot: एक ढाल गूंज (फ्लैश या जीआरई) localizer स्कैन (3 विमान स्काउट अधिग्रहण का उपयोग कर सही स्थिति का प्रदर्शन करते हैं।
    7. केंद्र में चुंबकीय क्षेत्र एकरूपता अनुकूलन करने के लिए चुंबक shimming प्रदर्शन करनाचुंबक के आतंकवाद। इस कदम मैन्युअल प्रदर्शन करना (5.2.3 देखें) एक या एक भी नाड़ी खूंटी अनुक्रम का उपयोग और पहले और दूसरे आदेशों shims या किसी स्वत: shimming अनुक्रम प्रणाली में शामिल समायोजित
      नोट: एक अच्छी तरह से shimmed चुंबकीय क्षेत्र को आसानी से मान्यता प्राप्त है और टी 2 * से मापा जाता है (जैसा कि बड़ा अच्छा) या स्पेक्ट्रा की संकीर्ण FWHM।
  3. फलक 5 की एमआरआई डाटा अधिग्रहण
    1. नसों पूंछ नस में 100 μl neridronate नैनोकणों (1 मिलीग्राम [फे] मिलीलीटर -1) इंजेक्षन और छवियों को प्राप्त 1 घंटा के बाद इंजेक्शन। atherosclerotic पट्टिका का एमआरआई अधिग्रहण उदर महाधमनी (गुर्दे विभाजन) को देख के लिए मानकों को लोड।
    2. बिछा मोड में बहु-टुकड़ा रखो, 10 से 20 स्लाइस कलाकृतियों को कम करने के लिए।
    3. मोल उच्च संकल्प तेजी से स्पिन गूंज T1 भारित निम्नलिखित मानकों के साथ राज्याभिषेक या अक्षीय दृश्य में एमआरआई: FOV 60 x 30 मिमी (राज्याभिषेक), 30 x 30 मिमी (अक्षीय), मोटाई 0.8 मिमी (टुकड़ा छोटे ढाल का तार सह के साथnfiguration इस 0.6 मिमी), 400 मिसे टी.आर., 8 मिसे ते, 256 x 256 के अधिग्रहण और पुनर्निर्माण मैट्रिक्स डेटा, 6 (बड़ी ढाल) 8 (छोटे ढाल) संकेत औसत करने के लिए 5-8 मिनट औसत अधिग्रहण के समय के लिए को कम किया जा सकता है।
      नोट: ते विशेष रूप से महत्वपूर्ण है और रक्त संकेत और प्रवाह और रासायनिक पारी कलाकृतियों कि आवेदन पत्र सीमित कर सकते हैं की उपस्थिति है। इन मामलों में प्रवाह असंवेदनशील तेजी से स्पिन गूंज टी 2 आईआर कलाकृतियों और सटीक एक ही स्थान में पूरक डेटा के अधिग्रहण को कम करने की पट्टिका को चिह्नित करने में मदद कर सकते हैं कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, एक presaturation नाड़ी की दीवार और रासायनिक पारी विरूपण साक्ष्य की कमी की बाहरी सीमा के बेहतर चित्रण के लिए धमनियों की दीवार आसपास वसा ऊतकों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    4. ऐसे Dicom के रूप में एक मानक प्रारूप का उपयोग कर छवियों और देखें स्थानांतरण उपयुक्त सॉफ्टवेयर (जैसे Osirix इमेजिंग सॉफ्टवेयर या AMIDE: मेडिकल इमेजिंग डेटा परीक्षक) में 5। मैन्युअल Ves परिसीमन विपरीत प्रभाव योंएसईएल क्षेत्र, दीवार मोटाई, लुमेन क्षेत्र और पट्टिका बोझ 5।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, तीन अलग अलग IONP के संश्लेषण में वर्णित है। हाइड्रोफोबिक OA-IONP से शुरू, जलीय स्थिर नैनोकणों माइक्रोवेव संचालित संश्लेषण की मदद से प्राप्त कर रहे हैं। सभी नैनोकणों प्रस्तुत अल्ट्रा छोटे आकार hydrodynamic (डीएच <50 एनएम) एक बहुत ही संकीर्ण आकार के वितरण (चित्रा -1 सी) में। माइक्रोवेव प्रौद्योगिकी के उपयोग कोर आकार के संदर्भ में अल्ट्रा छोटे नैनोकणों प्रदान करता है। माइक्रोवेव के बाद से एक तेजी से हीटिंग, नैनोकणों के मूल में छोटे आकार देने के लिए दूसरों के तरीके के साथ तुलना में nucleation वृद्धि की दर का उत्पादन। हालांकि, अभी भी उत्कृष्ट कणों स्फटिकता उपहार के रूप में मंदिर छवियों जहां फे 3 हे 4 कोर पर जाली किनारे स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है में दिखाया गया है (चित्रा 1 ए, बी)। विधि के अन्य महत्वपूर्ण पहलू reproducibility है। Azelaic एसिड IONP के संश्लेषण के चार repetitions, एक ही परिणाम के बादhydrodynamic आकार और वितरण में (चित्रा -1) प्राप्त किया गया।

Functionalization के बाद, सीए 2 बाध्यकारी neridronate नैनोकणों में मौजूद बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स के कारण गुण सीए 2 के विभिन्न मात्रा के साथ इन नैनोकणों incubating जांच की गई। यह nanoparticle के समूहों के गठन के कारण दिखाया गया था कि टी 2 विश्राम का समय वेतन वृद्धि सीए की राशि 2 + और ​​गर्मी के समय के साथ रैखिक जबकि सीए 2 बिना नैनोकणों, स्थिर (चित्रा 1E) बने हमारी प्रारंभिक परिकल्पना के अनुरूप।

/ - - चूहों विवो एमआरआई प्रयोगों में 48 सप्ताह पुरानी ApoE में प्रदर्शन किया गया। Carotids और उदर महाधमनी बेसल छवियों पहले ले जाया गया। atherosclerotic पट्टिका के गठन के कारण घाव स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। फिर, 100 μl (1 मिलीग्राम [फे] मिलीलीटर -1 (चित्रा 2), 1 घंटा के बाद इंजेक्शन दिखाया गया है के रूप में संकेत के रूप में पट्टिका बेसल छवियों की तुलना में hypointense है। दो ROIs (ब्याज के क्षेत्र) के चुनाव में बेसल और 1 घंटा के बाद इंजेक्शन छवियों के बीच तुलना के लिए घाव क्षेत्र में तीव्रता संकेत की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है। पेशी के अनुपात में पट्टिका उन्हें (पी <0.05, चित्रा 2 बी) के बीच काफी अलग है।

इसके अलावा, जिगर में संकेत neridronate नैनोकणों के 100 μl के इंजेक्शन के बाद चूहों में नजर रखी थी आकलन करने के लिए अगर तीव्रता में कमी रक्त में और चयनात्मक संचय से नहीं संचलन समय की वजह से था। ग्राफ शो (चित्रा 2 सी) के रूप में, नैनोकणों पूरी तरह से 20 मिनट के चयनात्मक संचय की पुष्टि के बाद प्रचलन से मंजूरी दे दी थीneridronate की atherosclerotic पट्टिका की ओर नैनोकणों। अंतिम पूर्व vivo इमेजिंग और ऊतक विज्ञान प्रदर्शन किया गया। चूहे बलिदान किया गया और aortas निकाली गई। साथ और नैनोकणों बिना aortas की इमेजिंग में विवो प्रयोगों (चित्रा 2 डी) के साथ समझौते में संकेत में अंतर दिखाया।

योजना 1

योजना 1:। सिंथेटिक कदम डीएलएस द्वारा प्रत्येक बिंदु पर प्रोटोकॉल और बुनियादी लक्षण वर्णन में पीछा यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 1: चारानैनोकणों के cterization (क) मंदिर छवियों, दो आवर्धन, OA-IONP के लिए कम से। (ख) मंदिर छवियों, दो आवर्धन पर, Neridronate-IONP के लिए; (ग) नैनोकणों OA-IONP, Azelaic एसिड IONP और Neridronate-IONP के लिए hydrodynamic आकार; (घ) के चार अलग अलग संश्लेषण और (ङ) समय और कैल्शियम एकाग्रता (रेफरी मंदिर प्रोटोकॉल के एक समारोह के रूप में Neridronate-IONP की एक समाधान में टी 2 विश्राम का समय के विकास में Azelaic एसिड IONP के लिए hydrodynamic आकार: NIST - एनसीएल संयुक्त परख प्रोटोकॉल प्रदेश कांग्रेस-एक्स, माप ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना) नैनोकणों के आकार। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: एमआरआई डेटापट्टिका (क) में ApoE की विवो एमआरआई - / - (ऊपर) और Neridronate-IONP (नीचे) के चतुर्थ इंजेक्शन के बाद एक घंटे से पहले माउस। (ख) (बेसल) और Neridronate-IONP के चतुर्थ इंजेक्शन के बाद एक घंटे पहले मांसपेशी रिश्तेदार संकेत तीव्रता को पट्टिका; (ग) Neridronate-IONP और (घ) दो चूहों के साथ और नैनोकणों 5 के इंजेक्शन के बिना के लिए महाधमनी के पूर्व vivo छवियों के इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर पेशी रिश्तेदार संकेत तीव्रता को जिगर। एक बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का संस्करण।

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Discussion

आयरन ऑक्साइड नैनोकणों (IONP) सबसे महत्वपूर्ण nanomaterials में से एक हैं और यह बहुत समय पहले से विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया है। चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए विपरीत एजेंट के रूप में इन सामग्रियों के उपयोग के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित क्षेत्र है। हालांकि, संश्लेषण के मार्गों अक्सर कई समय लगेगा और सेटिंग जटिल है। कारण नाटकीय रूप से प्रतिक्रिया समय को कम करने और reproducibility बढ़ाता करने के लिए माइक्रोवेव संचालित संश्लेषण का उपयोग उच्च गुणवत्ता नैनोकणों के उत्पादन के लिए एक अच्छा विकल्प हो रहा है। प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित में, माइक्रोवेव प्रौद्योगिकी दो अलग नैनोकणों के संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है। माइक्रोवेव मुख्य मापदंडों कि कणों के अंतिम विशेषताओं को प्रभावित कर सकते हैं की एक ठीक ट्यूनिंग के लिए अनुमति देते हैं। यह ध्यान रखें कि नैनोकणों के भौतिक गुणों यदि वर्णित शर्तों के किसी भी बदल रहे हैं बदल जाएगा महत्वपूर्ण है। चूंकि कुछ रसायनों सिंथेटिक प्रक्रिया में उपयोग किया जाता है, purification कदम उच्च गुणवत्ता नैनोकणों प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।

surfactants की OA-IONP अतिरिक्त में नैनोकणों में पर्याप्त स्थिरता प्राप्त करने के क्रम में उपयोग किया जाता है। संश्लेषण के बाद, तीन शुद्धि चरणों इसे हटाने के लिए अनिवार्य हैं। Azelaic एसिड IONP के संश्लेषण के लिए, दो अलग-अलग चरणों में माइक्रोवेव आवश्यक हैं। दूसरे चरण में, कणों की अंतिम आकार अल्ट्रा छोटे IONP (डी एच <50 एनएम) बड़ा hydrodynamic आकार (डी एच पीएच = 2.9 का उपयोग कर> 50 एनएम) शारीरिक पीएच का उपयोग करने से देखते जा सकता है। Azelaic एसिड IONP की शुद्धि में, NaOH के राशि का इस्तेमाल जरूरी है। NaOH के लिए पर्याप्त राशि है, नैनोकणों स्थिर हालांकि भी कई NaOH नैनोकणों अस्थिर सामग्री प्रतिपादन से surfactant desorb कर सकते हैं के लिए जोड़ दिया गया है।

आमतौर पर, IONP रक्त परिसंचरण में कम समय जो मुख्य नुकसान में से एक है के पास है। इसके विपरीत एजेंट के रूप में इसके उपयोग के लिए, नैनोकणों CIR करने की जरूरत हैरक्त में काफी समय culate वांछित क्षेत्र तक पहुंचने के लिए। संचलन के समय रक्त में अलग अलग दृष्टिकोण प्रतिष्ठित किया जाता है बढ़ाने के लिए। इन रणनीतियों मुख्य रूप से एक PEGylated आधा भाग उस हद nanoparticle का प्रचलन समय की कुर्की पर आधारित हैं। हालांकि, Neridronate-IONP के मामले में, संचय बहुत तेजी से उत्पादन किया है। नैनोकणों पर बायोमोलिक्यूल के रूप में एक aminobisphosphonate के उपयोग मेदार्बुद पट्टिका को लक्षित करने के लिए एक नए यौगिकों के इन प्रकार के कैल्शियम क्षमताओं के आधार पर अवधारणा है। एक मानव संसाधन से भी कम समय में घाव क्षेत्र में अपनी संचय कैल्शियम की ओर Neridronate-IONP के उच्च आत्मीयता मेदार्बुद पट्टिका में निहित दर्शाता है।

मेदार्बुद पट्टिका के दृश्य के लिए, कई उन्नत इमेजिंग तकनीक को आम तौर पर कार्यरत हैं। उनमें से, पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) और एमआरआई सबसे मानकीकृत तकनीक है। पीईटी उच्च संवेदनशीलता के कारण कार्यात्मक जानकारी के मामले में सबसे अच्छा परिणाम प्रदान करता है औरउच्च संकल्प के कारण संरचनात्मक जानकारी में सबसे अच्छा परिणाम एमआरआई। पीईटी एक कृत्रिम जांच का पालन करने के लिए आदर्श विकल्प है, छोटे जानवरों में इस तकनीक का संकल्प हो सकता है हालांकि (~ 1 मिमी) atherosclerotic घावों में छोटे calcifications कल्पना करने के लिए इसके उपयोग को प्रतिबंधित। एमआरआई एक आदर्श बेहतर संकल्प (~ 0.1 माइक्रोन) को उपलब्ध कराने के लिए वैकल्पिक है। इस तकनीक की संवेदनशीलता को कम ब्याज क्षेत्र में विपरीत एजेंट के दृश्य नहीं बचा जाता है और बेहतर संकल्प छोटे calcifications की पहचान करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, परिणाम बताते हैं कि एमआरआई के उच्च संकल्प के साथ Neridronate-IONP की अनूठी तेजी संचय के संयोजन छोटे जानवरों में मेदार्बुद पट्टिका का पता लगाने के लिए एक आदर्श स्थिति है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microwave Explorer/Discover Hybrid-12 CEM Corporation, USA Any microwave for chemical synthesis can be used
Disposable PD-10 desalting columns  GE Healthcare life sciences 17-0851-01 Any size exclusion column will work
Amicon®Ultra-0.5 ml  Merck Millipore Ltd
Calibrated pH meter  SI analytics 285105127
Neodymium magnet  Aiman Gz ND010B
Vortex Genius 3  IKA 3340000
ZetaSizer Nano ZS  Malvern Instruments
Standard (macro) cell Optical glass  Labbox 11718
Zetasizer nanoseries disponsable folded capillary cells DTS1070 Malvern
Bruker Minispec mq60 Bruker

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 109 आयरन ऑक्साइड नैनोकणों माइक्रोवेव संश्लेषण बिसफ़ॉस्फ़ोनेट्स कैल्शियम जमा चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग मेदार्बुद पट्टिका।
Atherosclerosis की तेजी से जांच के लिए आयरन ऑक्साइड नैनोकणों के माइक्रोवेव संचालित संश्लेषण
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Pellico, J., Ruiz-Cabello, J.,… More

Pellico, J., Ruiz-Cabello, J., Herranz, F. Microwave-driven Synthesis of Iron Oxide Nanoparticles for Fast Detection of Atherosclerosis. J. Vis. Exp. (109), e53472, doi:10.3791/53472 (2016).

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