Introduction
Het gewervelde zenuwstelsel Uit de neurale plaat als een homogene laag van neuro-epitheelcellen. Begrijpen hoe ontwikkelingsprogramma's worden geïnduceerd, gecodeerd, en vastgesteld tijdens regionalisering van de neurale plaat is, op dit moment, een belangrijke doelstelling in de ontwikkelingsbiologie. In vergelijking met andere systemen, de experimenteel vatbaar Xenopus embryo is een model van keuze voor het analyseren van vroege stappen van neurale ontwikkeling 1,2. Het is gemakkelijk om grote aantallen embryo's te verkrijgen en buitenlandse ontwikkeling geeft toegang tot de eerste stappen van neurulatie 3. Veel tools beschikbaar om experimenteel te manipuleren Xenopus laevis (X. laevis) embryonale ontwikkeling. Micro-injectie van mRNA of morfolino (MO), waaronder induceerbare MO, samen met biochemische en farmacologische gereedschappen, maakt gecontroleerde gain of function (GOF) en functieverlies (LOF) en de specifieke wijziging van signaaltransductiewegen 4,5. De blastocoel dak ectoderm, rond de animale pool van een blastula of een zeer vroeg gastrula embryo en aangeduid als het "Animal Cap (AC), een bron van pluripotente cellen die kunnen worden geprogrammeerd door manipulatie van genexpressie vóór explantaten bereiding. In dit manuscript zijn gedetailleerde protocollen te gebruiken X. laevis AC explantaten testen in vitro en in vivo moleculaire mechanismen en cellulaire mechanismen van neurale ontwikkeling.
Een techniek wordt gepresenteerd, waardoor fijne observatie van genexpressie patronen in een Xenopus kikkervisje neurale buis, een eerste stap in de identificatie van het lot bepalen cues. Overwegende dat de waarneming van de flat-gemonteerde weefsels vaak wordt gebruikt in de studie van kippenembryo's 6, het is niet goed beschreven in Xenopus. Manipulatie van genexpressie door het injecteren van synthetisch mRNA of MO in de blastomeren van 2 of 4 cellig stadium embryo maakt programmering van ACexplantaten 4. Bijvoorbeeld remming van Bone Morphogenetic Protein (BMP) route door expressie van het anti-BMP factor Noggin, geeft een neuraal identiteit AC cellen 3. Het protocol wordt gedetailleerd beschreven voor het uitvoeren van lokale en tijd gecontroleerde blootstelling van AC explantaten om extrinsieke signalen via direct contact met een anionenuitwisselingshars kraal. Tenslotte wordt een techniek beschreven voor het testen ontwikkelings kenmerken van neurale voorlopercellen in vivo transplantatie van gemengde explantaten bereid uit verschillende geprogrammeerde cellen gedissocieerd en opnieuw verbonden.
De kikker embryo is een krachtig model voor de vroege gewervelde neurale ontwikkeling te bestuderen. Het combineren van manipulatie van genexpressie in vitro culturen explanteren levert belangrijke informatie bij de studie van neuroepithelium regionalisering, proliferatie en morfogenese 7-12. De programmering van AC explantaten toegelaten ontwikkeling van een functionele hart ex vivo 13,14. Het gebruikvan explantaat enten 15 geleid tot de identificatie van de minimale transcriptionele switch induceren van de neurale differentiatie programma 16. De zona limitans intrathalamica (ZLI) is een signalering centrum dat sonic hedgehog (Shh) om de groei en regionalisering van de caudale voorhersenen controle afscheidt. Bij voortdurende blootstelling aan Shh, neuro-cellen co-expressie van de drie transcriptiefactor genen - Barh-achtige homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) en Iroquois-3 (irx3) - verwerven van twee kenmerken van de ZLI compartiment: de bevoegdheid om uitdrukken shh, en de mogelijkheid om te scheiden van de voorste neurale plaat cellen. Als modelsysteem, zal de inductie van een ZLI lot in neuro-epitheelcellen gepresenteerd 8.
Deze protocollen zijn gericht op het leveren van eenvoudige, goedkope en efficiënte hulpmiddelen voor ontwikkelingsstoornissen biologen en andere onderzoekers om de fundamentele mec verkennenhanisms van belangrijke neurale cel gedrag. Deze protocollen zijn zeer veelzijdig en laat het onderzoek van een groot aantal extrinsieke en intrinsieke neurale vastberadenheid cues. Het staat op lange termijn in vivo analyse van de neurale lineage inzet, inductieve interacties en cel gedrag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimenten voldoen aan de nationale en Europese regelgeving inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt en met de internationaal vastgelegde beginselen van vervanging, vermindering en verfijning.
1. Flat-montage van Xenopus laevis Kikkervisjes voorste neurale buis Na Whole-mount in situ hybridisatie
- Verkrijgen X. laevis embryo's volgens standaard procedures 4 en te verouderen tot ze neurula fase 26 en ouder (volgens ontwikkelings tabel 17 Nieuwkoop en Faber bereikt.
- Fix X. laevis kikkervisjes door incuberen in een oplossing van 4% paraformaldehyde (PFA). Rock en draai de embryo's in een 2 ml glazen flesje, 1 om 1,5 uur bij kamertemperatuur fase 26 om 38 embryo, 2 uur bij kamertemperatuur embryo's in latere stadia stadium.
LET OP: PFA is giftig bij contact en een verdacht carcinogeen. Er wordt gemanipuleerd in een zuurkast.
OPMERKING: One X. laevis kroost isgewoonlijk vastgesteld in een 2 ml glazen flesje maar groter glazen ampul kan worden gebruikt. - Was de embryo's in hetzelfde flesje behulp 1x PBS met 0,1% Tween (PBT), 3 min bij kamertemperatuur, tweemaal.
OPMERKING: Tenzij anders geef de PBS gebruikt is met of zonder calcium en magnesium. - Dehydrateer de embryo's in 100% methanol (MeOH) gedurende ten minste 12 uur bij KT in hetzelfde flesje. Wijzig de MeOH 100% ten minste tweemaal onder de kap met een kunststof micropipet.
OPMERKING: De MeOH draait iets geel als lipiden opgelost. Let op de MeOH is giftig bij inademing en moet onder een kap worden gemanipuleerd. - Hydrateren de embryo's met dezelfde flacon via een gegradeerde reeks MeOH baden: MeOH 75% in PBS, 50% MeOH in PBS, 25% MeOH in PBS, PBS tweemaal elk bad 5-10 min bij RT. De MeOH oplossingen worden gewijzigd onder de kap met een kunststof micropipet.
- Met behulp van een plastic pipet het embryo te worden ontleed in een 60 mm petrischaal gevuld tot de top met PBT. Met behulp van twee fijne tang zorgogen volledig verwijderen door één fijne tang tussen de ogen en de neurale buis op het niveau van de optische steel. Maak de ogen van de neurale buis. Introduceren zorgvuldig de tang onder de ectoderm bovenop de neurale buis. Met zorg, trek het ectoderm vanaf achter het hoofd en gooi het.
- Voer een dubbele of enkele ISH met behulp van digoxigenine-gemerkte of fluoresceïne-gelabelde probes zoals eerder beschreven 18,19.
- Na de ISH overdracht van de embryo's in een nieuwe 60 mm petrischaal gevuld tot de top met PBT met een plastic pipet.
- Met behulp van fijne tang voorzichtig los van de neurale buis van de rest van het embryo. In dit stadium, de voorste neurale buis loskomt van het achterste neurale buis. Zorgvuldig losmaken overige delen van het ectoderm ligt over de neurale buis, de notochord die losjes is vastgemaakt onder de neurale buis, de otic blaasjes en overige delen van het mesoderm. Zorg ervoor dat de neurale buis is verstoken van eventuele bijlagenin dit stadium.
LET OP: Om schade aan de neurale buis te voorkomen voeren alle neurale buis / embryo transfer met een plastic overdracht pipet of een micropipet, indien nodig met een tip snee aan zijn einde. De diameter van het uiteinde is aangepast aan de grootte van de neurale buis. - Breng de ontleed neurale buis (zie noot stap 1.9) in een 1,5 ml buis gevuld met 50% glycerol verdund in PBS. Wacht tot de neurale buisjes zijn gedaald tot beneden de glycerol oplossing, gewoonlijk O / N bij 4 ° C.
- Verwijder de oplossing van 50% glycerol / PBS met behulp van een micropipet P1000 en voeg dezelfde 1,5 ml tube oplossing van 90% glycerol / PBS met behulp van een micropipet P1000. Wacht tot de neurale buisjes vallen op de bodem van de 90% glycerol / PBS oplossing, gewoonlijk O / N bij 4 ° C.
NB: voor de lange termijn opslag, gebruik dan 90% glycerol / PBS plus antibiotica om bacteriële ontwikkeling te voorkomen. - Breng de neurale buisjes op een glasplaat of een microscoopglaasje met een plastic pipet overdracht.
- Dissekte de neurale buis langs de dorsale en ventrale middellijnen met wolfraam naalden. Tijdens deze stap de neurale buisjes worden bewaard in 90% glycerol / PBS.
- Monteer de beide zijden van de neurale buis in 90% glycerol / PBS behulp verstevigingsringen bedekt met een dekglaasje.
- Bevestig de dekglaasjes met vernis en houden bij 4 ° C.
2. Animal Cap Explantaten Inductie behulp anionuitwisselingshars Beads
- Breng 100 pi van anionen uitwisselingshars bolletjes in een 2 ml buisje met een micropipet P1000. Was de korrels ten minste vijf opeenvolgende keer met steriel gedistilleerd water. Laat de parels bezinken op de bodem van de buis en vervang het steriel gedestilleerd water met behulp van een micropipet P1000. Raak de kralen niet aanraken.
- Laat de parels inwerken O / N in een 2 ml buisje gevuld met steriel gedestilleerd water met runderserumalbumine (BSA) (10 mg / ml) bij 4 ° C.
- Twee uur voor het verzamelen van de ACS, plaats de helft van de parels in een nieuwe 1,5 mlbuis met behulp van een micropipet P1000. Vervang het steriel gedestilleerd water met 500 ui van het medium dat het molecuul worden getest op de mogelijke inductieve of bekend een bepaald lot induceren. Houd de andere helft van de korrels, zoals ze worden gebruikt als een negatieve controle.
- Incubeer de kralen bij 4 ° C gedurende ten minste 2 uur.
- Het uitvoeren van alle verdere stappen onder de stereomicroscoop en het uitvoeren van alle AC-overdracht met een micropipet.
- Transfer of vroege blastula gastrula embryo's in PBS met calcium en magnesium aangevuld met 0,2% BSA met een plastic pipet overdracht.
OPMERKING: Embryo's ontwikkelen bij 12 ° C bereik blastula en gastrula stadia 20 tot 24 uur. - Verwijder de embryo's vitellinemembraan behulp van een tang zoals eerder beschreven 20. Bevestig de embryo met een tang. Neem de vitelline-membraan met de zijde van de andere tang. Houdt het membraan langzaam afschilferen het embryo. Voer deze procedure op het ventraal (plantaardige) zijde van het embryo. Heeft het dier kant van het embryo niet beschadigen.
- Isoleer kleine ACs zoals eerder beschreven 21. Het dier paal is de embryo's gepigmenteerde deel. Met behulp van fijne tang uitgesneden een klein vierkant van weefsel van het dier paal. De AC weefsel bevat alleen de ectodermale cellen. Zorg ervoor dat het weefsel van uniforme dikte. Zo niet, verwijder de AC uit de analyse.
- Plaats elke AC in een Terasaki multiwell platen in 0,5x gewijzigd Barth's Saline (MBS) 4. Plaats de AC in de put met zijn gepigmenteerde dier naar beneden in contact met de ronde bodem van het putje.
Opmerking coating pipetten met 0,1% BSA-oplossing voorkomt de adhesie van kleine stukjes weefsel lijm aan de kunststof. - Plaats een kraal op elke dop met een micropipet P20. Indien nodig, gebruik dan een tang zorgvuldig plaats de kraal in het midden van de dop.
OPMERKING: Bij gedrenkt in een geconditioneerd medium worden de korrels gekleurd in roze. Selecteer de meest coLored kralen. - Incubeer bij kamertemperatuur (18-22 ° C) gedurende 6 uur zonder de Terasaki multi-putjesplaat. De kraal kleeft aan het AC in minder dan 2 uur.
- Plaats de Terasaki multiwell plaat op de top van papers geweekt in water. Bedek de plaat met een plastic container.
LET OP: Deze 'vochtigheidskamer' voorkomt vroegtijdige verdamping van de putten. - Cultuur de ACS in 0,5 x MBS of 3/4 NAM (zie stap 4,1) in de vochtige kamer bij 15-20 ° C totdat het embryo sibling het juiste stadium om het effect van factor testen bereikt.
- Bevestig de ACS gedurende 1 uur in vers bereide 4% PFA. Dehydrateer de ACS in 100% MeOH zoals eerder beschreven (stap 1,4).
3. Animal Cap celdissociatie en Reaggregation Voordat enten in een Xenopus laevis neurula
- Coat petrischalen (60 mm) of 12 wells platen met 3% agarose in steriel water of PBS zonder calcium en magnesium. Voeg genoeg agarose aan de b dekkenottom van de petrischaal of de put. Vooraf verwarmen de platen bij kamertemperatuur (18-22 ° C). Eventueel opgeslagen de platen paar dagen bij 4 ° C om uitdroging te voorkomen.
- Bereid calciumvrije Holtfreter's zout (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) en Holtfreter's zout (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. Opmerking: de oplossing van CaCl 2 kan niet worden geautoclaveerd.
- Vul het-agarose gecoate goed aan de top met calcium vrije Holtfreter's zoutoplossing.
- Bereid blastula of vroeg gastrula embryo hun ACs geïsoleerd zoals eerder beschreven (stap 2,5 tot 2,7).
- Isoleer ten minste 15 of tot 30, kleine ACs 21. Met behulp van fijne tang uitgesneden een klein vierkant van weefsel van het dier paal. De AC weefsel bevat ectodermale cellen en dus een uniforme dikte. Zo niet, verwijder de AC uit de analyse.
NB: Het dier pool is de embryo's gepigmenteerde deel. - Breng de ACS in een agarose-gecoate goed gevuld tot de top met calcium vrije Holtfreter's zoutoplossing. Plaats de AC's met hun gepigmenteerde kant naar boven.
OPMERKING: De dissociatie proces begint snel in calciumvrij Holtfreter's zoutoplossing. - Wacht een paar minuten voor de cellen om te beginnen dissociatie. Acht dit door de uitsplitsing van de weefsels. Met behulp van fijne tang, scheid de gepigmenteerde laag van de rest van de AC en gooi ze met een micropipet P20. Volledige cel dissociatie werkwijze geeft afscheiding van cellen van elkaar.
LET OP: Een of twee gepigmenteerde lagen kunnen binnen de re-geaggregeerde explant worden overgelaten aan de visualisatie te helpen tijdens het enten. - Centreer de cellen met cirkelvormige bewegingen van de plaat. Met behulp van een micropipet P1000 verwijder voorzichtig zoveel medium mogelijk. Wees niet naar de cellen te raken.
- Voeg 1 ml Holtfreter's zoutoplossing met calcium om de put. Breng de los ACSin een 1,5 ml buis.
OPMERKING: 2 ml buisjes kunnen niet worden gebruikt vanwege hun ronde bodem. - Pellet de cellen door centrifugatie, 5 min bij een maximale snelheid van 2000 rpm een bank centrifuge (500 xg). Verwijder voorzichtig de bovenstaande vloeistof met een micropipet P1000.
- Naar de gedissocieerde cellen 20 pl Holtfreter's zoutoplossing met calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5.
- Houd de gedissocieerde ACS, 3-6 uur bij kamertemperatuur (18-22 ° C).
Opmerking: Dit is voldoende tijd voor de cellen opnieuw aggregaat. De re-aggregatie zichtbaar als cellen vormen een kleine bal op de bodem van de buis. - Maak de explantaat voorzichtig van de bodem van de buis door toevoeging van 1 ml 0,5 x MBS of 1 ml 3/4 NAM (zie stap 4,1). Breng de explant in een niet-gecoate plaat met een plastic overdracht pipet.
- Stadium de explantaten met hun controle broers en zussen. Voor de lange termijn cultuur gebruik antibiotica: kanamycin (50 ug / ml), ampicilline (50 ug / ml) en gentamycine (50 ug / ml).
4. enten van Animal Caps Explantaten in de neurale plaat van X. laevis Embryo
- Bereid 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 ug / ml gentamycine). Houd niet langer dan 1 week voor de dissectie en bewaar bij 4 ° C. Oudere NAM kan worden toegepast voor het bereiden-agarose gecoate dissectie gerechten (hieronder).
- Jas petrischalen (60 mm) met 3% agarose in 3/4 NAM waarin kleine gaten zijn gemaakt met behulp van een siliconen mal, of de cover van een tafel tennis racket.
OPMERKING: De agarose bedekt de bodem van de petrischaal. Laat wat ruimte zodat de petrischaal te vullen met 3/4 NAM. Alternatief maken dissectie gerechten met niet-drogende boetseerklei. Binnen de klei, knijp de embryo iets tijdens de dissectie procedure. Graven kleine gaatjes in deagarose met afgeronde tang Deze 'dissectie gerecht' helpt om de embryo's te houden tijdens de dissectie procedure. - Verzamel dissectie instrumenten: plastic overdracht pipetten, een 'wenkbrauw mes' (gemaakt met wenkbrauw haren ingebed in paraffine op het puntje van een glas Pasteur pipet) 22, twee fijne dissectie pincet, P1000 micropipet en tips, een stereosmicroscope met vergroting 8-40X, een heldere lichtbron met optische vezel gidsen. Houd alle ontleden gereedschappen schoon; Na elk experiment, spoel ze tweemaal met gedestilleerd water, eenmaal met 100% ethanol en laten drogen. Uit de buurt van stof en indien nodig autoclaaf het metaal ontleden gereedschappen.
- Laat het los en opnieuw samengevoegd ACS (protocol 3), en hun broers en zussen X. laevis embryo's te ontwikkelen tot ze stadium 13 (neurula) te bereiken volgens ontwikkelingsstoornissen tabel 17 Nieuwkoop en Faber. Voor transplantatie binnen de neurale plaat fase 13 tot 15 embryo stadium worden gebruikt.
- Het uitvoeren van alledaaropvolgende stappen onder de stereomicroscoop.
- Met behulp van een plastic overdracht pipet de embryo's in PBS met calcium en magnesium aangevuld met 0,2% BSA. Verwijder de embryo's vitellinemembraan zoals eerder beschreven 20. Bevestig de embryo met een tang. Neem de vitelline-membraan met de zijde van de andere tang. Houdt het membraan stevig langzaam afschilferen het embryo.
LET OP: Doe deze procedure aan de ventrale (plantaardige) zijde van het embryo. Beschadig de embryo's neurale plaat. Wanneer embryo's werden beschadigd tijdens de vitelline membraan verwijderingsstap, breng de embryo's in een 60 mm petrischaal die 3/4 NAM met een plastic pipet overdracht en wacht 15 minuten, voldoende tijd voor het genezingsproces plaatsvindt. - Vul de dissectie schotel naar de top met verse 3/4 NAM.
- Met behulp van een plastic overdracht pipet de embryo zonder hun vitelline membraan in de dissectie schaal. Plaats de embryo dorsale zijde omhoog inde putjes. Tijdens de overdracht niet toestaan dat de embryo in contact met de lucht-vloeistof-interface sinds X. te gaan laevis worden gelyseerd door oppervlaktespanning.
- Breng de AC explant te worden geënt in de dissectie plaat met behulp van een plastic overdracht pipet of een micropipet P1000. Zodra de pipet is in de vloeistof, zodat de explantaten om langzaam te zinken door de zwaartekracht, of duw heel voorzichtig.
- Handhaving van de embryo's met afgeronde tang. Met de wenkbrauw mes een insnijding in de neurale plaat waar u van plan om stuk van uw explant enten.
Opmerking: In stap 14 het voorste buigen van de neurale plaat gebruikt als landmark kan zijn, markeert het diencephalon gebied (figuur 4). - Knip een klein stukje neuroepithelium, met afgeronde pincet en een wenkbrauw mes. Snijd een klein stukje van de explant met de wenkbrauw mes.
Opmerking: Het stukje explantaat moet ongeveer dezelfde grootte en vorm als de neuroepithelium geablateerd gebied. Plaats het stuk explant in de neuroepithelium incisie met behulp van de wenkbrauw mes en fijne tang. Zorg ervoor dat de explant snel hecht aan het embryo. - U kunt ook plaats een stuk glas dekglaasje op de geënte embryo om het transplantaat op zijn plaats te houden. Om dit te doen, snijd een goed glas dekglaasje in zeer kleine stukjes met behulp van grof tang. Zorg ervoor dat de grootte is ongeveer 1,5 mm 2. Dompel de stukjes in een petrischaal met 3/4 NAM of PBS behulp van een tang. Kies een stuk glas groter is dan het embryo om beschadiging te voorkomen. Het embryo zal een klein beetje afgevlakt.
- Wacht minstens 30 minuten zonder te bewegen, of alleen verplaatsen de dissectie plaat voorzichtig. Laat het embryo te herstellen gedurende 30 minuten tot 2 uur en verwijder voorzichtig het dekglaasje indien nodig. Pipet zorgvuldig de geënte embryo's in een schone schotel gevuld met 3/4 NAM, met behulp van de plastic overdracht pipet.
OPMERKING: Geënte embryo vaak bacteriën of schimmels besmetting ontwikkelen. Voor de lange termijn cULTUUR gebruik antibiotica kanamycine (50 gg / ml), ampicilline (50 ug / ml) en gentamycine (50 ug / ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebaseerd op morfologische overwegingen bij diverse soorten, embryologische manipulaties en het expressiepatroon van regulerende genen een conceptueel model houdt de neurale plaat wordt verdeeld in transversale en longitudinale segmenten die een ontwikkelingsstoornis raster genereren afzonderlijke histogenic velden definiëren. In de neurale plaat, de primordia van de voorhersenen, middenhersenen, achterhersenen en het ruggenmerg zijn allemaal al langs de antero-posterior (AP) as vastgesteld tijdens gastrulatie (beoordeeld in 23-25). Tijdens neurulatie kan de histogenic velden worden gedetecteerd als ruimtelijk beperkte domeinen van genexpressie. Op basis van de expressiepatronen van regulerende genen, wordt de voorhersenen primordium verdeeld in zes transversale segmenten die verschilt histogenic velden genoemd prosomeres (p) genereren. Elke prosomere is verdeeld in een ventrale (basaal) en dorsale (neusvleugel) deel (herzien in 26,27). In amfibieën, de prosomere 2(p2) geeft aanleiding tot de epithalamus de thalamus en de organisator Z ona L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (beoordeeld in 28,29).
Op Figuur 1 worden getoond van de platte-montage van X. laevis en X. tropicalis voorste neurale buis in fasen 30, 32 en 35 na de WM-schotel. WM-ISH werden uitgevoerd volgens proefopzet 1 via probes voor transcriptiefactoren fezf2 dat markeert het telencephalon en p3, barhl2 dat p2, de corticale zomen en de middenhersenen, Iroquois-1 (irx1) en Iroquois-3 (irx3) markeert die respectievelijk mark staartvin p2 en alar p2 en voor de morfogen Shh dat de ZLI, de basale voorhersenen en middenhersenen (figuur 1E) markeert. Een vergelijkende analyse van de verschillende genexpressiepatronen blijkt dat de voorste grens van barhl2 p2 expressie aanligt tegen de caudale grens van fezf2 expressie in p3 (figuur 1A). Irx3 co-expressie gebracht met shh in de toekomst ZLI (Figuur 1B). Binnen p2 irx1 uitdrukking domeinnaam is complementair aan die van Shh (figuur 1C) 8. De expressie patroon van barhl2 in X. tropicalis in stap 35 is getoond in figuur 1D. Een schematisch diagram van de expressie gebieden van deze genen in de ontwikkeling amfibieën voorhersenen wordt in figuur 1E.
Met behulp van protocol 2 het vermogen van anionen uitwisselingshars bolletjes gedrenkt in Shh shh tot expressie werd onderzocht in ACs explantaten induceren. X. laevis embryo's werden geïnjecteerd in het 4 dier blastomeren bij de 4 en 8 cellen stadium met mRNA dat codeert voor de voorste neuro-inducerende noggin samen met barhl2, oTX2, irx3 en GFP als een injectie tracer. De expressie van het anti-BMP factor Noggin remt de BMP route en geeft een neurale identiteit AC cellen 3. We verwijzen naar AC uiten Noggin als Anteriorised Animal Cap (AAC). Blastocoel dak explantaten werden bereid zoals beschreven in protocol 2. AAC werden gedurende 48 uur bij 18 ° C in contact met een anionenuitwisselingshars kraal gedrenkt in een geconditioneerd medium (CM) bevatten of niet, het uitgescheiden N-terminale deel van de morfogen sonic hedgehog uit rat (N-Shh). De expressie van endogene shh werd geanalyseerd door ISH (figuur 2). Expressie van Xenopus shh (Xshh) gedetecteerd in cellen in contact met de kraal gedrenkt in CM N-Shh, maar niet in cellen in contact met de kraal gedrenkt in CM zonder N-Shh (figuur 2B).
Met behulp van protocol 3 de mogelijkheid van verschillende celtypen te scheiden van de ene another werd onderzocht. X. laevis embryo's werden geïnjecteerd in de 4 dieren blastomeren op 4 en 8 cellen stadium met mRNAs coderend voor noggin met of zonder otx2, barhl2 en irx3, zoals vermeld met ßGal of GFP als tracers (figuur 3A). Stadium 8/9 ACs werden gescheiden en opnieuw samengevoegd tot explantaten samengesteld uit gemengde neuro-cellen die zowel ßGal- en GFP-expresserende cellen te genereren. De opnieuw geaggregeerde explantaten werden gedurende 48 uur bij 18 ° C. ßGal activiteit werd geopenbaard rood naar 30 (figuur 3A). Het gedrag van cellen werd geobserveerd door het volgen van hun lokalisatie binnen de opnieuw geaggregeerde explantaten. In explantaten waarbij AAC cellen gemengd met AAC cellen die Otx2 (rood), zijn de ßGal tot expressie brengende cellen niet scheiden van de GFP tot expressie brengende cellen beide typen cellen vrij door elkaar (figuur 3B, 3C). In tegenstelling, inexplantaten waarbij Otx2 expressie cellen (GFP) worden gemengd met Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) tot expressie brengen cellen (ßGal), de ßGal expressie cellen (rood) vormen samenhangende patches en niet gelijkmatig verdeeld binnen de re-geaggregeerde explant ( figuur 3D, 3E).
Met behulp Protocol 4, het gedrag van geprogrammeerde AC cellen werd bestudeerd in vivo. X. laevis embryo's werden geïnjecteerd in de 4 dieren blastomeren op 4 en 8-cell trappen met mRNAs coderend voor noggin met otx2 alleen of tezamen met barhl2 en irx3. ßGal werd als tracer. Tegelijkertijd werden embryo soortgelijke geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor het uitgescheiden noggin en N-terminale deel van het morfogeen shh uit ratten (N-shh). Bij stadium 8/9, werden AC explantaten los en onmiddellijk opnieuw samengevoegd tot gemengde explantaten samengesteld uit neuroepit genererenhelial cellen ofwel uiten N-Shh en Otx2 of uiten N-Shh en Otx2, Barhl2 en Irx3 (BOI3). Kleine stukjes van de gemengde explantaten werden geënt op de neurale plaat van X. laevis embryo in stap 14. De getransplanteerde cellen werden gemerkt met ßGal kleuring (rood). In stap 35 de expressie van endogene shh werd geanalyseerd door ISH. Wanneer geënt in de voorste neurale plaat van X. laevis embryo's, gemengde explantaten samengesteld uit BOI3 en N-Shh expressie brengen ontwikkelde twee specifieke kenmerken van ZLI cellen: de geënte cellen uitgedrukt Xshh en gescheiden van anterior neuro-cellen (Figuur 3C). Wanneer daarentegen gemengd explantaten samengesteld Otx2 - en N-Shh- expressie brengende cellen worden geënt in het X. laevis neurale plaat, heeft de geënte cellen niet uitdrukken shh en niet scheiden van hun buren (Figuur 3B) 8.
Figuur 1. Flat-gemonteerde neurale buizen uit X. laevis en X. tropicalis embryo's whole-mount dubbele ISH (A - D). WM-ISH wordt uitgevoerd met behulp fezf2, barhl2, irx1, irx3 en Shh als probes op (A - C) X. laevis embryo's in stadium 30, 32 en 35 en (D) X. tropicalis embryo in de eerste fase 35, zoals aangegeven. De neurale buizen Representatieve embryo's uitgesneden en vlak gemonteerd zoals beschreven in protocol 1. De ontleed neurale buizen worden getoond vanuit een zijaanzicht, dorsale up, anterior links. De markeringen en fasen zijn aangegeven. De rostrale en caudale grens van p2 zijn aangegeven met pijlen. (AC) De schaal bar staat voor 0,5 mm. (D) de sCale bar staat voor 0,1 mm. . (E) Schematische voorstelling van voorhersenen markers op st.30 barhl2 expressie domein wordt aangegeven in gearceerde lijnen; Gebieden van meningsuiting worden getoond voor fezf2 (roze), Shh (rood), irx3 (geel) en irx1 (groen). p staat voor prosomere. De pijnappelklier gelegen op de top van p2 wordt getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Inductie van shh expressie in geprogrammeerd explantaten via contact met anionuitwisselingshars kralen. Kleine Acs bereid uit embryo geïnjecteerd met mRNA coderend voor noggin, barhl2, otx2 en irx3, met GFP als tracer. AAC staat fof Anteriorised Animal Cap. De AAC explantaten expressie Barhl2, Otx2 en Irx3 (AAC BOI3) worden gedurende 48 uur in contact met een kraal gedrenkt in een geconditioneerd medium (CM) die hetzij N-Shh, of niet, zoals aangegeven. De explantaten worden geanalyseerd door ISH de expressie van Xenopus (X) shh. De schaal bar staat voor 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Analyse van segregatie cel gedrag opnieuw geaggregeerde explantaten. (A) X. laevis embryo's worden geïnjecteerd met mRNA coderend voor noggin, otx2, barhl2 en irx3 zoals aangegeven. ßGal en Gfp worden gebruikt als tracer. In fase 8/9 kleine Acs zijn voorbereid , Gescheiden en opnieuw samengevoegd tot explantaten gemaakt van GFP / ßGal gemengde celtypen te genereren. De explantaten worden gedurende 48 uur bij 18 ° C en ßGal Activiteit geopenbaard (rood). (B - E) Vertegenwoordiger explantaten samengesteld uit gemengde cellen die eiwitten zoals aangegeven worden getoond. AAC staat voor Anteriorised Animal Cap. (B, C) ACs cellen die Noggin en Otx2 (ßGal) willekeurig verspreid vermengd met ACs cellen die Noggin (GFP). (C) vergroot aanzicht van (B). (D) AAC cellen die Barhl2, Otx2 en Irx3 (BOI3) (ßGal) gehergroepeerd en gescheiden van AAC cellen die Otx2 (GFP). (E) vergroot aanzicht van (D). (B, D) De schaal bar staat voor 0,5 mm. (C, E) De schaal bar staat voor 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Geprogrammeerde explants exposeren hun ontwikkeling functies als geënt in de neurale plaat van een stage 14 embryo (A) Experimentele regeling:. AAC bereid uit embryo geïnjecteerd met mRNA zoals aangegeven. In stap 8/9 cellen van het dak van de blastocoel worden gescheiden en opnieuw samengevoegd met explantaten van gemengde celtypen tot expressie ßGal (rood) te genereren. De explantaten worden gekweekt tot hun broers en zussen bereikte stadium 14. Een klein stukje van de gemengde explant (groene rechthoek) wordt binnen de voorste neurale plaat in een incisie te zetten. Bediend embryo's worden gekweekt tot het podium 35. bediend embryo's worden geanalyseerd door WM-ISH met X. laevis shh (Xshh) als probe. ßGal activiteit wordt onthuld in het rood accOrding 30. (B, C) De geënte zijkanten van het podium 35 representatieve neurale buizen worden getoond, zijaanzicht, dorsale up, anterior links. (B) geënt met gemengde AAC uiten Otx2 en N-Shh. (C) geënt met gemengde AAC expressie Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) en N-Shh. Getransplanteerde cellen worden aangegeven met een rode ster. De roze ster geeft de potentiële diencephalon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurale ontwikkeling georkestreerd door een complex samenspel van cellulaire ontwikkelingsprogramma's en signalen van de omringende weefsels (besproken in 3,31,32). Hier beschrijven we een set protocollen die gebruikt kunnen worden in X. laevis embryo's extrinsieke en intrinsieke factoren betrokken bij neurale lot bepalen en neurale morfogenese in vitro en in vivo onderzoeken. Deze protocollen kunnen worden gebruikt als zodanig op X. tropicalis embryo echter X. tropicalis embryo's zijn vier keer kleiner dan X. laevis embryo's. Zowel de tang en wolfraam naalden moeten fijner. Gebruik indien mogelijk X. laevis.
Precieze visualisatie van X. laevis en X. tropicalis neurale histogenic velden kan worden bereikt met behulp van de histologische vlakke montage van ontleed neurale buis van WM-ISH. Deze techniek werd met succes uitgevoerd op X. laevis embryo van stap 26 naartrap 45 (figuur 1) en X. tropicalis embryo's van fase 30 tot stadium 45 8,33. Oudere embryo's zijn gemakkelijker te dan jongere embryo ontleden. Deze techniek is eenvoudig uit te voeren. Dit maakt analyse van genexpressiepatronen, afzonderlijk of gecombineerd, op neurale buizen in verschillende ontwikkelingsstadia. Met dit protocol is het eenvoudig om een kant van een neurale buis vergelijken met de andere. Dit is erg handig in Xenopus GOF en LOF experimenten. De waargenomen op de geïnjecteerde kant van de neurale buisdefecten kan worden vergeleken met een normale ontwikkeling waargenomen aan de bedieningszijde. Deze strategie is gebruikt om GOF en LOF fenotypen in X. analyseren laevis embryo 8,33. Een belangrijke stap in dit protocol is de juiste bevestiging van de embryonale weefsels. Een onvolledige fixatie voorkomt dat de efficiënte detachement van het ectoderm van de neurale buis. De pre-dissectie van de neurale buis vergemakkelijkt het binnendringen van in sitU probes. Echter eenmaal geïsoleerd, is het gemakkelijk om de neurale buis verliezen. Het is raadzaam om een deel van het embryo tijdens de ISH procedure aan enig verlies te voorkomen.
De embryo's die voor deze experimenten moeten robuust zijn en moeten goed genezen. Gooi partij van ongezonde embryo's. Om ACs en graft explantaten ontleden tussenfase 13 en stage 15 is het mogelijk om te groeien X. laevis embryo explantaten en bij verschillende temperaturen (12-18 ° C en 18-20 ° C). Opmerkelijk X. laevis embryonale cellen bevatten genoeg dooier voor hun overleving meerdere dagen mogelijk maken zonder toevoeging van externe voedingsstoffen. Om geen schade aan de embryonale weefsels, elke overdracht procedure van embryo, AC, of explant moet zorgvuldig worden gedaan. Het is raadzaam om ofwel een plastic overdracht pipet of micropipet gebruiken indien nodig met een tip snee aan zijn einde. De diameter van het uiteinde is aangepast aan de grootte van de embryo of de grootte van het explantaat, over te dragen.Het is opmerkelijk, coating pipetten met een 0,1% BSA-oplossing voorkomt de hechting van kleine stukjes weefsel aan het plastic.
AC explanten kan worden geprogrammeerd via gedwongen genexpressie, of door middel van blootstelling aan extrinsieke factoren in een tijd- en ruimte gecontroleerde manier. We beschrijven een techniek waarbij lokale inductie via direct contact tussen een explantaat en een kraal. Eventueel de korrels verder worden gefragmenteerd met behulp van een tang. Vergeleken met andere eerder beschreven strategieën Deze techniek laat het testen van lokale inductie met pure factoren, alleen of in combinatie, op precieze tijdskader.
Met behulp van een eerder beschreven benadering cel dissociatie en re-associatie 34, is het mogelijk celbeweeglijkheid capaciteiten cel gedrag segregatie en de vorming van omhullende onderzoeken ingeklemd en gemengd AC explantaten 8. De cel dissociatie begint in minder dan 15 min. Vermijd shaking de plaat tijdens de dissociatie stap om het verlies van cellen te voorkomen. De AC gepigmenteerde lagen niet goed distantiëren. Het wordt aanbevolen om hen tijdens de dissociatie stap te verwijderen. Een paar AC gepigmenteerde lagen er nog in de re-geaggregeerde explant. Het helpt bij het visualiseren van het transplantaat. Het interfereert niet met analyse op latere ontwikkelingsstadia.
In dit manuscript een protocol om gemengde explantaten transplantatie in een neurale plaat is gedetailleerd. In Xenopus embryo, de neurale plaat is geopend tussen 13 en podium podium 15. Deze fasen zijn daarom geschikt voor transplantatie in het neuroepithelium. X. laevis weefsels lijm eigenschappen veranderen met de tijd. Het is belangrijk om AC explantaten enten in een gastheer in een soortgelijk ontwikkelingsstadium. In een vroeg stadium van ontwikkeling, X. laevis embryo's gekweekt in 3/4 NAM reparatie zeer snel. Als sommige embryo's zijn beschadigd tijdens het verwijderen van de vitelline membraan kan het nuttig zijn om 15 min wachten,dat is de tijd die voor het genezingsproces plaatsvindt. Insertie kan worden begunstigd door een stuk glas dekglaasje op het geënte gastheerweefsel, maar is geen vereiste. De kracht die door het genezingsproces kan extrusie van de getransplanteerde cellen. Morfologie van de gastheer embryo beter behouden wanneer het implantaat wordt gedwongen met uitwendige druk, zoals een dekglaasje. Om het succes van het implantaat te beoordelen, kan een fluorescerende tracer worden geïnjecteerd in de explantaten. De aanwezigheid van fluorescerende cellen in de geënte embryo kan worden gevisualiseerd tot de neurale buis gesloten. Het belangrijkste nadeel AC cultuur en transplantatie experimenten is de frequentie van bacteriën of schimmels besmetting. Gebruik schoon of steriel materiaal en steriele oplossingen zo vaak mogelijk te gerecht besmetting bij elke stap van het protocol te voorkomen. Voor de lange termijn de cultuur van geënte embryo altijd gebruik maken van antibiotica en een temperatuur van 15 ° C. Vermijd langdurig contact van AC explantaten of embryo's met agarose. We OBSERVed dat de levensduur van de explantatie kan verminderen. Het enten techniek is krachtig, maar tijdrovend. Het is niet aan te raden om het scherm voor het lot bepalen signalen mee, maar om voldoende informatie vooraf te verwerven op uw weefsel van keuze.
Naast de traditionele voordelen, de recente genetische vooruitgang in Xenopus opende de weg voor deze modelsysteem om gen regulerende netwerken met behulp van grootschalige genomische analyse door diepe RNA sequencing en chromatide Immunoprecipitatie-sequencing (ChIP-seq) 5,35 verkennen. Er zijn uitstekende RNAseq en Chip-Seq referentie datasets die vroege embryonale ontwikkeling. Eén van de ChIP-seq analyse nadelen is de noodzaak om grote hoeveelheid materiaal te verzamelen. Programmering van AC explantaten maakt produktie van grote hoeveelheden van een bepaald neuraal weefsel, en ten minste gedeeltelijk, helpt deze technische limiet te overwinnen.
De ontwikkelingsprogramma's onderliggende neurale buis orgelogenesis grotendeels behouden, vooral bij vertebraten. Informatie verkregen met behulp van amfibieën helpt bij het begrijpen van de cellulaire en moleculaire processen die ten grondslag liggen gewervelde ontwikkeling 25,32,36-38. Recente vooruitgang op het gebied van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) heeft opengesteld gateways voor het onderzoek in de regeneratieve geneeskunde en drug discovery. iPSCs worden geprogrammeerd somatische cellen met een combinatie van transcriptiefactoren. De zoektocht van de programmering signalen voor stamcellen is aan de gang. De assays beschrijven hier te betekenen voor-afgeleide neurale celtypes in vitro die kunnen worden gebruikt in drug screenen. Zij bieden ook een goedkope en snelle manier om te testen op neurale lot determinanten die kunnen worden gebruikt voor verdere herprogrammering van iPSCs 39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
