Introduction
Wirbelnervensystem geht aus dem neuronalen Platte als homogene Schicht von Neuroepithelzellen. Zu verstehen, wie Entwicklungsprogramme werden induziert, codiert, und gründete während Regionalisierung der Neuralplatte ist gegenwärtig eines der Hauptziele in der Entwicklungsbiologie. Im Vergleich zu anderen Systemen ist die experimentell zugänglich Xenopus Embryo ein Modell der Wahl für die Analyse von frühen Schritte der neuralen Entwicklung 1,2. Es ist leicht, eine große Zahl von Embryonen zu erhalten, und externe Entwicklung ermöglicht den Zugang zu den ersten Schritten der Neurulation 3. Viele Werkzeuge zur Verfügung, um experimentell zu manipulieren Xenopus laevis (X. laevis) Embryonalentwicklung. Mikroinjektion von mRNAs oder Morpholinos (MO), einschließlich der induzierbaren MOs zusammen mit biochemischen und pharmakologischen Werkzeugen ermöglicht kontrollierte gain of function (GOF) und Funktionsverlust (LOF) und spezifische Änderung der Signalwege 4,5. Der blastocoel Dach Ektoderm, um das Tier Pol einer Blastula oder einem sehr frühen Gastrula Embryo entfernt und bezeichnet als "animal cap" (AC), eine Quelle von pluripotenten Zellen, die durch Manipulation der Genexpression vor programmiert werden kann, Explantaten Vorbereitung. In diesem Manuskript sind ausführliche Protokolle zu verwenden X. laevis AC Explantaten in vitro und in vivo molekularen und zellulären Prozesse zugrunde liegenden neuralen Entwicklung zu testen.
Es wird eine Technik vorgestellt, wobei eine feine Beobachtung von Genexpressionsmustern in einer Xenopus Kaulquappe Neuralrohr, einen vorläufigen Schritt bei der Identifizierung von Schicksal Bestimmung Cues. Während die Beobachtung der Flachgewebe angebracht wird allgemein bei der Untersuchung von Hühnerembryonen 6 verwendet wird, ist nicht korrekt in Xenopus beschrieben. Manipulation der Genexpression durch Einspritzen von Kunst mRNA oder MO in die Blastomeren von 2 oder 4 Zellen Embryonen ermöglicht die Programmierung ACExplantaten 4. B. Inhibierung des Bone Morphogenetic Protein (BMP) Weg durch die Expression des anti-BMP Faktor Noggin, gibt ein neuronales Identität AC Zellen 3. Das Protokoll wird zum Ausführen von lokalen und zeitgesteuerte Belichtung AC Explantate auf extrinsische Cues durch direkten Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz Wulst beschrieben. Schließlich wird eine Technik zur Prüfung von Entwicklungs Merkmale der neuralen Vorläuferzellen in vivo durch Transplantation von gemischten Explantaten aus verschiedenen programmierten Zellen dissoziiert und Wieder assoziiert beschrieben hergestellt.
Der Frosch Embryo ist ein leistungsfähiges Modell zu frühen Wirbeltiere neuralen Entwicklung zu studieren. Die Kombination Manipulation der Genexpression in vitro-Kulturen Explantation liefert wichtige Informationen in der Studie von Neuroepithel Regionalisierung, Proliferation und Morphogenese 7-12. Die Programmierung der AC Explantate gestattet Entwicklung eines funktionellen Herz ex vivo 13,14. Die VerwendungExplantatmedium Pfropfen 15 führte zur Identifizierung des minimalen Transkriptionsschalter Induzieren der Neuralleiste Differenzierungsprogramms 16. Die Zona limitans intrathalamica (ZLI) ist ein Signalisierungszentrum, das Sonic Hedgehog (Shh), um das Wachstum und die Regionalisierung der Schwanzvorderhirn steuern absondert. Wenn kontinuierlich auf Shh ausgesetzt Neuroepithelzellen Koexpression der drei Genen für Transkriptionsfaktoren - Barh artigen homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) und Iroquois-3 (irx3) - zu erwerben zwei Eigenschaften der ZLI Fach: die Kompetenz, shh auszudrücken, und die Fähigkeit, von anterior Neuralplatte Zellen zu trennen. Als Modellsystem wird die Induktion einer ZLI Schicksal in Neuroepithelzellen präsentiert 8 werden.
Diese Protokolle zielen darauf ab, einfach, billig und effiziente Werkzeuge für die Entwicklungsbiologen und andere Forscher, die fundamentale mec erkundenhanisms von Schlüssel neuronalen Zell Verhaltensweisen. Diese Protokolle sind sehr vielseitig und ermöglichen die Untersuchung einer großen Palette von extrinsischen und intrinsischen neuronalen Bestimmung Cues. Es ermöglicht langfristig in vivo Analyse neuronaler Abstammung Engagement, induktive Wechselwirkungen und Zell Verhaltensweisen.
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Protocol
Experimente mit nationalen und europäischen Verordnung über den Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke und mit international etablierten Prinzipien der Vermeidung, Verminderung und Verbesserung verwendet, entsprechen.
1. Flach Montage von Xenopus laevis Kaulquappen Anterior Neuralrohr Nach Whole-mount in situ Hybridisierung
- Erhalten X. laevis Embryonen nach Standardverfahren 4 und älter werden, bis sie Neurulastadium 26 und älter (nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungstabelle 17 zu erreichen.
- Fix X. laevis Kaulquappen durch Inkubation in einer Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA). Rock, drehen und die Embryonen in eine 2 ml-Glasampulle werden 1 bis 1,5 h bei RT Stufe 26 bis 38 Embryonen, 2 h bei RT für Embryos in einem späteren Stadium der Bühne.
ACHTUNG: PFA ist durch Kontakt und möglicherweise krebs giftig. Es sollte unter einer Haube manipuliert werden.
HINWEIS: One X. laevis Brutüblicherweise in einem 2 ml-Glasampulle fest, aber eine größere Glasfläschchen verwendet werden können. - Die Embryonen in der gleichen Ampulle mit 1x PBS mit 0,1% Tween (PBT), 3 min bei RT waschen, zweimal.
HINWEIS: Sofern nicht anders angeben PBS verwendet wird, ist mit oder ohne Kalzium und Magnesium. - Dehydratisieren die Embryos in 100% Methanol (MeOH) für mindestens 12 Stunden bei Raumtemperatur in der gleichen Ampulle. Ändern Sie den MeOH 100% mindestens zweimal unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette.
HINWEIS: Die MeOH leicht gelb gefärbt, wie Lipide darin gelöst. VORSICHT Das MeOH ist beim Einatmen giftig und sollte unter einer Haube manipuliert werden. - Rehydrieren die Embryonen mit der gleichen Ampulle durch eine abgestufte Reihe von MeOH Bäder: MeOH 75% in PBS, MeOH 50% in PBS, MeOH 25% in PBS, PBS zweimal, jedes Bad 5-10 min bei RT. Die MeOH-Lösungen werden unter der Haube mit einem Kunststoff-Mikropipette geändert.
- Mit einem Kunststoff-Pipette der Embryo in einem 60 mm-Petrischale an die Spitze mit PBT gefüllten seziert werden. Mit Hilfe von zwei feinen Pinzette Pflegedie Augen, indem Sie einen feinen Pinzette zwischen den Augen und dem Neuralrohr, auf der Ebene der Optik Stiel vollständig entfernen. Lösen Sie die Augen aus dem Neuralrohr. Vorsichtig einführen die Zange unter dem Ektoderm über dem Neuralrohr. Mit Sorgfalt, ziehen Sie die Ektoderm ab hinter dem Kopf und entsorgen Sie sie.
- Führen Sie ein Doppel- oder Einzel ISH unter Verwendung von Digoxigenin-markierten oder Fluorescein-markierten Sonden, wie oben beschrieben 18,19.
- Nachdem der ISH Übertragung der Embryonen in einem neuen 60 mm Petrischale an die Spitze mit PBT mit einer Plastikpipette gefüllt.
- Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen das Neuralrohr vom Rest des Embryos. In diesem Stadium löst sich die vordere Neuralrohr von posterior Neuralrohr. Vorsichtig lösen übrigen Teile des Ektoderms über dem Neuralrohr, Chorda, die lose unter dem Neuralrohr oticum Vesikeln und übrigen Teile des Mesoderms befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass das Neuralrohr ist frei von irgendwelchen Anlagenauf dieser Stufe.
HINWEIS: Um eine Beschädigung des Neuralrohrs zu vermeiden führen alle Neuralrohr / Embryotransfer mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette bei Bedarf mit einer Spitze Schnitt an seinem Ende. Der Durchmesser des Spitzenendes an die Größe des Neuralrohrs eingestellt. - Übertragen Sie die seziert Neuralrohr (siehe Hinweis Schritt 1.9) in einem 1,5-ml-Röhrchen mit 50% Glycerin in PBS gefüllt. Warten, bis die Neuralrohren haben zur Unterseite der Glycerinlösung gefallen ist, in der Regel O / N bei 4 ° C.
- Entfernen Sie die Lösung von 50% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000 und fügen Sie in der gleichen 1,5-ml-Röhrchen mit einer Lösung von 90% Glycerin / PBS mit einer Mikropipette P1000. Warten Sie, bis die neuronalen Rohre an der Unterseite der 90% Glycerin / PBS-Lösung fallen, in der Regel O / N bei 4 ° C.
Hinweis: für die langfristige Lagerung, verwenden 90% Glycerin / PBS plus Antibiotika, um bakterielle Entwicklung zu verhindern. - Übertragen Sie die neuronale Rohre auf einer Glasplatte oder einem Objektträger mit einer Kunststofftransferpipette.
- DisSekte die neuronalen Rohre entlang der dorsalen und ventralen Mittellinien mit Wolfram-Nadeln. Während dieser Stufe werden die neuronalen Röhrchen werden in 90% Glycerin / PBS aufbewahrt.
- Montieren Sie die beiden Seiten des Neuralrohrs in 90% Glycerin / PBS mit Verstärkungsringen mit einem Deckglas bedeckt.
- Befestigen Sie die Deckgläser mit Lack und halten bei 4 ° C.
2. Tier Kappe Explantate Induction Mit Anionenaustauschharzkügelchen
- Übertragen Sie 100 ul Anionenaustauschharzkügelchen in ein 2-ml-Röhrchen mit einer Mikropipette P1000. Mindestens fünf Mal mit sterilem destilliertem Wasser Waschen der Kügelchen. Lassen Sie die Perlen am Boden des Röhrchens sedimentieren und ersetzen Sie die sterilem destilliertem Wasser mit einer Mikropipette P1000. Berühren Sie nicht die Perlen.
- Ließ die Perlen tränken O / N in einem 2 ml-Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser mit Rinderserumalbumin (BSA) (10 mg / ml) bei 4 ° C gefüllt.
- Zwei Stunden vor dem Sammeln des ACs, statt die Hälfte der Perlen in ein neues 1,5 mlRohr mit einer Mikropipette P1000. Ersetzen den sterilem destilliertem Wasser mit 500 & mgr; l des Mediums, enthaltend das Molekül in seiner induktive Potential getestet werden oder bekanntermaßen eine spezifische Schicksal induzieren. Zu halten, die andere Hälfte der Perlen, wie sie als negative Kontrolle verwendet werden.
- Die Perlen Inkubieren bei 4 ° C für mindestens 2 Std.
- Führen Sie alle nachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop und führen alle AC Transfer mit einer Mikropipette.
- Bringen Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA mit einem Kunststofftransferpipette ergänzt.
HINWEIS: Die Embryonen entwickeln bei 12 ° C Reichweite Blastula und Gastrula Stufen in 20 bis 24 Stunden. - Entfernen des Embryos Dotterhaut mit einer Pinzette, wie zuvor beschrieben 20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Hält die Membran langsam abziehen den Embryo. Führen Sie dieses Verfahren auf dem ventrale (pflanzlichen) Seite des Embryos. Den Tier Seite des Embryos nicht beschädigen.
- Isolieren kleiner ACs, wie zuvor beschrieben 21. Das Tier Pol pigmentierte Teil des Embryos. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur die Ektodermzellen. Sicherzustellen, dass das Gewebe von gleichförmiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse.
- Platzieren Sie jede AC in einer Terasaki Multiwell-Platten in 0,5x Geändert Barths Saline (MBS) 4. Setzen Sie den AC in den Brunnen mit pigmentierten Tierseite nach unten in Kontakt mit der runden Boden des Bohrlochs.
HINWEIS: Beschichtungs Pipetten mit einer 0,1% BSA-Lösung verhindert das Anhaften von kleinen Stücken von Klebstoff mit dem Kunststoffgewebe. - Setzen Sie einen Wulst an jeder Kappe mit einer Mikropipette P20. Verwenden Sie bei Bedarf Pinzette vorsichtig die Perle in der Mitte der Kappe.
HINWEIS: Wenn in einem konditionierten Medium getränkt werden die Perlen in rosa gefärbt. Wählen Sie die meisten Colored Perlen. - Inkubieren bei RT (18-22 ° C) für 6 Stunden ohne Bewegung der Terasaki Multiwellplatte. Der Wulst hält sich an die AC in weniger als 2 Stunden.
- Legen Sie das Terasaki Multiwellplatte auf der Oberseite der Papiere in Wasser eingeweicht. Die Platte mit einem Kunststoffbehälter.
HINWEIS: Diese "feuchte Kammer" verhindert ein vorzeitiges Verdampfen der Brunnen. - Kultur der ACS in 0,5x MBS oder 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1) in der feuchten Kammer bei 15-20 ° C, bis die Geschwister-Embryonen die richtige Bühne, um die Wirkung Ihrer Faktor testen erreicht.
- Befestigen Sie den ACs für 1 Stunde in frisch zubereiteten 4% PFA. Entwässern des ACS in 100% Methanol, wie zuvor beschrieben (Schritt 1.4).
3. Tier Cap Zelldissoziation und Reaggregation vor dem Pfropfen in einer Xenopus laevis Neurula
- Mantel-Petrischalen (60 mm) oder 12 Loch-Platten mit 3% Agarose in sterilem Wasser oder in PBS ohne Calcium und Magnesium. Fügen Sie genug, um die Agarose b abdeckenottom der Petrischale oder den Brunnen. Pre-erwärmen Sie die Platten bei Raumtemperatur (18-22 ° C). Optional gespeichert die Platten für zwei Tage bei 4 ° C, um Austrocknung zu verhindern.
- Vorbereitung calciumfreien HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) und HOLTFRETER der Kochsalzlösung (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) 5. HINWEIS: die Lösung von CaCl 2 kann nicht autoklaviert werden.
- Füllen Sie die Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung.
- Vorbereitung Blastula oder sehr frühen Gastrula Embryonen ihre ACs isolieren, wie zuvor beschrieben (Schritte 2,5 bis 2,7).
- Isolieren mindestens 15 oder bis zu 30, kleine ACs 21. Verwenden feinen Pinzette schneiden Sie ein kleines Quadrat von Gewebe aus der Tiermast. Die AC-Gewebe enthält nur ektodermale Zellen und ist daher gleichmäßiger Dicke. Wenn nicht, entfernen Sie den AC aus der Analyse.
HINWEIS: Das Tier Pol ist der Embryo Die pigmentierte Teil. - Übertragen Sie die ACs in einem Agarose-beschichteten auch an die Spitze mit Calcium-freien Holtfreter die Kochsalzlösung gefüllt. Legen Sie die ACs mit pigmentierten Seite nach oben.
HINWEIS: Die Dissoziation Prozess startet schnell in calciumfreien Holtfreter die Kochsalzlösung. - Warten Sie ein paar Minuten für die Zellen zu starten distanziert. Beachten Sie dies durch Disaggregation der Gewebe. Verwenden feinen Pinzette, trennen Sie die pigmentierte Schicht von dem Rest des AC und entsorgen Sie sie mit einer Mikropipette P20. Vollständige Zelle Dissoziation angibt Trennung von Zellen voneinander.
HINWEIS: Ein oder zwei pigmentierte Schichten können innerhalb der Rück aggregiert Explantat gelassen werden, um die Visualisierung während der Pfropfung zu helfen. - Zentrieren Sie die Zellen mit kreisenden Bewegungen der Platte. Mit einer Mikropipette P1000 vorsichtig so viel Medium wie möglich. Achten Sie darauf, um die Zellen zu berühren.
- 1 ml HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium zu der Bohrung. Übertragen Sie die distanzierte ACsin ein 1,5-ml-Röhrchen.
HINWEIS: 2-ml-Röhrchen kann nicht aufgrund ihrer Rund verwendet werden. - Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation 5 Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 2.000 rpm für eine Tischzentrifuge (500 xg). Entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit einer Mikropipette P1000.
- Zu den dissoziierten Zellen 20 ul HOLTFRETER die Salzlösung mit Calcium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (Sigma A-7888, pH 7,6) 5.
- Halten des dissoziierten ACs, 3-6 Stunden bei Raumtemperatur (18-22 ° C).
Anmerkung: Dies ist notwendig, Zeit für die Zellen neu zu aggregieren. Die erneute Aggregation sichtbar ist, wenn die Zellen zu bilden, eine kleine Kugel an der Unterseite des Rohres. - Nehmen Sie das Explantat vorsichtig aus dem Boden des Röhrchens durch Zugabe von 1 ml 0,5x MBS oder von 1 ml 3/4 NAM (siehe Schritt 4.1). Übertragen Sie die Explantation in einer un-beschichtete Platte mit einem Kunststofftransferpipette.
- Stufe werden die Explantate mit ihren Steuer Geschwister. Für Langzeitkultur Einsatz von Antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml).
4. Pfropfen von Tier Caps Explantate in der Neuralplatte von X. laevis Embryo
- Vorbereitung 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 0,2 × PBS, 50 ug / ml Gentamycin). Nicht länger als 1 Woche zu halten für die Präparation und bei 4 ° C. Älteren NAM können zur Herstellung von Agarose-beschichteten Präparation Schalen (unten) verwendet werden.
- Coat Petrischalen (60 mm) mit 3% Agarose in 3/4 NAM, in die kleinen Löcher wurden entweder mit einer Silikonform, oder die Abdeckung eines Tischtennisschläger gemacht.
HINWEIS: Die Agarose den Boden der Petrischale bedeckt. Lassen Sie etwas Platz, so dass die Petrischale mit 3/4 NAM zu füllen. Alternativ machen Dissektion Gerichte mit nicht-trocknende Knetmasse. Innerhalb der Ton, drücken Sie die Embryonen leicht während der Präparation Verfahren. Graben kleine Löcher in derAgarose mit abgerundeten Pinzette dieser "Dissektion Gericht 'hilft, um die Embryonen während der Präparation Verfahren zu halten. - Sammeln Dissektion Werkzeuge: Kunststofftransferpipetten, ein "Augenbraue-Messer '22, zwei feinen Sezierung einer Pinzette, P1000 Mikropipette und Tipps, einem stereosmicroscope mit Vergrößerungs 8-40X (mit Augenbrauen Haare in Paraffin an der Spitze einer Glaspasteurpipette eingebettet ist), eine helle Lichtquelle mit Lichtwellenleiterführungen. Halten Sie alle Sezieren Werkzeuge sauber; Nach jedem Versuch, spülen Sie sie zweimal mit destilliertem Wasser, einmal mit 100% Ethanol und trocknen lassen. Lager weg von Staub und ggf. Autoklaven Metall Sezieren Werkzeuge.
- Lassen Sie das dissoziiert und erneut aggregiert ACs (Protokoll 3) und ihre Geschwister X. laevis Embryonen entwickeln, bis sie Stufe 13 (Neurula) erreichen nach Nieuwkoop und Faber Entwicklungstabelle 17. Für die Transplantation in der Neuralplatte Stufe 13 bis 15 Embryonen der Bühne verwendet.
- Führen Sie allenachfolgenden Schritte unter dem Stereomikroskop.
- Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen in PBS mit Calcium und Magnesium mit 0,2% BSA ergänzt. Entfernen des Embryos Dotterhaut, wie zuvor beschrieben 20. Befestigen Sie den Embryo mit einer Pinzette. Klemmen die Dotterhaut mit der Seite der anderen Zange. Halten der Membran fest, langsam abziehen den Embryo.
HINWEIS: Führen Sie diese Prozedur auf der ventralen (pflanzlichen) Seite des Embryos. Die Embryonen nicht beschädigen Neuralplatte. Wenn Embryonen während der Dotterhaut Entfernungsschritt beschädigt wurde, übertragen Sie die Embryonen in eine 60 mm Petrischale mit 3/4 NAM mit einem Kunststofftransferpipette und warten Sie 15 Minuten, eine ausreichende Zeit für die Heilung eintritt. - Füllen Sie das Sezieren Gericht an die Spitze mit frischen 3/4 NAM.
- Mit einem Kunststofftransferpipette, übertragen Sie die Embryonen ohne ihre Dotterhaut in das Sezieren Gericht. Legen Sie die Embryonen Rückenseite nach oben indie Brunnen. Während der Übertragung nicht zulassen, dass der Embryo, in Kontakt mit der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, da X. geben laevis durch Oberflächenspannung lysiert.
- Übertragen Sie die AC Explantat in das Sezierung Platte mit einem Kunststofftransferpipette oder einer Mikropipette P1000 gepfropft werden. Nachdem die Pipette innerhalb der Flüssigkeit, damit die Explantate langsam sinken durch Schwerkraft, oder drücken Sie ganz sanft.
- Pflegen Sie die Embryonen mit abgerundeten Pinzette. Mit der Augenbraue Messer einen Einschnitt in das neuronale Platte, wo Sie beabsichtigen, Ihre Explantat piece pfropfen.
HINWEIS: In der Stufe 14 die vordere Biegung der Neuralplatte kann Gebrauch als ein Wahrzeichen sein, das Zwischenhirn Gebiet (Abbildung 4) markiert. - Schneiden Sie ein kleines Stück Neuroepithel, mit abgerundeten Pinzette und eine Augenbraue Messer. Schneiden Sie ein kleines Stück von dem Explantat mit der Augenbraue Messer.
HINWEIS: Das Stück Explantation sollte etwa die gleiche Größe und Form wie die Neuroepithel abgetragenen Bereich sein. Legen Sie das Stück Explantat in die Neuroepithel Einschnitt mit der Augenbraue Messer und feinen Pinzette. Stellen Sie sicher, dass die Explantation schnell wird an der Embryo. - Alternativ legen Sie ein Stück Deckglas auf die aufgepfropften Embryo, um das Transplantat an Ort und Stelle zu halten. Um dies zu tun, machen eine gute Deckglas in sehr kleine Stücke mit grobem Pinzette. Sicherzustellen, dass die Größe etwa 1,5 mm 2. Tauchen Sie die Stücke in eine Petrischale mit 3/4 NAM oder PBS mit einer Pinzette. Wählen Sie ein Stück Glas größer als der Embryo um Beschädigungen zu vermeiden. Der Embryo wird ein wenig abgeflacht.
- Warten Sie mindestens 30 Minuten ohne Bewegung oder nur die Sektionsplatte bewegen sanft. Lassen Sie den Embryo zu erholen für 30 Minuten bis 2 Stunden und entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, wenn nötig. Die gepfropft Embryonen vorsichtig Pipette in ein sauberes Geschirr mit 3/4 NAM gefüllt ist, mit Hilfe der Kunststofftransferpipette.
HINWEIS: Gepfropfte Embryonen neigen dazu, Bakterien oder Pilze Kontamination zu entwickeln. Für langfristige culture verwenden Antibiotika: Kanamycin (50 ug / ml), Ampicillin (50 ug / ml) und Gentamycin (50 ug / ml).
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Representative Results
Basis morphologischer Überlegungen in verschiedenen Arten, embryo Manipulationen und des Expressionsmusters von regulatorischen Genen, hält einem konzeptionellen Modell, daß das neuronale Platte in Längs- und Quersegmente, die einen Entwicklungsgittererzeugungs deutliche histogenic Felder definieren unterteilt. In der Neuralplatte, die Anlagen der Vorderhirn, Mittelhirn, Hinterhirn und Rückenmark sind alle bereits entlang der anteroposterioren (AP) Achse während der Gastrulation (in 23-25 prüft) etabliert. Während neurulation können die histogenic Felder räumlich begrenzte Bereiche der Genexpression festgestellt werden. Bezogen auf die Expressionsmuster der regulatorischen Gene wird das Vorderhirn primordium in sechs Segmenten, die unterschiedliche Quer histogenic Felder genannt prosomeres (p) zu erzeugen, unterteilt. Jedes prosomere in einen ventralen (basal) und einer dorsalen (Alar) Teil (Bewertet in 26,27) unterteilt. In Amphibien, die prosomere 2(p2) gibt Anlass zu der Epithalamus und Thalamus und seine Veranstalter der Z ona L imitans Ich ntrathalamica (ZLI) 8 (in 28,29 überprüft).
Auf Abbildung 1 sind die Flach Montage X gezeigt laevis und X. tropicalis vorderen Neuralrohren in den Stufen 30, 32 und 35 nach der WM-Schüssel. WM-ISH wurden gemäß Vorschrift 1 unter Verwendung von Sonden für die Transkriptionsfaktoren fezf2 dass kennzeichnet das Telencephalon und p3, barhl2, die p2, die kortikale Säumen und das Mittelhirn, Irokesen-1 (irx1) und Iroquois-3 (irx3) markiert durchgeführt, die jeweils Zeichen Schwanz p2 und Flügel p2 und für das Morphogen shh, die die ZLI, die basalen Vorderhirn und Mittelhirn (1E) markiert. Eine vergleichende Analyse der verschiedenen Genexpressionsmustern zeigt, daß die vordere Grenz von barhl2 p2 Ausdruck stößt an die Schwanzgrenze fezf2 Expression in p3 (1A). Irx3 koexprimiert wird mit shh in Zukunft ZLI (1B). Innen p2 irx1 Expressionsdomäne ist komplementär zu der shh (1C) 8. Das Expressionsmuster von barhl2 in X. tropicalis bei Stufe 35 ist in 1D gezeigt. Eine schematische Darstellung der Expressions Gebiete dieser Gene in der Entwicklungsamphibienvorderhirn in 1E vorgesehen.
Verwendung von Protokoll 2 Die Fähigkeit von Anionenaustauschharzkügelchen in Shh getränkt shh-Expression wurde in ACs Explantate sucht induzieren. X. laevis Embryonen wurden in die 4 Tier Blastomeren an den 4- und 8-Zellen mit mRNAs für den vorderen neuroepithelial Induktor Noggin mit barhl2 injiziert Stufe otx2, irx3 und GFP als Injektion Tracer. Die Expression des anti-BMP Faktor Noggin hemmt die BMP-Weg und gibt ein neuronales Identität AC Zellen 3. Wir verweisen auf AC ausdrücken Noggin als Anteriorised Tier Cap (AAC). Blastocoel Dach Explantate wurden wie in Protokoll in Kontakt mit einem Anionenaustauscherharz Wulst in einem konditionierten Medium (CM) getränkt beschriebenen 2. Die AACs wurden für 48 Stunden kultiviert bei 18 ° C enthält, oder nicht, das sezernierte N-terminalen Teil von das Morphogen Sonic Hedgehog aus Ratten (N-Shh). Die Expression von endogenen Shh wurde durch ISH (Figur 2) untersucht. Expression von Xenopus shh (Xshh) in Zellen, die in Kontakt mit dem Wulst in cm mit N-Shh nicht aber in Zellen, die in Kontakt mit dem Wulst in CM ohne N-Shh (2B) getränkt getränkt detektiert.
Verwendung von Protokoll 3 Die Fähigkeit von verschiedenen Zelltypen, von einem anoth segregierener untersucht. X. laevis Embryonen wurden in die 4 Tier Blastomeren in den 4 und 8-Zellen injiziert Bühne mit mRNAs für noggin mit oder ohne OTX2, barhl2 und irx3, wie angedeutet, unter Verwendung von ßGal oder GFP als Tracer (3A). Stufe 8/9 ACs wurden dissoziiert und erneut aggregiert, um Explantate von gemischten Neuroepithelzellen die sowohl ßGal- und GFP-exprimierenden Zellen zusammengesetzt zu generieren. Die neu zusammengefügt Explantate wurden kultiviert für 48 Stunden bei 18 ° C. ßGal Aktivität wurde in rot nach Anspruch 30 (3A) offenbart. Das Verhalten der Zellen wurde nach der Lokalisation im Wieder aggregiert Explantaten beobachtet. In Explantaten, wo AACs Zellen mit AACs Zellen Otx2 (rot) exprimieren vermischt, werden die ßGal-exprimierenden Zellen, die nicht von den GFP-exprimierenden Zellen zu trennen, beide Arten von Zellen frei vermischt (3B, 3C). Im Gegensatz dazu inExplantate wo Otx2-exprimierenden Zellen (GFP) sind mit Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) exprimierenden Zellen (ßGal) gemischt, die ßGal-exprimierenden Zellen (rot) bilden zusammenhängende Patches und nicht gleichmäßig verteilt innerhalb des Wieder aggregiert Explantation ( Figur 3D, 3E).
Verwendung des Protokolls 4, wurde das Verhalten der programmierten AC-Zellen in vivo untersucht. X. laevis Embryonen wurden in die 4 Tier Blastomeren an den 4- und 8-Zellstadien mit mRNAs Noggin mit OTX2 entweder allein oder zusammen mit barhl2 und irx3 injiziert. ßGal wurde als Tracer verwendet. Parallel wurden die Embryos auf ähnliche Weise mit mRNAs für Noggin und das sekretierte N-terminalen Teil des Morphogen shh aus Ratten (N-shh) injiziert. In der Stufe 8/9, wurden AC Explantate dissoziiert und sofort wieder aggregiert, um gemischte Explantate von neuroepit zusammen generierenhelial Zellen exprimieren entweder N-Shh und Otx2 oder ausdrücken N-Shh und Otx2, Barhl2 und Irx3 (BOI3). Kleine Stücke der gemischten Explantate wurden in die Neuralplatte des X. gepfropft laevis Embryonen im Stadium 14. Die transplantierten Zellen wurden mit ßGal Färbung (rot) markiert. In der Stufe 35 wird die Expression von endogenen Shh wurde durch ISH analysiert. Wenn in die vordere Neuralplatte des X. gepfropft laevis Embryonen, gemischte Explantate von BOI3 und N-Shh-exprimierenden Zellen zusammengesetzt entwickelt zwei Merkmale der spezifischen ZLI-Zellen: die veredelten Zellen exprimiert Xshh und getrennt vom vorderen Neuroepithelzellen (3C). Im Gegensatz dazu, wenn sie gemischt Explantaten Otx2 besteht - und N-Shh- exprimierenden Zellen werden in der X. gepfropften laevis Neuralplatte haben die transplantierten Zellen nicht ausdrücken shh und nicht von ihren Nachbarn (3B) 8 zu trennen.
Abbildung 1. Flach montiert neuronalen Rohre von X. laevis und X. tropicalis Embryonen ganze-mount Doppel ISH (A - D). WM-ISH unter Verwendung durchgeführt fezf2, barhl2, irx1, irx3 und shh als Sonden auf (A - C) X. laevis Embryonen in den Stufen 30, 32 und 35 und (D) X. tropicalis Embryo im Stadium 35, wie angegeben. Die neuronalen Rohre repräsentativer Embryonen werden seziert und flach montiert, wie in Protokoll 1 beschrieben präpariert neuronalen Rohre werden aus einer Seitenansicht, Rücken up, vorderen linken Seite gezeigt. Die Markierungen und Stufen sind angegeben. Rostralen und kaudalen Grenzen p2 sind mit Pfeilen angegeben. (AC) Der Maßstab steht für 0,5 mm. (D) Die sCale-Bar steht für 0,1 mm. . (E) Schematische Darstellung des Vorderhirns Marker an st.30 barhl2 Ausdruck Domäne in schraffierten Linien dargestellt; Ausdrucksbereiche werden für fezf2 (pink), shh (rot), irx3 (gelb) und irx1 (grün) angezeigt. p steht für prosomere. Die Zirbeldrüse oben auf p2 befindet angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Induktion der shh-Expression in programmiert Explantate durch Kontakt mit Anionenaustauschharzkügelchen. Kleine ACs von Embryonen mit mRNA-Codierung für Noggin barhl2, OTX2 und irx3 als Tracer injiziert, mit GFP hergestellt. AAC steht foder Anteriorised Tier Cap. Die AAC Explantate exprimieren Barhl2, Otx2 und Irx3 (AAC BOI3) werden 48 h in Kontakt mit einer Sicke in einem konditionierten Medium getränkt (CM) entweder mit N-Shh, oder nicht, wie angegeben kultiviert. Die Explantate von ISH zur Expression von Xenopus (X) shh analysiert. Der Maßstab steht für 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Die Analyse der Zellsegregationsverhalten bei der Wieder aggregiert Explantate. (A) X. laevis Embryonen werden mit mRNA-Codierung für noggin, OTX2, barhl2 und irx3 injiziert, wie angegeben. ßGal und GFP als Tracer verwendet. In der Stufe 8/9 kleine ACs werden vorbereitet , Gespalten und neu aggregiert, um Explantate von GFP / ßGal gemischten Zelltypen zu erzeugen. Die Explantate werden für 48 Stunden bei 18 ° C kultiviert und ßGal Aktivität zeigte (rot). (B - E) Vertreter Explantate von gemischten Zellen, die Proteine wie angegeben gezeigt zusammengesetzt. AAC steht für Anteriorised Tier Cap. (B, C) zu verbreiten ACs Zellen, die Noggin und Otx2 (ßGal) nach dem Zufallsprinzip, wenn mit ACS-Zellen, die Noggin (GFP) gemischt. (C) Vergrößerte Ansicht (B). (D) AACs Zellen, Barhl2, Otx2 und Irx3 (BOI3) (ßGal) zusammengefasst und getrennt von AACs Zellen, Otx2 (GFP). (E) Vergrößerte Ansicht (D). (B, D) Die Maßstabsleiste steht für 0,5 mm. (C, E) Der Maßstab steht für 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Programmierte Explantaten zeigen ihre Entwicklungsfunktionen, wenn sie in der Neuralplatte einer Stufe 14 Embryos gepfropft (A) Versuchsschema:. AACs von Embryonen mit mRNAs injiziert vorbereitet, wie angegeben. In der Stufe 8/9 Zellen aus dem Dach des blastocoel dissoziiert und wieder aggregiert Explantate von gemischten Zelltypen exprimieren ßGal (rot) erzielen zu können. Die Explantate werden kultiviert, bis ihre Geschwister erreicht Stufe 14 Ein kleines Stück gemischte Explantation (grünes Rechteck) wird in einen Einschnitt im vorderen neuralen Teller. Betrieben Embryonen gezüchtet, bis Stufe 35 betrieben Embryonen werden von WM-ISH analysiert mit X. laevis shh (Xshh) als Sonde. ßGal Aktivität in roten acc enthülltOrding bis 30. (B, C) Die gepfropften Seiten Stufe 35 Vertreter Neuralrohren angezeigt, Seitenansicht, Rücken up, vorderen linken Seite. (B) mit gemischten AACs ausdrücken Otx2 und N-Shh gepfropft. (C) mit gemischten AACs ausdrücken Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) und N-Shh gepfropft. Transplantierten Zellen sind mit einem roten Stern gekennzeichnet. Die rosa Stern zeigt den Interessenten Zwischenhirn. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Neuralen Entwicklung wird durch ein komplexes Wechselspiel zwischen zellulären Entwicklungsprogrammen und Signale von dem umgebenden Gewebe (Bewertet in 3,31,32) instrumentiert. Eine Reihe von Protokollen, die in X verwendet werden kann Hier beschreiben wir laevis Embryonen extrinsischen und intrinsischen Faktoren in neuronalen Schicksal Entschlossenheit und neuronalen Morphogenese in vitro und in vivo beteiligt zu erkunden. Diese Protokolle können als solche auf X verwendet werden tropicalis Embryonen jedoch X. tropicalis Embryonen viermal kleiner als X. laevis Embryonen. Sowohl die Zange und die Wolfram Nadeln Notwendigkeit feiner sein. Wenn möglich, verwenden Sie X. laevis.
Präzise Visualisierung von X. laevis und X. tropicalis neuronalen histogenic Felder können mit Hilfe der histologischen flache Montage seziert neuronalen Rohre von WM- ISH erreicht werden. Diese Technik wurde erfolgreich durchgeführt X. laevis Embryonen aus Stadium 26 bisStufe 45 (Figur 1) und X. tropicalis Embryonen aus Stufe 30 auf Stufe 45 8,33. Ältere Embryonen sind leichter zu dann jüngeren Embryonen zu sezieren. Dieses Verfahren ist einfach durchzuführen. Es ermöglicht die Analyse von Genexpressionsmustern, die separat oder kombiniert auf Neuralrohren in verschiedenen Entwicklungsstadien. Bei diesem Protokoll ist es leicht, eine Seite eines Neuralrohrs mit anderen zu vergleichen. Dies ist sehr nützlich in Xenopus GOF und LOF Experimenten. Die auf der Seite der injizierten Neuralrohrs beobachteten Fehler können direkt auf der Steuerseite beobachtet normalen Entwicklungsereignisse verglichen werden. Diese Strategie wurde verwendet, um GOF und LOF Phänotypen in X. analysieren laevis Embryonen 8,33. Ein wichtiger Schritt in diesem Protokoll ist die korrekte Fixierung der embryonalen Geweben. Eine unvollständige Fixierung verhindert die effiziente Ablösung des Ektoderms aus dem Neuralrohr. Die Pre-Dissektion des Neuralrohrs erleichtert das Eindringen in situ-Sonden. Jedoch einmal isoliert, ist es leicht, die neuronalen Rohre zu verlieren. Es empfiehlt sich, Teil des Embryos während der ISH Verfahren zu halten, um den Verlust zu verhindern.
Die für alle diese Experimente verwendet Embryonen müssen robust sein und müssen gut heilen. Entsorgen Sie alle Charge von ungesunden Embryonen. Um ACs und Graft Explantate zwischen Bühne 13 und Stufe 15 zu zerlegen ist es möglich, X. wachsen laevis Explantate und Embryonen bei verschiedenen Temperaturen (12-18 ° C und 18-20 ° C). Bemerkenswert X. laevis embryonalen Zellen enthalten genügend Eigelb, um ihr Überleben für mehrere Tage ohne Zugabe eines externen Nährstoff ermöglichen. Um die embryonalen Gewebe nicht beschädigt, keine Übertragungsverfahren des Embryos, AC oder Explantation muss sorgfältig durchgeführt werden. Es ist ratsam, entweder eine Kunststofftransferpipette oder Mikropipette bei Bedarf mit einer Spitze Schnitt an ihrem Ende zu verwenden. Der Durchmesser des Spitzenendes ist auf die Größe des Embryos oder der Größe Explantat eingestellt, zu übertragen sind.Es ist bemerkenswert, Beschichten Pipetten mit einer 0,1% BSA-Lösung verhindert das Anhaften von kleinen Stücken von Gewebe an dem Kunststoff.
AC Explantate können durch Zwangs Genexpression oder durch Einwirkung von äußeren Faktoren in einer zeit- und raumgesteuert programmiert werden. Wir beschreiben eine Technik, so dass lokale Induktion über den direkten Kontakt zwischen einem Explantat und einer Perle. Bei Bedarf können die Kügelchen weiter mit einer Pinzette fragmentiert. Im Vergleich zu anderen, zuvor beschriebenen Strategien Diese Technik ermöglicht die Prüfung von lokalen Induktion mit reinen Faktoren, allein oder in Kombination, in einer präzisen Zeitfensters.
Verwendung eines zuvor beschriebenen Ansatzes der Zell Dissoziation und Reassoziation 34, ist es möglich, die Zellbeweglichkeit Kapazitäten, Zelltrennung Verhaltensweisen und Bildung Kompartimentgrenzen in klemmt und gemischte AC Explantate 8 zu untersuchen. Die Zelle Dissoziation Prozess beginnt in weniger als 15 min. Shakin vermeideng die Platte während der Dissoziationsschritt, um den Verlust von Zellen zu vermeiden. Die AC pigmentierten Schichten nicht gut zu distanzieren. Es wird empfohlen, sie während der Dissoziationsstufe entfernen. Ein paar AC pigmentierte Schichten in der Wieder aggregiert Explantat gelassen. Es hilft bei der Visualisierung des Transplantats. Er reagiert nicht mit Analyse bei späteren Entwicklungsstadien stören.
In diesem Manuskript ein Protokoll zur gemischten Explantate Transplantation in ein neuronales Platte ist detailliert. In Xenopus-Embryonen ist die Neuralplatte zwischen Bühne 13 und Stufe 15 Diese Stadien sind daher zur Transplantation im Neuroepithel entsprechenden geöffnet. X. laevis Geweben Hafteigenschaften mit der Zeit ändern. Es ist wichtig zu AC Explantate in einen Wirt in einem ähnlichen Entwicklungsstadium zu pfropfen. Am frühen Entwicklungsstadien, X. laevis Embryonen in 3/4 NAM Reparatur extrem schnell gewachsen. Wenn einige Embryonen während der Entfernung des Dotterhaut beschädigt worden ist, kann es nützlich sein, 15 min warten,das ist die Zeit, die für den Heilungsprozess stattfindet. Insertion kann, indem man ein Stück Deckglas auf die gepfropften Wirtsgewebe begünstigt werden, aber es ist kein Erfordernis. Die durch den Heilungsprozess erzeugte Kraft kann die transplantierten Zellen zu extrudieren. Morphologie der Wirtsembryo ist besser erhalten, wenn das Transplantat in die sie mit externen Druck gezwungen wird, wie mit einem Deckglas. Um den Erfolg des Transplantats zu bewerten, kann ein fluoreszierender Tracer in den Explantaten injiziert werden. Das Vorhandensein von fluoreszierenden Zellen innerhalb des gepfropften Embryo kann visualisiert werden, bis das Neuralrohr schließt. Der Hauptnachteil in AC Kultur und Pfropfversuche ist die Frequenz von Bakterien oder Pilzen Verunreinigungen. Verwenden Sie saubere und sterile Material und sterile Lösungen so oft wie möglich, um dish Verunreinigung bei jedem Schritt des Protokolls zu vermeiden. Für eine Langzeitkultur von gepfropften Embryonen immer Antibiotika und einer Temperatur von 15 ° C. Vermeiden Sie langfristige Kontakt von AC Explantate und Embryonen mit Agarose. Wir Observed, dass sie die Lebenserwartung des Explantats zu verringern. Das Pfropfen Technik ist mächtig, aber zeitaufwendig. Es ist nicht ratsam, für das Schicksal Bestimmung Cues mit ihr Bildschirm, aber genug, um Daten auf Ihrem Gewebe der Wahl im Voraus zu erwerben.
Neben seiner traditionellen Vorteile, die jüngsten Fortschritte in der genetischen Xenopus öffnete den Weg für diese Modellsystem, um Genregulationsnetzwerken mit groß angelegten Genomanalyse durch tiefe RNA-Sequenzierung und Chromatide Immunoprecipitation-Sequenzierung (ChIP-seq) 5,35 erkunden. Es gibt ausgezeichnete RNAseq und Chip-Seq Referenzdatensätzen abdeckt frühen Embryonalentwicklung. Einer der Chip-seq Analyse Nachteile ist die Notwendigkeit, große Mengen an Material zu sammeln. Programmierung von AC Explantate erlaubt die Herstellung einer großen Menge eines spezifischen Nervengewebe, und zumindest teilweise, hilft, dieses technische Grenze zu überwinden.
Die Entwicklungsprogramme zugrunde liegenden Neuralrohr OrgelGenese weitgehend konserviert, vor allem bei Wirbeltieren. Informationen mit Amphibien erworbenen hilft beim Verständnis der zellulären und molekularen Prozesse der Wirbeltierentwicklung 25,32,36-38 zugrunde. Jüngste Fortschritte auf dem Gebiet der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) hat Gateways für die Forschung in der regenerativen Medizin und der Wirkstoffforschung eröffnet. iPSCs aus somatischen Zellen mit einer Kombination von Transkriptionsfaktoren programmiert. Die Suche der Programmierung Hinweise für Stammzellen ist noch nicht abgeschlossen. Die Assays beschreiben hier einen Mittelwert zu neuronalen abgeleiteten Zelltypen in vitro, die im Wirkstoff-Screening verwendet werden könnten, zu erzeugen. Sie bieten auch eine kostengünstige und schnelle Möglichkeit, für neuronalen Schicksal Determinanten, die für die weitere Neuprogrammierung der iPSCs 39,40 verwendet werden können, zu testen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
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