Introduction
מערכת העצבים של בעלי החוליות עולה מהצלחת העצבית כשכבת אחידה של תאי neuroepithelial. הבנה כיצד תוכניות התפתחותיות מושרות, מקודדות, והוקמו במהלך אזורית של הצלחת העצבית היא, כיום, מטרה עיקרית בביולוגיה התפתחותית. בהשוואה למערכות אחרות, עובר Xenopus ניסוי נוח הוא מודל של בחירה לניתוח שלבים מוקדמים של התפתחות עצבית 1,2. זה קל להשיג מספר גדול של עוברים, ופיתוח חיצוני נותן גישה לצעדים הראשונים של neurulation 3. כלים רבים זמינים כדי לתפעל באופן ניסיוני Xenopus laevis (laevis X.) התפתחות עוברית. מיקרו הזרקה של mRNAs או morpholinos (MO), כוללים שיטות פעולה מושרה, יחד עם כלים ביוכימיים ותרופתיים, מאפשר מבוקר רווח של פונקציה (GOF) ואובדן התפקוד (LOF) ושינוי ספציפי של מסלולי איתות 4,5. בלההאאקטודרם גג stocoel, הממוקם סביב קוטב החיה של blastula, או עובר gastrula בשלב מוקדם מאוד, ומכונה "בעלי החיים קאפ '(AC), הוא מקור לתאי pluripotent שניתן לתכנת על ידי מניפולציה של ביטוי גנים לפני explants הכנה. בכתב יד זה הם פרוטוקולים מפורטים לשימוש X. explants laevis AC לבדוק במבחנה ובמנגנונים מולקולריים vivo ותהליכים תאיים התפתחות עצבית בסיסית.
טכניקה מוצגת, המאפשרת תצפית יפה של דפוסי ביטוי גנים בצינור עצבי ראשן צפרדעים, צעד ראשוני בזיהוי רמזי נחישות גורל. בעוד התצפית של רקמות רכוב שטוחות נפוצה במחקר של עובר חומוס 6, זה לא תואר כראוי בצפרדעים. מניפולציה של ביטוי גנים על ידי הזרקת mRNA או MO סינטטיים ללסטומרים של 2 או 4 עובר שלב תא מאפשרת תכנות של ACexplants 4. לדוגמא עיכוב של מסלול חלבון העצם המוךפו"גנטי (BMP) על ידי ביטוי של אנטי-BMP גורם הבחור!, נותן זהות עצבית לתאי AC 3. הפרוטוקול מפורט לביצוע חשיפה מבוקר זמן ומקומי של explants AC לרמזים חיצוניים באמצעות מגע ישיר עם חרוז שרף אניוני. לבסוף טכניקה מתוארת לבדיקת תכונות ההתפתחותי של אבות עצביים in vivo על ידי השתלה של explants המעורב הוכן מהתאים נפרדים מתוכנת ניתקו וקשורים-מחדש.
עובר הצפרדע הוא מודל רב עוצמה כדי לחקור את ההתפתחות עצבית חוליות מוקדמות. שילוב מניפולציה של ביטוי גנים לexplant תרבויות במבחנה מספק מידע חשוב בחקר האזורי neuroepithelium, התפשטות, והמורפוגנזה 7-12. תכנות של explants AC מותר פיתוח של לב פונקציונלי vivo לשעבר 13,14. השימוששל explant השתלת 15 הובילו לזיהוי של בורר תעתיק המינימלי התרמה תכנית בידול הרכס העצבי 16. Limitans Zona intrathalamica (ZLI) הוא מרכז איתות שמפריש סוניק קיפוד (ששש) כדי לשלוט על הצמיחה ואזורית של המוח הקדמי הזנב. כאשר נחשפו ברציפות שלשש, תאי neuroepithelial coexpressing גני שלושה שעתוק גורם - כמו-barH homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) וIroquois-3 (irx3) - רכישת שני מאפיינים של תא ZLI: הסמכות ל להביע את ששש, ואת היכולת להפריד מתאי צלחת עצביים קדמי. כמערכת מודל, האינדוקציה של גורל ZLI לתאי neuroepithelial יוצג 8.
פרוטוקולים אלה מכוונים למתן וכלים פשוטים, זולים, יעילים לביולוגים התפתחותיים וחוקרים אחרים לחקור את MEC הבסיסיhanisms של התנהגויות תא עצביות מרכזיות. פרוטוקולים אלה הם מגוונים מאוד ומאפשרים החקירה של מגוון גדול של רמזי נחישות עצביים חיצוניים ופנימיים. זה מאפשר לטווח ארוך בניתוח vivo של מחויבות עצביות שושלת, אינטראקציות אינדוקטיביים והתנהגויות תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים לעמוד ברגולציה לאומית ואירופית על ההגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ועם עקרונות שנקבעו בעולם של החלפה, הפחתה ועידון.
1. שטוח הרכבה של Xenopus laevis Tube ראשנים קדמי העצבי לאחר Whole-Mount הכלאה באתר
- להשיג X. laevis עוברים על פי נהלים קבועים 4 וגילם עד שהם מגיעים neurula שלב 26 ומעלה (לפי טבלה התפתחותית Nieuwkoop ופאבר 17.
- X. תקן laevis ראשנים על ידי דוגריהם בפתרון של paraformaldehyde 4% (PFA). הרוק ולסובב את העוברים בבקבוקון זכוכית 2 מיליליטר, 1 עד 1.5 שעות ב RT לשלב 26 לביים 38 עוברים, שעת 2 ב RT עבור עוברים בשלבים מאוחר יותר.
זהירות: PFA הוא רעיל על ידי מגע ומסרטן חשוד. צריך לטפל זה מתחת למכסת מנוע.
הערה: X. אחת הגוזלים laevis הואבדרך כלל קבוע בבקבוקון זכוכית 2 מיליליטר אבל בקבוקון זכוכית גדול יותר ניתן להשתמש. - לשטוף את העוברים באותו הבקבוקון באמצעות 1x PBS עם 0.1% Tween (PBT), 3 דקות ב RT, פעמיים.
הערה: אם תציינו אחר PBS המשמש הוא עם או בלי סידן ומגנזיום. - מייבש את העוברים במתנול 100% (MeOH) לפחות 12 שעות בRT באותו הבקבוקון. לשנות את MeOH 100% לפחות פעמיים מתחת למכסת המנוע באמצעות micropipette פלסטיק.
הערה: MeOH הופך מעט צהוב כשומנים מומסים בזה. זהירות MeOH היא רעילה על ידי שאיפה וצריכה לטפל מתחת למכסת מנוע. - רעננות העוברים משתמשים באותו הבקבוקון דרך סדרה מדורגת של אמבטיות MeOH: 75% MeOH ב PBS, MeOH 50% ב- PBS, 25% MeOH ב PBS, PBS פעמיים, כל דקות האמבטיה 5-10 ב RT. פתרונות MeOH משתנים מתחת למכסת המנוע באמצעות micropipette פלסטיק.
- בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את העובר להיות גזור ב60 מ"מ צלחת פטרי המלא לראש עם PBT. שימוש בטיפול שני מלקחיים עדיניםלהסיר באופן מלא את העיניים על ידי החדרת מלקחיים עדינים אחד בין העיניים והצינור העצבי, ברמה של הגבעול האופטי. לנתק את העיניים מהצינור העצבי. להציג בזהירות את המלקחיים מתחת להאאקטודרם שמעל בצינור העצבי. עם טיפול, לקלף את האאקטודרם מתחיל מאחורי הראש וזורקים אותו.
- בצע ISH כפול או בודד באמצעות digoxigenin שכותרתו או בדיקות שכותרתו והעמסת כמו בעבר תיארו 18,19.
- לאחר ISH להעביר את העוברים בצלחת פטרי חדש 60 מ"מ המלא עד למעלה עם PBT בעזרת פיפטה פלסטיק.
- בעזרת מלקחיים בסדר לנתק בזהירות את הצינור העצבי משאר העובר. בשלב זה, בצינור העצבי הקדמי מפריד מהצינור העצבי האחורי. לנתק בזהירות חלקים הנותרים של האאקטודרם שמעל הצינור העצבי, notochord שמצורף להלן בצינור העצבי, שלפוחית otic וחלקים הנותרים של המזודרם באופן רופף. ודא שהצינור העצבי הוא נטול כל נספחיםבשלב זה.
הערה: כדי למנוע נזק לצינור העצבי לבצע כל העברה העצבית צינור / עובר עם טפטפת העברת פלסטיק או micropipette במידת צורך עם חתך קצה בסופו. הקוטר של סוף הקצה מותאם לגודל של הצינור העצבי. - העבר את הצינור העצבי גזור (ראה שלב פתק 1.9) בצינור 1.5 מיליליטר מלא גליצרול 50% בדילול מלא PBS. חכה עד שהצינורות העצביים נפלו לתחתית פתרון גליצרול, בדרך כלל O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את הפתרון של 50% גליצרול / PBS באמצעות micropipette P1000 ולהוסיף באותו צינור 1.5 מיליליטר פתרון של גליצרול / PBS 90% באמצעות micropipette P1000. חכה עד שהצינורות העצביים ליפול לתחתית 90% גליצרול / פתרון PBS, בדרך כלל O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: לאחסון לטווח ארוך, להשתמש 90% גליצרול / PBS בתוספת אנטיביוטיקה כדי למנוע התפתחות חיידקים. - העברת הצינורות העצביים על צלחת זכוכית, או שקופיות מיקרוסקופ עם טפטפת העברת פלסטיק.
- דיסכת הצינורות העצביים לאורך הגב וקווי אמצע הגחון באמצעות מחטי טונגסטן. במהלך שלב שהצינורות העצביים נשמרים בגליצרול% 90 / PBS.
- הר שני הצדדים של הצינור העצבי בגליצרול / PBS 90% באמצעות טבעות חיזוק מכוסות coverslip זכוכית.
- תקן coverslips עם לכה ולשמור על 4 מעלות צלזיוס.
2. בעלי החיים קאפ Explants אינדוקציה באמצעות חרוזים אניון Exchange שרף
- העברת חרוזים שרף אניוני 100 μl לתוך צינור 2 מיליליטר באמצעות micropipette P1000. שטוף את החרוזים לפחות חמש פעמים ברציפות עם מים מזוקקים סטריליים. לאפשר לחרוזים משקעים בחלק התחתון של הצינור ולהחליף את המים מזוקקים סטריליים באמצעות micropipette P1000. אל תיגעו בחרוזים.
- בואו חרוזים לספוג O / N בצינור 2 מיליליטר מלא במים מזוקקים סטריליים עם סרום שור אלבומין (BSA) (10 מ"ג / מיליליטר) ב 4 ° C.
- שתי שעות לפני איסוף המזגנים, חצי מקום של חרוזים ל1.5 מיליליטר חדשצינור באמצעות micropipette P1000. החלף את המים מזוקקים סטריליים עם 500 μl של המדיום המכיל את המולקולה להיבדק לפוטנציאל אינדוקטיביים, או ידוע לגרום גורל ספציפי. שמור את החצי השני של חרוזים, כפי שהם ישמשו כביקורת שלילית.
- דגירה חרוזים על 4 מעלות צלזיוס לפחות 2 שעות.
- לבצע את כל השלבים הבאים מתחת לסטראו ולבצע את כל העברת AC עם micropipette.
- העבר את עוברי gastrula מוקדם מאוד blastula או לPBS עם סידן ומגנזיום השלים עם BSA 0.2% בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
הערה: עוברים מתפתחים בשלבי blastula הישג C וgastrula ° 12 בשעה 20 עד 24. - הסר קרום vitelline של העובר באמצעות מלקחיים כפי שתואר קודם לכן 20. תקן את העובר עם מלקחיים. לצבוט את קרום vitelline עם הצד של מלקחיים האחרים. מחזיק את הקרום, לקלף אותו לאט את העובר. לבצע הליך זה על האוורורצד tral (צמחי) של העובר. אין לגרום נזק לצד בעלי החיים של העובר.
- לבודד מזגנים קטנים כפי שתואר קודם לכן 21. מוט בעלי החיים הוא חלק פיגמנט של העובר. מלקחיים עדינים באמצעות לגזור ריבוע קטן של רקמה מקוטב בעלי החיים. רקמת AC מכילה רק תאי ectodermal. ודא שהרקמה היא בעובי אחיד. אם לא, להסיר את AC מהניתוח.
- מניחים כל AC בצלחות multiwell Terasaki ב0.5x השתנו מלוח (MBS) של בארת '4. מניחים את AC להיטב עם הצד של בעלי החיים פיגמנט למטה, במגע עם התחתית העגולה של הבאר.
הערה: טפטפות ציפוי עם פתרון BSA 0.1% מונעת ההידבקות של חתיכות קטנות של רקמת דבק לפלסטיק. - הנח חרוז אחד בכל כובע באמצעות P20 micropipette. במידת הצורך, להשתמש במלקחיים למקום בזהירות את חרוז במרכז הכובע.
הערה: כאשר ספוג במדיום מותנה, חרוזים צבעוניים בורוד. בחר רוב שיתוףחרוזים lored. - לדגור על RT (18 עד 22 מעלות צלזיוס) במשך 6 שעות בלי לזוז צלחת multiwell Terasaki. חרוז מקלות AC בפחות מ -2 שעות.
- מניחים את צלחת multiwell Terasaki על גבי ניירות ספוגים במים. מכסה את הצלחת עם מיכל פלסטיק.
הערה: זה 'תא לחות' מונעת אידוי מוקדם של הבארות. - תרבות המזגנים ב0.5x MBS או 3/4 NAM (ראו שלב 4.1) בתא לחות 15-20 מעלות צלזיוס עד עוברי האחים הגיעו לשלב הנכון כדי לבדוק את ההשפעה של הגורם שלך.
- לתקן את המזגנים לשעה 1 במוכן טרי PFA 4%. מייבש את המזגנים בMeOH 100% כפי שתואר (שלב 1.4) בעבר.
תא דיסוציאציה 3. בעלי החיים קאפ וצירוף-מחדש לפני השתלה בXenopus laevis Neurula
- צלחות פטרי מעיל (60 מ"מ) או 12 צלחות בארות עם agarose 3% במים סטריליים או בPBS ללא סידן ומגנזיום. הוסף מספיק כדי לכסות את agarose בottom של צלחת פטרי או כן. טרום חם הצלחות ב RT (C ° 18-22). לחלופין, לאחסן צלחות לכמה ימים על 4 מעלות צלזיוס, כדי למנוע התייבשות.
- הכן-סידן חופשי המלוח של Holtfreter (60 מ"מ NaCl, 0.7 מ"מ KCl, 4.6 מ"מ HEPES, BSA 0.1% (A-7888 Sigma pH 7.6)) והמלוח של Holtfreter (60 מ"מ NaCl, 0.7 מ"מ KCl, 0.9 מ"מ CaCl 2, 4.6 מ"מ HEPES, pH 0.1% BSA 7.6) 5. הערה: הפתרון של CaCl 2 לא יכולה להיות autoclaved.
- מלא היטב לראש עם מי מלח של סידן ללא Holtfreter מצופה agarose.
- הכן blastula או עוברי gastrula מוקדם מאוד לבודד המזגנים שלהם כפי שתואר לעיל (שלבים 2.5-2.7).
- לבודד לפחות 15 או עד 30, מזגנים קטנים 21. מלקחיים עדינים באמצעות לגזור ריבוע קטן של רקמה מקוטב בעלי החיים. רקמת AC מכילה רק תאי ectodermal ולכן עובי אחיד. אם לא, להסיר את AC מהניתוח.
הערה: מוט בעלי החיים הוא אמבריחלק פיגמנט של o. - העבר את המזגנים לagarose מצופה מילא היטב לראש עם מי מלח של Holtfreter ללא סידן. מניחים את המזגנים עם צד פיגמנט כלפי מעלה.
הערה: תהליך הניתוק מתחיל במהירות במלוחה של Holtfreter ללא סידן. - המתן מספר דקות לתאים להתחיל dissociating. שים לב זה באמצעות פירוק של הרקמות. בעזרת מלקחיים בסדר, להפריד את שכבת פיגמנט משאר AC וזורקים אותם עם P20 micropipette. תהליך ניתוק תא שלם מציין הפרדה של תאים מזה.
הערה: אחד או שתי שכבות פיגמנט ניתן להשאיר בתוך explant מצטבר מחדש כדי לסייע להדמיה במהלך השתלה. - מרכז את התאים באמצעות תנועות סיבוביות של הצלחת. באמצעות micropipette P1000 להסיר בזהירות רבה כבינוני ככל האפשר. היזהר שלא לגעת בתאים.
- הוסף 1 מיליליטר של תמיסת מלח של Holtfreter עם סידן ול. העבר את המזגנים ניתקולתוך צינור 1.5 מיליליטר.
הערה: 2 מיליליטר צינורות לא ניתן להשתמש בשל התחתית העגולה שלהם. - גלולה התאים על ידי צנטריפוגה, 5 דקות במהירות מקסימלית של 2,000 סל"ד צנטריפוגה ספסל (500 XG). מוציא בזהירות את supernatant עם micropipette P1000.
- הוסף לתאים ניתקו 20 μl של תמיסת מלח של Holtfreter עם סידן (60 מ"מ NaCl, 0.7 מ"מ KCl, 0.9 מ"מ CaCl 2, 4.6 מ"מ HEPES, BSA 0.1% (7888-Sigma pH 7.6) 5.
- שמור המזגנים ניתקו, 3 עד 6 שעות על RT (18-22 ° C).
הערה: זה זמן דרוש לתאים מחדש המצרפי. מחדש הצבירה גלויה כמו התאים בצורת כדור קטן בחלק התחתון של הצינור. - לנתק את explant בזהירות מהחלק התחתון של הצינור על ידי הוספת 1 מיליליטר של 0.5x MBS או של 1 מיליליטר של 3/4 NAM (ראה שלב 4.1). העבר את explant בצלחת מצופה האו"ם בעזרת פיפטה העברה פלסטיק.
- שלב explants באמצעות האחים שליטתם. לאנטיביוטיקה שימוש תרבות לטווח ארוך: kanamyCIN (50 מיקרוגרם / מיליליטר), אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וgentamycine (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
4. הארכת בעלי החיים Caps Explants בצלחת עצבית של X. העובר laevis
- הכן 3/4 NAM (110 מ"מ NaCl, KCl 2 מ"מ, 1 מ"מ Ca (NO 3) 2, 1 מ"מ MgSO 4, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ NaHCO 3, 0.2X PBS, 50 מיקרוגרם / מיליליטר gentamycin). אל תשמרו ליותר משבוע 1 לנתיחה ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. NAM המבוגר יכול לשמש להכנת מאכלים לנתיחה מצופה agarose (להלן).
- צלחות פטרי מעיל (60 מ"מ) עם agarose 3% ב3/4 NAM לתוכו חורים קטנים שנעשו תוך שימוש בתבנית סיליקון, או הכיסוי של מחבט טניס שולחן.
הערה: agarose מכסה את החלק התחתון של צלחת פטרי. השאר קצת מרחב כדי שצלחת פטרי למלא עם 3/4 NAM. לחלופין לעשות מנות נתיחה עם פלסטלינה שאינו ייבוש. בתוך החימר, לסחוט את העוברים מעט במהלך הליך הנתיחה. לחפור חורים קטנים בagarose באמצעות מלקחיים מעוגלים זה "צלחת לנתיחה 'עוזר להחזיק את העוברים במהלך הליך הנתיחה. - לאסוף כלים לנתיחה: טפטפות העברת פלסטיק, "סכין גבה" (שנעשה עם שיער גבה המשובץ בפרפין בקצה של זכוכית פיפטה פסטר) 22, שני מלקחיים לנתיחה קנס, micropipette P1000 וטיפים, stereosmicroscope עם הגדלה 8-40X, מקור אור בהיר עם מדריכי סיבים אופטיים. שמור את כל הכלים לנתח נקיים; לאחר כל ניסוי, לשטוף אותם פעמיים עם מים מזוקקים, פעם אחת עם 100% אתנול ולתת יבש. אחסן הרחק מאבק ואם יש צורך החיטוי הכלים לנתח מתכת.
- בוא X. מצטבר מחדש ACS (פרוטוקול 3), ואחיהם ניתקו ו עוברי laevis לפתח עד שהם מגיעים שלב 13 (neurula) בהתאם לטבלה התפתחותית Nieuwkoop ופאבר 17. להשתלה בתוך שלב הצלחת העצבי 13 לביים 15 עוברים משמשים.
- לבצע את כלהשלבים הבאים בסטראו.
- בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר את העוברים לתוך PBS עם סידן ומגנזיום השלים עם BSA 0.2%. הסר קרום vitelline של העובר כפי שתואר קודם לכן 20. תקן את העובר עם מלקחיים. לצבוט את קרום vitelline עם הצד של מלקחיים האחרים. מחזיק את הקרום בחוזקה, לאט לקלף אותו מהעובר.
הערה: האם הליך זה בצד הגחון (הצמחי) של העובר. אין לגרום נזק לעוברי צלחת עצבית. אם עובר ניזוק במהלך שלב הסרת קרום vitelline, להעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ המכילה 3/4 NAM בעזרת פיפטה העברה פלסטיק ולחכות 15 דקות, זמן מספיק ללהתרחש תהליך הריפוי. - מלא את הצלחת לנתיחה לראש עם NAM 3/4 הטרי.
- בעזרת פיפטה העברה פלסטיק, להעביר את העוברים ללא קרום vitelline שלהם לתוך הצלחת לנתיחה. מניחים את העוברים צד גב להבארות. במהלך תהליך ההעברה אינו מאפשר את העובר להיכנס במגע עם ממשק האוויר הנוזלי מאז X. laevis הוא lysed על ידי מתח פנים.
- העבר את explant AC להיות מורכבים לתוך הצלחת לנתיחה בעזרת פיפטה העברה פלסטיק או micropipette P1000. ברגע שפיפטה היא בתוך הנוזל, מאפשר explants לשקוע לאט למטה על ידי כוח הכבידה, או לדחוף בעדינות רבה.
- שמור את העוברים עם מלקחיים מעוגלים. עם סכין הגבה לעשות חתך לתוך הצלחת העצבית שבו אתה מתכוון להשתיל פיסה של explant שלך.
הערה: בשלב 14 הכיפוף הקדמי של הצלחת העצבית יכול להיות שימוש כנקודת ציון, הוא מסמן את הטריטוריה diencephalon (איור 4). - לגזור חתיכה קטנה של neuroepithelium, באמצעות מלקחיים מעוגלים וסכין גבה. חותכים חתיכה קטנה של explant עם סכין הגבה.
הערה: פיסת explant צריכה להיות בערך באותו גודל וצורה כמו אזור ablated neuroepithelium. מניחים את פיסת explant לתוך חתך neuroepithelium באמצעות סכין הגבה ומלקחיים בסדר. ודא שexplant מהירות מייחס לעובר. - לחלופין במקום חתיכת הזכוכית coverslip על העובר והגימור לשמור את השתל במקום. כדי לעשות זאת, לחתוך coverslip זכוכית עדין לחתיכות קטנות מאוד באמצעות מלקחיים גסים. ודא שהגודל הוא כ 1.5 מ"מ 2. לטבול את החתיכות לתוך צלחת פטרי המכילה 3/4 מלקחיים באמצעות NAM או PBS. בחר חתיכת זכוכית גדולה יותר מהעובר כדי למנוע פגיעה בו. העובר יהיה קצת שטוח.
- חכה לפחות 30 דקות בלי לזוז, או רק להזיז את הצלחת לנתח בעדינות. בואו העובר להתאושש במשך 30 דקות לשעה 2 ולהסיר בעדינות את coverslip במידת צורך. פיפטה בזהירות את העוברים המורכבים לתוך צלחת נקייה מלאה ב3/4 NAM, באמצעות פיפטה העברה הפלסטיק.
הערה: עוברים מורכבים נוטים לפתח חיידקים או זיהום פטריות. לג לטווח ארוךulture להשתמש באנטיביוטיקה: kanamycin (50 מיקרוגרם / מיליליטר), אמפיצילין (50 מיקרוגרם / מיליליטר) וgentamycine (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בהתבסס על שיקולים מורפולוגיים במינים שונים, מניפולציות עובריות, ואת דפוס הביטוי של גני רגולציה, מודל רעיוני גורס כי הצלחת העצבית מחולקת למגזרים רוחביים ואורך המגדירים רשת התפתחותית יצירת שדות histogenic מובחנים. בצלחת העצבית, primordia של המוח הקדמי, המוח התיכון, למוח האחורי וחוט השדרה כל כבר הוקם לאורך ציר Antero-אחורי (AP) במהלך gastrulation (שנסקר ב23-25). במהלך neurulation, ניתן לאתר שדות histogenic כתחומים מוגבלים במרחב של ביטוי גנים. בהתבסס על דפוסי הביטוי של גני רגולציה, primordium המוח הקדמי מחולק לשישה קטעים רוחביים שיוצרים שדות histogenic מובחנים נקראים prosomeres (עמ '). כל prosomere מחולק לגחון (בסיסי) וחלק הגבי (עלאר) (נבדק ב26,27). בדו-חיים, prosomere 2(P2) מוליד epithalamus והתלמוס ומארגנה Z אונה L imitans אני ntrathalamica (ZLI) 8 (שנסקר ב28,29).
באיור 1 מוצג שטוחת הרכבה של X. laevis וX. tropicalis קדמי צינורות עצביים בשלבי 30, 32, ו -35 אחרי WM-צלחת. WM-האיש בוצעו על פי פרוטוקול 1 באמצעות בדיקות לגורמי שעתוק fezf2 שמסמן את telencephalon וP3, barhl2 שמסמן P2, מכפלות קליפת המוח והמוח תיכונים, Iroquois-1 (irx1) וIroquois-3 (irx3) שבהתאמה P2 סימן הזנב וP2 עלאר ושלשישה מורפוגן שמסמן את ZLI, המוח הקדמי הבסיסי ומוח תיכון (איור 1E). ניתוח השוואתי של דפוסי ביטוי גנים השונים מגלה כי הגבול הקדמי של barhl2 ביטוי P2 במגע גבול הזנב של ביטוי fezf2 בP3 (איור 1 א). Irx3 הוא עם ששש בZLI העתיד (איור 1), הביע במשותף. בתוך תחום ביטוי irx1 P2 הוא משלים לזה של ששש (איור 1 ג) 8. דפוס הביטוי של barhl2 בX. tropicalis בשלב 35 מוצג באיור 1D. תרשים סכמטי של שטחי הביטוי של גנים אלו במוח הקדמי דו-חיים הפיתוח מסופק באיור 1E.
שימוש בפרוטוקול 2 היכולת של חרוזים שרף אניוני הספוגים שבשישה לגרום לביטוי ששש נחקר בexplants מזגנים. X. laevis עוברים הוזרקו לסטומרים בעלי החיים 4 ב4 ו -8 תאים-הבמה עם mRNAs קידוד לגולגולת של inducer neuroepithelial הקדמי יחד עם barhl2, otx2, irx3 וGFP כנותב הזרקה. הביטוי של הבחור! הגורם אנטי-BMP מעכב את מסלול BMP ונותן זהות עצבית לתאי AC 3. אנו מתייחסים לAC להביע בחור! כAnteriorised בעלי החיים קאפ (AAC). explants גג Blastocoel הוכן כפי שתואר בפרוטוקול 2. AACs היה בתרבית במשך 48 שעות על 18 מעלות צלזיוס במגע עם חרוז שרף אניוני הספוג במדיום מותנה (CM) המכיל, או לא, חלק N- המסוף מופרש מ הקיפוד מורפוגן הקולי מעכברוש (N-ששש). הביטוי של ששש אנדוגני נותח על ידי איש (איור 2). ביטוי של ששש צפרדעים (Xshh) מזוהה בתאים במגע עם חרוז הספוג בCM עם N-ששש, אבל לא בתאים במגע עם חרוז הספוג בCM ללא N-שש (איור 2).
שימוש בפרוטוקול 3 היכולת של סוגי תאים שונים להפריד מanoth אחדאה נחקר. X. עוברי laevis הוזרקו לסטומרים בעלי החיים 4 ב4 ו -8 תאים-הבמה עם mRNAs קידוד לגולגולת עם או בלי otx2, barhl2 וirx3, כפי שצוינו, באמצעות ßGal או GFP כקליעים נותבים (איור 3 א). מזגני 8/9 במה היו ניתקו מחדש מצטברים-מנת ליצור explants מורכב מתאי neuroepithelial מעורבים המכילים את שני ßGal- ותאי GFP-להביע. Explants reaggregated היה בתרבית במשך 48 שעות על 18 מעלות צלזיוס. פעילות ßGal התגלתה באדום על פי 30 (איור 3 א). התנהגותם של התאים נצפתה על ידי ביצוע הלוקליזציה שלהם בתוך explants מצטבר מחדש. בexplants שבו תאי AACs מעורבבים עם תאי AACs להביע Otx2 (אדום), תאי ßGal להביע לא להפריד מהתאים לבטא-GFP שני הסוגים של תאים התערבבו בחופשיות (איור 3, 3C). לעומת זאת, בexplants בי Otx2 להביע תאים (GFP) מעורבבים עם Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) תאי -expressing (ßGal), תאי ßGal להביע (אדום) יוצרים טלאים מגובשים ואינו מתפשטים באופן אחיד בתוך explant מצטבר מחדש ( איור 3D, 3E).
שימוש בפרוטוקול 4, התנהגותם של תאים מתוכנת AC נחקרה in vivo. X. laevis עוברים הוזרקו לסטומרים בעלי החיים 4 על 4 ו -8 תאי השלבים עם mRNAs קידוד לגולגולת עם otx2 לבדה או ביחד עם barhl2 וirx3. ßGal שימש כנותב. במקביל, עובר הוזרקו באופן דומה עם mRNAs קידוד לגולגולת והחלק המופרש N- המסוף של ששש מורפוגן מעכברוש (N-ששש). בשלב 8/9, explants AC היה ניתק ומייד מחדש מצטבר כדי ליצור explants המעורב מורכב מneuroepit תאי helial או להביע N-שש וOtx2, או להביע N-שש וOtx2, Barhl2 וIrx3 (BOI3). חתיכות קטנות של explants המעורב היו מורכבים לתוך הצלחת העצבית של X. laevis עובר בשלב 14. התאים המורכבים סומנו בצביעת ßGal (אדום). בשלב 35 הביטוי של ששש אנדוגני נותח על ידי איש. כאשר השתיל לתוך הצלחת העצבית הקדמית של X. laevis עוברים, explants המעורב המורכב מBOI3 וN-שישה תאים לבטא פיתחו שתי תכונות ספציפיות של תאי ZLI: התאים המורכבים הביעו Xshh ונפרד מהתאים קדמי neuroepithelial (איור 3 ג). לעומת זאת, כאשר מעורב explants המורכב מOtx2 - וN-Shh- להביע תאים מורכבים בX. laevis צלחת עצבית, התאים המורכבים לא הביעו ששש ולא להפריד משכניהם (איור 3) 8.
לשמור-together.within עמודים = "1">: 
איור 1. צינורות עצביים רכוב שטוחים מX. laevis וX. tropicalis עוברי כל הר ISH הכפול (- D). WM-איש מבוצע באמצעות fezf2, barhl2, irx1, irx3, וששש כמו בדיקות ב( - C) X. laevis עובר בשלבים 30, 32, ו -35 וX. (D) עובר tropicalis בשלב 35 כפי שצוין. הצינורות העצביים של עוברי נציג הם גזורים ושטוחים רכובים כמתואר בפרוטוקול 1. הצינורות העצביים גזור מוצגים ממבט מצד, גב למעלה, שמאל קדמי. הסמנים ושלבים מצוינים. הגבולות מקורי ואת הזנב של P2 מצוינים עם חצים. (AC) סרגל קנה המידה מייצג 0.5 מ"מ. (ד) שלבר קייל עומד על 0.1 מ"מ. . (E) סכמטי של סמני המוח הקדמי בst.30 תחום ביטוי barhl2 מצויינים בקווים בקעו; תחומי הביטוי מוצגים לfezf2 (ורוד), ששש (אדום), irx3 (צהוב) וirx1 (ירוק). עמ 'עומד לprosomere. בלוטת האצטרובל ממוקמת בחלקו העליון של P2 מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
האינדוקציה איור 2. ביטוי ששש בexplants לתכנת באמצעות מגע עם חרוזים שרף אניוני. מזגנים קטנים מוכנות מעוברים מוזרקים עם קידוד mRNA לגולגולת, barhl2, otx2, וirx3, עם GFP כנותב. AAC עומד Fאו Anteriorised בעלי החיים קאפ. Explants AAC להביע Barhl2, Otx2 וIrx3 (AAC BOI3) בתרבית במשך 48 שעות במגע עם חרוז הספוג במדיום מותנה (CM) או המכיל N-ששש, או לא, כפי שצוין. Explants מנותחות ISH לביטוי של צפרדעים (X) ששש. סרגל קנה המידה מייצג 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח של תא הפרדה בהתנהגות explants מצטבר מחדש. () עוברי laevis X. מוזרקים עם קידוד mRNA לגולגולת, otx2, barhl2 וirx3 כפי שצוינו. ßGal ו- GFP משמשים כנותב. בשלב 8/9 מזגנים קטנים מוכנים , ניתק מחדש מצטבר-מנת ליצור explants עשוי GFP / ßGal סוגים מעורבים תא. Explants בתרבית למשך 48 שעות על 18 מעלות צלזיוס ופעילות ßGal מתגלה (אדום). (ב - E) explants נציג מורכב מתאים מעורבים להביע חלבונים כפי שצוין מוצגים. AAC מייצג Anteriorised בעלי החיים קאפ. (B, C) תאי מזגנים להביע בחור! וOtx2 (ßGal) להפיץ באופן אקראי כאשר מעורבבים עם בחור! תאי מזגנים להביע (GFP). (ג) תצוגה מוגדלת של (B). תאים (ד) AACs להביע Barhl2, Otx2 וIrx3 (BOI3) (ßGal) התארגנו מחדש ונפרדים מתאי AACs להביע Otx2 (GFP). (ה) תצוגה מוגדלת של (ד). (B, D) סרגל קנה המידה מייצג 0.5 מ"מ. (C, E) סרגל קנה המידה מייצג 0.2 מ"מ.ז "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
explants איור 4. מתוכנתות להציג תכונות הפיתוח שלהם כאשר השתיל בצלחת העצבית של עובר בשלב 14 (א) תכנית ניסיונית:. AACs ערוכים מעוברים מוזרקים עם mRNAs כפי שצוין. בשלב 8/9 תאים מגג blastocoel הם ניתקו ומחדש מצטברים כדי ליצור explants עשוי סוגי תאים מעורבים להביע ßGal (אדום). Explants בתרבית עד אחיהם הגיעו לשלב 14. חתיכה קטנה של מעורב explant (מלבן ירוק) מוכנס לתוך חתך בצלחת העצבית הקדמית. עוברים פעלו גדלים עד שלב 35. עוברים מופעלים מנותחות WM-איש באמצעות X. laevis ששש (Xshh) כבדיקה. פעילות ßGal מתגלה בACC האדוםØrding 30. (B, C) הצדדים המורכבים של שלב 35 צינורות עצביים נציג מוצגים, מבט מצד, גב למעלה, שמאל קדמי. (ב) מורכבים עם AACs המעורב להביע Otx2 וN-שש. (ג) מורכבים עם AACs המעורב להביע Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) ו- N-שש. תאים מורכבים מסומנים עם כוכב אדום. הכוכב הוורוד מציין את diencephalon הפוטנציאלי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התפתחות עצבית היא בניצוחו של גומלין מורכב בין תוכניות סלולריות התפתחותיים ואותות מהרקמות הסובבות (נבדקו ב3,31,32). כאן אנו מתארים קבוצה של פרוטוקולים שניתן להשתמש בX. laevis עובר לחקור חיצוני וגורמים פנימיים מעורבים בקביעת גורל עצבית והמורפוגנזה עצבית במבחנת in vivo. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש ככזה על X. עוברי tropicalis, לעומת זאת X. עוברי tropicalis ארבע פעמים קטנות יותר אז X. laevis עובר. שני המלקחיים והמחטים טונגסטן משמשים צורך להיות עדינים. במידת האפשר, להשתמש X. laevis.
הדמיה מדויקת של X. laevis וX. ניתן להשיג שדות histogenic עצביים tropicalis באמצעות ההרכבה השטוחה היסטולוגית של צינורות עצביים גזור מ- DRM איש. טכניקה זו בוצעה בהצלחה על X. laevis עובר משלב 26 לשלב 45 (איור 1) ועל X. tropicalis עוברים משלב 30 לביים 45 8,33. עוברים מבוגרים קלים יותר לנתח עוברים אז צעירים. טכניקה זו היא קלה לביצוע. היא מאפשרת ניתוח של דפוסי ביטוי גנים, בנפרד או בשילוב, בצינורות עצביים בשלבי התפתחות שונים. עם פרוטוקול זה קל להשוות צד אחד של צינור עצבי עם אחרים. זה מאוד שימושי בניסויי Xenopus GOF וLOF. הליקויים שנצפו בצד המוזרק של הצינור העצבי ניתן להשוות ישירות עם אירועים התפתחותיים נורמלים נצפו בצד השליטה. אסטרטגיה זו נעשתה שימוש כדי לנתח פנוטיפים GOF וLOF בX. laevis עוברי 8,33. צעד חשוב אחד בפרוטוקול זה הוא הקיבעון הנכון של הרקמות עובריות. קיבעון שלם מונע ניתוק יעיל של האאקטודרם מהצינור העצבי. לפני הנתיחה של הצינור העצבי מאפשרת את החדירה בכפיפותבדיקות u. עם זאת מבודד פעם אחת, זה קל לאבד את הצינורות העצביים. מומלץ לשמור חלק של העובר במהלך הליך ISH כדי למנוע כל אובדן.
העוברים משמשים לכל הניסויים האלה צריכים להיות חזקים וצריכים לרפא גם. לבטל את כל קבוצה של עוברים בריאים. כדי לנתח מזגנים וexplants שתל בין שלב 13 ושלב 15 אפשר לגדול X. laevis explants ועוברים בטמפרטורות שונות (12-18 מעלות צלזיוס, 18-20 מעלות צלזיוס). X. ראוי לציון laevis תאים עובריים מכילים מספיק חלמון כדי לאפשר את הישרדותם במשך כמה ימים ללא תוספת של כל מזין חיצוני. לא לפגוע ברקמות עובריות, כל הליך העברת עובר, AC, או explant צריכה להיעשות בזהירות. מומלץ להשתמש גם פיפטה העברת פלסטיק או micropipette במידת צורך עם חתך קצה בסופו. הקוטר של סוף הקצה מותאם לגודל של העובר, או בגודל של explant, שיועבר.זה ראוי לציון, טפטפות ציפוי עם פתרון BSA 0.1% מונעת ההידבקות של חתיכות קטנות של רקמה לפלסטיק.
ניתן לתכנת explants AC דרך ביטוי גנים בכפייה, או דרך חשיפה לגורמים חיצוניים באופן זמן ומרחב שבשליטה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת אינדוקציה מקומית באמצעות מגע ישיר בין explant וחרוז. במידת צורך את החרוזים ניתן מקוטעים נוסף באמצעות מלקחיים. בהשוואה לאסטרטגיות שתוארו קודם לכן אחרות, טכניקה זו מאפשרת בדיקה של אינדוקציה מקומית עם גורמים טהורים, לבד או בשילוב, בחלון זמן מדויק.
שימוש בגישה שתוארה קודם לכן של תא דיסוציאציה מחדש עמותה 34, אפשר לחקור את יכולות תנועתיות תא, התנהגויות הפרדת תאים, והיווצרותם של גבולות תא בexplants דחוק ומעורב AC 8. תהליך ניתוק התא מתחיל בפחות מ -15 דקות. הימנע shakinז הצלחת במהלך שלב דיסוציאציה כדי למנוע האובדן של תאים. שכבות פיגמנט AC לא לנתק גם. מומלץ להסיר אותם במהלך שלב הניתוק. כמה שכבות פיגמנט AC נשארו בexplant מצטבר מחדש. זה עוזר בלדמיין את השתל. זה לא מפריע לניתוח בשלבי התפתחותיים מאוחר יותר.
בכתב יד זה פרוטוקול להשתיל מעורב explants לתוך צלחת עצבית היא מפורטת. בעוברי צפרדעים, הצלחת העצבית פתוחה בין שלב 13 ושלב 15. שלבים אלה הם אפוא מתאימים להשתלה בתוך neuroepithelium. X. laevis רקמות מאפייני הדבקה משתנים עם זמן. חשוב להרכיב explants AC למארח בשלב התפתחותי דומה. בשלבי התפתחות מוקדמים, X. laevis עוברים גדלו ב3/4 תיקון NAM מהר מאוד. אם כמה עוברים נפגעו במהלך הסרת קרום vitelline זה עשוי להיות שימושי לחכות 15 דקות,שהוא הזמן הדרוש ללהתרחש תהליך הריפוי. הכנסה יכולה להיות מועדפת על ידי לשים חתיכת הזכוכית coverslip על רקמת המארח המורכבת, אבל זה לא דרישה. הכוח שנוצר על ידי תהליך הריפוי יכול extrude התאים המורכבים. מורפולוגיה של עובר המארח היא השתמרה טוב יותר כאשר השתל הוא נאלץ לתוכו עם לחץ חיצוני, כעם coverslip. כדי להעריך את ההצלחה של השתל, נותב ניאון ניתן להזריק לתוך explants. הנוכחות של תאי ניאון בתוך העובר המורכבים ניתן דמיין עד הצינור העצבי נסגר. החסרון העיקרי בניסויי תרבות והשתלת AC הוא התדר של חיידקים או פטריות זיהום. השתמש בפתרוני חומר וסטרילי נקיים או סטרילי לעתים קרובות ככל האפשר, כדי למנוע זיהום מנה בכל שלב של הפרוטוקול. לתרבות לטווח ארוכה של עוברים מורכבים תמיד להשתמש באנטיביוטיקה ובטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס. יש להימנע ממגע ארוך טווח של explants או עובר עם agarose AC. אנו observאד שהוא יכול להקטין את תוחלת החיים של explant. טכניקת ההשתלה היא חזקה אבל זמן רב. זה לא מומלץ למסך לרמזי נחישות גורל עימו, אך לרכוש מספיק מידע על הרקמה של בחירה שלך מראש.
לצד היתרונות המסורתיים שלה, ההתקדמות הגנטית האחרונה ב Xenopus פתחה את הדרך לכך מערכת מודל לחקור רשתות רגולציה גן באמצעות ניתוח גנומי בקנה מידה גדולה על ידי רצף RNA עמוק וChromatide Immunoprecipitation-רצף (שבב seq) 5,35. יש RNAseq מעולה וערכות נתונים התייחסות צ'יפ-Seq מכסות התפתחות עוברית מוקדמת. אחד חסרונות ניתוח שבב seq הוא הצורך לאסוף כמות גדולה של חומר. תכנות של explants AC מאפשר ייצור של כמות גדולה של רקמה עצבית ספציפית, ולפחות בחלקו, עוזר להתגבר על מגבלה טכנית זו.
איבר צינור עצבי תוכניות התפתחותיות בסיסיogenesis במידה רבה נשמרים, במיוחד בבעלי חוליות. מידע שנרכש באמצעות דו-חיים מסייע בהבנה של תהליכים תאיים ומולקולריים שבבסיס פיתוח חוליות 25,32,36-38. ההתקדמות אחרונות בתחום של תאי גזע מושרה pluripotent (iPSCs) נפתחה שערים למחקר ברפואת רגנרטיבית וגילוי תרופות. iPSCs מתוכנתים מהתאים סומטיים באמצעות שילוב של גורמי שעתוק. החיפוש של רמזי תכנות לתאי גזע הוא מתמשך. מבחני מתארים כאן מספקים אמצעי ליצירת סוגי תאים המופקים עצביים במבחנה שיכול לשמש בהקרנת סמים. הם גם מספקים דרך זולה ומהירה לבדיקת גורמי גורל עצביים שיכול לשמש לתכנות מחדש נוסף של iPSCs 39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
