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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

स्टेम सेल की तरह Published: February 2, 2016 doi: 10.3791/53474
Automatic Translation
1,2,3,4
1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

Introduction

कशेरुकी तंत्रिका तंत्र neuroepithelial कोशिकाओं का एक सजातीय परत के रूप में तंत्रिका प्लेट से उभर रहे हैं। विकास कार्यक्रमों के तंत्रिका प्लेट की regionalization के दौरान, प्रेरित इनकोडिंग, और स्थापित कर रहे हैं कि कैसे को समझना, वर्तमान में, विकास जीव विज्ञान में एक प्रमुख लक्ष्य है। अन्य प्रणालियों की तुलना में, प्रयोगात्मक उत्तरदायी Xenopus भ्रूण तंत्रिका विकास 1,2 के प्रारंभिक चरणों का विश्लेषण करने के लिए पसंद का एक मॉडल है। यह भ्रूण की बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए आसान है, और बाह्य विकास neurulation 3 के बहुत पहले कदम के लिए पहुँच देता है। कई उपकरण प्रयोगात्मक Xenopus laevis (एक्स laevis) भ्रूण के विकास में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं। सूक्ष्म इंजेक्शन एक साथ जैव रासायनिक और औषधीय उपकरणों के साथ inducible राज्यमंत्री सहित mRNAs या morpholinos (एमओ), की, समारोह के लाभ (GOF) और समारोह (LOF) की हानि और रास्ते 4,5 संकेत के विशिष्ट परिवर्तन नियंत्रित की अनुमति देता है। blastocoel छत बाहरी झिल्ली, एक ब्लासटुला, या एक बहुत जल्दी गेसट्रुला भ्रूण के पशु ध्रुव के आसपास स्थित है, और 'पशु कैप' (एसी) के रूप में भेजा, जीन अभिव्यक्ति से पहले के हेरफेर से प्रोग्राम किया जा सकता है कि pluripotent कोशिकाओं का एक स्रोत है तैयारी explants। इस पांडुलिपि में एक्स का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल रहे हैं laevis एसी explants इन विट्रो और इन विवो आणविक तंत्र और सेलुलर प्रक्रियाओं अंतर्निहित तंत्रिका विकास में परीक्षण करने के लिए।

एक तकनीक एक Xenopus मेढक न्यूरल ट्यूब में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के ठीक अवलोकन, भाग्य दृढ़ संकल्प संकेतों की पहचान करने में एक प्रारंभिक चरण के लिए अनुमति देता है, प्रस्तुत किया है। फ्लैट पर चढ़कर ऊतकों का अवलोकन सामान्यतः लड़की भ्रूण 6 के अध्ययन में इस्तेमाल किया जाता है, जबकि यह ठीक से Xenopus में वर्णित नहीं किया गया है। 2 या 4 सेल चरण भ्रूण की blastomeres में सिंथेटिक mRNA या एमओ इंजेक्शन द्वारा जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर एसी की प्रोग्रामिंग की अनुमति देता है4 explants। विरोधी बीएमपी कारक नोगिन की अभिव्यक्ति से अस्थि Morphogenetic प्रोटीन (बीएमपी) मार्ग का उदाहरण निषेध के लिए, एसी 3 कोशिकाओं को एक तंत्रिका पहचान देता है। प्रोटोकॉल एक आयनों विनिमय राल मनका के साथ सीधे संपर्क के माध्यम से बाह्य संकेतों के लिए एसी explants की स्थानीय और समय-नियंत्रित जोखिम के प्रदर्शन के लिए विस्तृत है। अंत में एक तकनीक अलग है और फिर से संबद्ध प्रोग्राम किया अलग कोशिकाओं से तैयार मिश्रित explants के प्रत्यारोपण द्वारा विवो में तंत्रिका पूर्वज की विकास संबंधी सुविधाओं के परीक्षण के लिए वर्णित है।

मेंढक भ्रूण जल्दी कशेरुकी तंत्रिका विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल है। जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के संयोजन में इन विट्रो संस्कृतियों explant को neuroepithelium regionalization, प्रसार, और morphogenesis 7-12 के अध्ययन में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। एसी explants की प्रोग्रामिंग पूर्व vivo 13,14 एक कार्यात्मक दिल के विकास की अनुमति दी। उपयोगग्राफ्टिंग explant के 15 तंत्रिका शिखा भेदभाव कार्यक्रम 16 उत्प्रेरण न्यूनतम ट्रांसक्रिप्शनल स्विच की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया। Zona limitans intrathalamica (zli) दुम अग्रमस्तिष्क के विकास और regionalization नियंत्रित करने के लिए ध्वनि का हाथी (श्श्श) स्रावित करता है कि एक संकेतन केंद्र है। लगातार श्श्श के संपर्क में, तीन प्रतिलेखन कारक जीन coexpressing neuroepithelial कोशिकाओं - बाढ़ की तरह homeobox -2 (barhl2), orthodenticle -2 (otx2) और Iroquois -3 (irx3) - zli डिब्बे के दो विशेषताओं के अधिग्रहण: करने के लिए क्षमता श्श्श व्यक्त, और पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट कोशिकाओं से अलग करने की क्षमता। एक मॉडल प्रणाली के रूप में, neuroepithelial कोशिकाओं में एक zli भाग्य की प्रेरण 8 प्रस्तुत किया जाएगा।

इन प्रोटोकॉल मौलिक एमईसी पता लगाने के लिए विकासात्मक जीव और अन्य शोधकर्ताओं के लिए सरल, सस्ता, और कुशल उपकरण उपलब्ध कराने का उद्देश्यकुंजी तंत्रिका कोशिका व्यवहार के hanisms। इन प्रोटोकॉल बहुत बहुमुखी हैं और बाह्य और आंतरिक तंत्रिका दृढ़ संकल्प संकेतों की एक बड़ी रेंज की जांच की अनुमति। यह तंत्रिका वंश प्रतिबद्धता, प्रेरक बातचीत और सेल व्यवहार के vivo विश्लेषण में लंबी अवधि के लिए परमिट।

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Protocol

प्रयोगों वैज्ञानिक उद्देश्यों के लिए है और प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के लिए अंतरराष्ट्रीय स्तर पर स्थापित सिद्धांतों के साथ इस्तेमाल जानवरों के संरक्षण पर राष्ट्रीय और यूरोपीय विनियमन के साथ अनुपालन।

Xenopus 1. फ्लैट बढ़ते के बाद टैडपोल पूर्वकाल तंत्रिका ट्यूब laevis स्वस्थानी संकरण में पूरे माउंट

  1. एक्स प्राप्त करें मानक प्रक्रियाओं 4 और वे 26 और पुराने (Nieuwkoop और फैबर विकासात्मक तालिका 17 के अनुसार neurula चरण तक पहुंचने तक उन्हें उम्र के अनुसार भ्रूण laevis।
  2. फिक्स एक्स 4% paraformaldehyde (पीएफए) के एक समाधान में उन्हें incubating द्वारा टैडपोल laevis। 38 भ्रूण, बाद के चरणों में भ्रूण के लिए आरटी पर 2 घंटा चरण के लिए चरण 26 के लिए, 1 आरटी पर घंटा 1.5 रॉक और एक 2 मिलीलीटर कांच की शीशी में भ्रूण बारी बारी से।
    चेतावनी: पीएफए ​​से संपर्क करें और एक संदिग्ध कैसरजन से विषैला होता है। यह एक डाकू के तहत चालाकी से किया जाना चाहिए।
    नोट: वन एक्स laevis चिंता हैआमतौर पर एक 2 मिलीलीटर कांच की शीशी में तय लेकिन एक बड़ा कांच की शीशी में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  3. दो बार, 0.1% के बीच (पीबीटी) के साथ 1x पीबीएस उपयोग कर एक ही शीशी में भ्रूण, आरटी पर 3 मिनट धो लें।
    नोट: अन्यथा उपयोग पीबीएस निर्दिष्ट जब तक साथ या कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना है।
  4. एक ही शीशी में आरटी पर कम से कम 12 घंटे के लिए 100% मेथनॉल (MeOH) में भ्रूण निर्जलीकरण। एक प्लास्टिक micropipette का उपयोग हुड के तहत कम से कम दो बार MeOH 100% बदलें।
    नोट: MeOH में भंग लिपिड के रूप में थोड़ा पीला पड़ जाता है। MeOH साँस लेना द्वारा विषाक्त है और एक डाकू के तहत चालाकी से किया जाना चाहिए सावधानी।
  5. पीबीएस, MeOH पीबीएस में 50%, दो बार पीबीएस, पीबीएस में MeOH 25%, आरटी पर प्रत्येक स्नान 5-10 मिनट में MeOH 75%: एक वर्गीकृत MeOH स्नान की श्रृंखला के माध्यम से एक ही शीशी का उपयोग भ्रूण rehydrate। MeOH समाधान एक प्लास्टिक micropipette का उपयोग हुड के तहत बदल रहे हैं।
  6. एक प्लास्टिक विंदुक का प्रयोग, भ्रूण पीबीटी के साथ शीर्ष पर भरा एक 60 मिमी पेट्री डिश में विच्छेदित किया जा के लिए स्थानांतरण। दो ठीक संदंश देखभाल का उपयोगपूरी तरह से ऑप्टिक डंठल के स्तर पर, आंखों और न्यूरल ट्यूब के बीच एक ठीक संदंश डालने से आंखों को हटा दें। न्यूरल ट्यूब से आंखों को अलग करें। ध्यान से न्यूरल ट्यूब overlying बाहरी झिल्ली के नीचे संदंश परिचय। देखभाल के साथ, सिर के पीछे से शुरू बाहरी झिल्ली से छील और यह त्यागें।
  7. का उपयोग कर एक डबल या एकल ISH प्रदर्शन करना digoxigenin लेबल या पहले से ही fluorescein लेबल जांच 18,19 का वर्णन किया।
  8. ISH पीबीटी एक प्लास्टिक पिपेट का उपयोग के साथ शीर्ष पर भरा एक नया 60 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण हस्तांतरण के बाद।
  9. ठीक संदंश का प्रयोग सावधानी से भ्रूण के बाकी हिस्सों से न्यूरल ट्यूब अलग। इस स्तर पर, पूर्वकाल न्यूरल ट्यूब पीछे न्यूरल ट्यूब से अलग करती है। ध्यान से न्यूरल ट्यूब, शिथिल न्यूरल ट्यूब, कान का पुटिकाओं और mesoderm के शेष भागों के नीचे संलग्न है कि पृष्ठदंड overlying बाहरी झिल्ली के शेष हिस्से को अलग। न्यूरल ट्यूब किसी परिशिष्ट से रहित है कि यह सुनिश्चित करेंइस स्तर पर।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो उसके अंत में एक टिप कटौती के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ सभी न्यूरल ट्यूब / भ्रूण हस्तांतरण या एक micropipette प्रदर्शन न्यूरल ट्यूब को होने वाले नुकसान से बचने के लिए। टिप अंत के व्यास न्यूरल ट्यूब के आकार को समायोजित किया जाता है।
  10. विच्छेदित न्यूरल ट्यूब स्थानांतरण पीबीएस में पतला 50% ग्लिसरॉल से भरा एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में (नोट कदम 1.9 देखें)। न्यूरल ट्यूब के ग्लिसरॉल समाधान की तह तक गिर गया है, जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर आमतौर पर हे / एन, रुको।
  11. 50% ग्लिसरॉल का समाधान निकालें / पीबीएस एक micropipette P1000 उपयोग करते हुए और एक ही 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक micropipette P1000 का उपयोग कर 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस का एक समाधान जोड़ें। न्यूरल ट्यूब के 4 डिग्री सेल्सियस पर आम तौर पर, 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस समाधान की तह तक हे / एन गिरने तक इंतजार।
    नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, बैक्टीरियल विकास को रोकने के लिए 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस प्लस एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें।
  12. एक गिलास प्लेट, या एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड पर न्यूरल ट्यूब के स्थानांतरण।
  13. जिलेपृष्ठीय और टंगस्टन सुइयों का उपयोग उदर midlines साथ न्यूरल ट्यूब के संप्रदाय। उस कदम के दौरान तंत्रिका नलियों 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस में रखा जाता है।
  14. एक गिलास coverslip के साथ कवर सुदृढीकरण के छल्ले का उपयोग कर 90% ग्लिसरॉल / पीबीएस में न्यूरल ट्यूब के दो पक्षों के माउंट।
  15. वार्निश के साथ coverslips फिक्स और 4 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं।

आयनों विनिमय राल मोतियों का उपयोग 2. पशु कैप Explants प्रेरण

  1. एक micropipette P1000 उपयोग कर एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में आयनों विनिमय राल मोतियों की 100 μl स्थानांतरण। बाँझ आसुत जल के साथ मोती कम से कम लगातार पांच बार धोएं। मोती ट्यूब के नीचे तलछट और एक micropipette P1000 का उपयोग कर बाँझ आसुत पानी की जगह करने की अनुमति दें। मोती मत छुओ।
  2. मोती 4 डिग्री सेल्सियस पर गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ बाँझ आसुत जल से भरा एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में हे / एन लेना।
  3. दो घंटे एक नया 1.5 मिलीलीटर में एसी, मोतियों की जगह आधा इकट्ठा करने से पहलेएक micropipette P1000 का उपयोग कर ट्यूब। अणु युक्त मध्यम के 500 μl अपने प्रेरक क्षमता के लिए परीक्षण किया है, या एक विशिष्ट भाग्य प्रेरित करने के लिए जाना जाने के साथ बाँझ आसुत पानी की जगह। वे एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, के रूप में मोती के अन्य आधा रखें।
  4. कम से कम 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मोती सेते हैं।
  5. Stereomicroscope के तहत बाद के सभी चरणों को पूरा करने और एक micropipette के साथ सभी एसी हस्तांतरण प्रदर्शन करते हैं।
  6. एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग 0.2% BSA के साथ पूरित कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस में ब्लासटुला या बहुत जल्दी गेसट्रुला भ्रूण स्थानांतरण।
    नोट: भ्रूण 20 से 24 घंटे में 12 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच ब्लासटुला और गेसट्रुला चरणों में विकसित कर रहा।
  7. पहले से 20 के रूप में वर्णित संदंश का उपयोग भ्रूण के पीतक झिल्ली को हटा दें। एक संदंश के साथ भ्रूण को ठीक करें। अन्य संदंश के पक्ष के साथ पीतक झिल्ली पिंच। झिल्ली होल्डिंग, धीरे-धीरे भ्रूण इसे बंद छील। वेंचर पर इस प्रक्रिया का प्रदर्शनभ्रूण के त्राल (वनस्पति) की ओर। भ्रूण के पशु पक्ष को नुकसान नहीं है।
  8. पहले 21 में वर्णित के रूप में छोटे एसी अलग। पशु पोल भ्रूण के पिगमेंटड हिस्सा है। का प्रयोग ठीक संदंश पशु पोल के बाहर ऊतक का एक छोटा सा वर्ग में कटौती। एसी ऊतक केवल बहिर्जनस्तरीय सेल शामिल हैं। ऊतक समान मोटाई की है कि सुनिश्चित करें। यदि नहीं, तो विश्लेषण से एसी हटा दें।
  9. बार्थ खारा (एमबीएस) 4 संशोधित 0.5x में एक Terasaki multiwell प्लेटों में प्रत्येक एसी रखें। अच्छी तरह के दौर नीचे के साथ संपर्क में है, नीचे अपने पिगमेंटड पशु पक्ष के साथ कुएं में एसी रखें।
    नोट: एक 0.1% BSA समाधान के साथ कोटिंग pipettes प्लास्टिक के लिए चिपकने वाला ऊतक के छोटे टुकड़े के आसंजन को रोकता है।
  10. एक micropipette P20 उपयोग कर प्रत्येक टोपी पर एक मनका रखें। यदि आवश्यक हो, ध्यान से टोपी के केंद्र में मनका के लिए जगह संदंश का उपयोग करें।
    नोट: एक वातानुकूलित माध्यम में भिगो जब, मोती गुलाबी रंग में रंग रहे हैं। सबसे सह चयन करेंlored मोती।
  11. Terasaki multiwell थाली ले जाए बिना आरटी पर 6 घंटे के लिए (18 से 22 डिग्री सेल्सियस तक) सेते हैं। मनका कम से कम 2 घंटे में एसी के लिए चिपक जाती है।
  12. पानी में भिगो कागजात के शीर्ष पर Terasaki multiwell थाली रखें। एक प्लास्टिक के कंटेनर के साथ थाली कवर।
    नोट: इस 'आर्द्रता चैम्बर' कुओं की अकाल वाष्पीकरण से बचाता है।
  13. भाई भ्रूण अपने कारक के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सही स्थिति में पहुंच गए हैं जब तक संस्कृति 0.5x एमबीएस या 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन में एसी 15-20 डिग्री सेल्सियस पर नमी कक्ष में (4.1 कदम देखें)।
  14. हौसले से तैयार 4% पीएफए ​​में 1 घंटे के लिए एसी को ठीक करें। पहले से (1.4 चरण) में वर्णित के रूप में 100% MeOH में एसी निर्जलीकरण।

3. पशु कैप सेल हदबंदी और Reaggregation एक Xenopus laevis neurula में ग्राफ्टिंग पहले

  1. कोट पेट्री डिश (60 मिमी) या कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस बाँझ पानी में या में 3% agarose के साथ 12 कुओं प्लेटें। ख को कवर करने के लिए पर्याप्त agarose जोड़ेंपेट्री डिश या अच्छी तरह से ottom। आर टी (18-22 डिग्री सेल्सियस) पर प्लेटों पूर्व गर्म। वैकल्पिक रूप से, निर्जलीकरण को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए प्लेटें संग्रहीत।
  2. तैयार कैल्शियम मुक्त Holtfreter खारा (60 मिमी NaCl, 0.7 मिमी KCl, 4.6 मिमी HEPES, 0.1% बीएसए (ए-7888 सिग्मा पीएच 7.6)) और Holtfreter खारा (60 मिमी NaCl, 0.7 मिमी KCl, 0.9 मिमी 2 CaCl, 4.6 मिमी HEPES, 0.1% बीएसए पीएच 7.6) 5। नोट: 2 CaCl का समाधान autoclaved नहीं किया जा सकता।
  3. Agarose लेपित कैल्शियम मुक्त Holtfreter खारा के साथ शीर्ष पर अच्छी तरह से भरें।
  4. पहले से वर्णित के रूप में अपने एसी को अलग-थलग करने के लिए ब्लासटुला या बहुत जल्दी गेसट्रुला भ्रूण तैयार (2.5-2.7 कदम)।
  5. कम से कम 15 या 30, छोटे एसी 21 अप करने के लिए अलग। का प्रयोग ठीक संदंश पशु पोल के बाहर ऊतक का एक छोटा सा वर्ग में कटौती। एसी ऊतक केवल बहिर्जनस्तरीय सेल शामिल हैं और इसलिए एक समान मोटाई की है। यदि नहीं, तो विश्लेषण से एसी हटा दें।
    नोट: पशु पोल Embry हैओ के पिगमेंटड हिस्सा है।
  6. एक में एसी स्थानांतरण अच्छी तरह से कैल्शियम मुक्त Holtfreter के नमक के साथ शीर्ष पर भरा agarose लेपित। उनकी पिगमेंटड ओर ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ के साथ एसी रखें।
    नोट: हदबंदी प्रक्रिया कैल्शियम मुक्त Holtfreter खारा में तेजी से शुरू होता है।
  7. कोशिकाओं बवाल शुरू करने के लिए कुछ मिनट प्रतीक्षा करें। ऊतकों के disaggregation के माध्यम से इस पर गौर करें। ठीक संदंश का प्रयोग, एसी के बाकी हिस्सों से पिगमेंटड परत को अलग किया और एक micropipette P20 के साथ उन्हें त्यागें। पूरा सेल हदबंदी की प्रक्रिया एक दूसरे से कोशिकाओं की जुदाई इंगित करता है।
    नोट: एक या दो पिगमेंटड परतों ग्राफ्टिंग के दौरान दृश्य करने में मदद करने के लिए फिर से एकत्रित explant भीतर छोड़ा जा सकता है।
  8. थाली के परिपत्र आंदोलनों का उपयोग कोशिकाओं केंद्र। एक micropipette का प्रयोग सावधानी से जितना संभव हो उतना मध्यम हटाने P1000। कोशिकाओं को छूने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  9. अच्छी तरह से करने के लिए कैल्शियम के साथ Holtfreter खारा के 1 मिलीलीटर जोड़ें। अलग एसी स्थानांतरणएक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में।
    नोट: 2 मिलीलीटर ट्यूबों उनकी दौर नीचे होने के कारण नहीं किया जा सकता।
  10. एक बेंच सेंट्रीफ्यूज (500 XG) के लिए 2,000 आरपीएम की अधिकतम गति पर centrifugation, 5 मिनट के द्वारा गोली कोशिकाओं। एक micropipette P1000 के साथ सावधानी से सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  11. अलग कोशिकाओं के लिए कैल्शियम के साथ Holtfreter खारा (60 मिमी NaCl, 0.7 मिमी KCl, 0.9 मिमी 2 CaCl, 4.6 मिमी HEPES के 20 μl जोड़ें, 0.1% बीएसए (ए-7888 सिग्मा पीएच 7.6) 5।
  12. अलग एसी, 3 (18-22 डिग्री सेल्सियस) आरटी पर घंटा 6 के लिए रखें।
    नोट: यह कोशिकाओं को फिर से कुल करने के लिए आवश्यक समय है। कोशिकाओं ट्यूब के नीचे एक छोटी सी गेंद फार्म के रूप में फिर से एकत्रीकरण दिख रहा है।
  13. 0.5x एमबीएस की या 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन के 1 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर जोड़कर ट्यूब के नीचे से ध्यान explant को अलग करें (4.1 कदम देखें)। एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक संयुक्त राष्ट्र लेपित थाली में explant हस्तांतरण।
  14. उनके नियंत्रण भाई बहन का उपयोग कर explants मंच। लंबी अवधि संस्कृति उपयोग एंटीबायोटिक दवाओं के लिए: kanamyसीआईएन (50 माइक्रोग्राम / एमएल), एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और gentamycine (50 माइक्रोग्राम / एमएल)।

पशु 4. ग्राफ्टिंग एक्स के तंत्रिका प्लेट में explants कैप्स laevis भ्रूण

  1. 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन की तैयारी (110 मिमी NaCl, 2 मिमी KCl, 1 मिमी सीए (सं 3) 2, 1 मिमी MgSO 4, 0.1 मिमी EDTA, 1 मिमी 3 NaHCO, 0.2X पीबीएस, 50 माइक्रोग्राम / एमएल gentamycin)। 4 डिग्री सेल्सियस पर विच्छेदन और दुकान के लिए अधिक से अधिक 1 सप्ताह के लिए मत रखना। पुराने गुटनिरपेक्ष आंदोलन agarose लेपित विच्छेदन व्यंजन (नीचे) की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. कोट पेट्री डिश छोटे छेद एक सिलिकॉन मोल्ड, या एक टेबल टेनिस रैकेट के कवर या तो का उपयोग किया गया है, जिसमें में 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन में 3% agarose के साथ (60 मिमी)।
    नोट: agarose पेट्री डिश के तल शामिल किया गया है। पेट्री डिश 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ भरने के लिए इतना है कि कुछ जगह छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से गैर सुखाने क्ले मॉडलिंग के साथ विच्छेदन व्यंजन बनाते हैं। मिट्टी के भीतर, विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान थोड़ा भ्रूण निचोड़। में छोटे छेद खोदोagarose गोल संदंश यह 'विच्छेदन डिश' का उपयोग कर विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान भ्रूण धारण करने के लिए मदद करता है।
  3. विच्छेदन उपकरण लीजिए: प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes, 22, दो ठीक विच्छेदन संदंश, P1000 micropipette और टिप्स, बढ़ाई 8-40X के साथ एक stereosmicroscope (एक गिलास पाश्चर विंदुक की नोक पर पैराफिन में एम्बेडेड भौं बाल के साथ बनाया) एक 'भौं चाकू' ऑप्टिक फाइबर गाइड के साथ एक उज्ज्वल प्रकाश स्रोत। स्वच्छ सभी विदारक उपकरण रखें; एक प्रयोग के बाद, एक बार 100% इथेनॉल के साथ, आसुत जल से उन्हें दो बार कुल्ला और सूखी। धातु विदारक उपकरण धूल से और आवश्यक आटोक्लेव यदि दूर की दुकान।
  4. चलो अलग और फिर से एकत्रित एसी (प्रोटोकॉल 3), और उनके भाई बहन एक्स वे मंच 13 (neurula) तक पहुंचने तक laevis भ्रूण Nieuwkoop और फैबर विकासात्मक तालिका 17 के अनुसार विकसित करना। 15 भ्रूण चरण के लिए तंत्रिका प्लेट चरण 13 के भीतर प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  5. सभी बाहर लेstereomicroscope के तहत बाद के चरणों।
  6. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, 0.2% BSA के साथ पूरित कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस में भ्रूण हस्तांतरण। पहले 20 में वर्णित के रूप में भ्रूण का पीतक झिल्ली को हटा दें। एक संदंश के साथ भ्रूण को ठीक करें। अन्य संदंश के पक्ष के साथ पीतक झिल्ली पिंच। मजबूती से झिल्ली होल्डिंग, धीरे-धीरे भ्रूण इसे बंद छील।
    नोट: भ्रूण के उदर (वनस्पति) की ओर से इस प्रक्रिया करो। भ्रूण तंत्रिका प्लेट को नुकसान नहीं है। भ्रूण पीतक झिल्ली हटाने चरण के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है, तो एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन युक्त एक 60 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण स्थानांतरण और 15 मिनट, घाव भरने की प्रक्रिया घटित करने के लिए के लिए पर्याप्त समय प्रतीक्षा करें।
  7. ताजा 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन के साथ शीर्ष पर विच्छेदन डिश में भरें।
  8. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, विच्छेदन डिश में उनकी पीतक झिल्ली बिना भ्रूण हस्तांतरण। में ऊपर भ्रूण पृष्ठीय पक्ष रखेंकुओं। हस्तांतरण की प्रक्रिया के दौरान भ्रूण एक्स के बाद से हवा तरल इंटरफेस के साथ संपर्क में प्रवेश करने की अनुमति नहीं है laevis सतह तनाव से lysed रहे हैं।
  9. एसी explant हस्तांतरण एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट या एक micropipette P1000 का उपयोग कर विच्छेदन प्लेट में grafted किया जाना है। पिपेट तरल के अंदर है, एक बार explants धीरे धीरे गंभीरता से नीचे सिंक, या बहुत धीरे से धक्का करने की अनुमति देते हैं।
  10. गोल संदंश के साथ भ्रूण बनाए रखें। भौं चाकू के साथ आप अपने explant का टुकड़ा भ्रष्टाचार करने का इरादा है, जहां तंत्रिका प्लेट में एक चीरा बनाते हैं।
    नोट: तंत्रिका प्लेट के पूर्वकाल झुकने एक मील का पत्थर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है 14 चरण में, यह diencephalon क्षेत्र (चित्रा 4) का प्रतीक है।
  11. , Neuroepithelium का एक छोटा सा टुकड़ा काट गोल संदंश और एक भौं चाकू का उपयोग कर। भौं चाकू के साथ explant के एक छोटे से टुकड़े में काट लें।
    नोट: explant के टुकड़े neuroepithelium ablated क्षेत्र के रूप में एक ही आकार और आकार के बारे में होना चाहिए। भौं चाकू और ठीक संदंश का उपयोग neuroepithelium चीरा में explant के टुकड़ा रखें। Explant तेजी से भ्रूण के लिए देता है कि सुनिश्चित करें।
  12. वैकल्पिक रूप से जगह में भ्रष्टाचार को बनाए रखने के लिए grafted भ्रूण पर कांच coverslip के एक टुकड़ा रखें। ऐसा करने के लिए, मोटे संदंश का उपयोग बहुत छोटे टुकड़ों में ठीक एक गिलास coverslip काटा। आकार लगभग 1.5 मिमी 2 है कि सुनिश्चित करें। 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन या पीबीएस का उपयोग संदंश युक्त एक पेट्री डिश में टुकड़े को विसर्जित कर दिया। यह हानिकारक से बचने के भ्रूण से भी बड़ा कांच के टुकड़े चुनें। भ्रूण एक छोटा सा चपटा हो जाएगा।
  13. चलती बिना कम से कम 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें, या केवल धीरे विदारक थाली ले जाने। भ्रूण 2 घंटा 30 मिनट के लिए ठीक है और यदि आवश्यक हो तो धीरे coverslip को दूर करते हैं। ध्यान से प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग, 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन से भरा एक स्वच्छ पकवान में grafted भ्रूण विंदुक।
    नोट: Grafted भ्रूण बैक्टीरिया या कवक संदूषण का विकास करते हैं। लंबी अवधि के लिए गकेनामाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल), एम्पीसिलीन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) और gentamycine (/ एमएल 50 ग्राम): ulture एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग करें।

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Representative Results

विभिन्न प्रजातियों, embryological जोड़तोड़, और विनियामक जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न में रूपात्मक विचारों के आधार पर, एक वैचारिक मॉडल तंत्रिका प्लेट अलग histogenic क्षेत्रों पैदा करने के लिए एक विकासात्मक ग्रिड को परिभाषित है कि अनुप्रस्थ और अनुदैर्ध्य खंडों में विभाजित किया गया है कि रखती है। तंत्रिका प्लेट में, अग्रमस्तिष्क, मध्यमस्तिष्क, hindbrain और रीढ़ की हड्डी के primordia सब पहले से ही (23-25 ​​में समीक्षा) gastrulation दौरान Antero-पीछे (एपी) अक्ष के साथ स्थापित कर रहे हैं। Neurulation के दौरान, histogenic क्षेत्रों जीन अभिव्यक्ति की स्थानिक प्रतिबंधित डोमेन के रूप में पता लगाया जा सकता है। नियामक जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न के आधार पर, अग्रमस्तिष्क उत्स prosomeres (पी) नामक अलग histogenic क्षेत्रों उत्पन्न कि छह अनुप्रस्थ खंडों में बांटा गया है। प्रत्येक prosomere एक उदर (बेसल) और (26,27 में समीक्षा) एक पृष्ठीय (alar) भाग में बांटा गया है। उभयचरों में, prosomere 2(P2) अधिचेतक और चेतक के लिए और इसके आयोजक (28,29 में समीक्षा) जेड ओना एल imitans मैं ntrathalamica (zli) 8 को जन्म देता है।

आंकड़े पर 1 एक्स के फ्लैट बढ़ते दिखाए गए हैं laevis और एक्स tropicalis पूर्वकाल तंत्रिका चरणों 30, 32 पर ट्यूब, और WM-पकवान के बाद 35। WM-ish प्रोटोकॉल कि telencephalon और पी 3 के निशान fezf2 प्रतिलेखन कारक के लिए जांच का उपयोग 1, P2, cortical hems और मध्यमस्तिष्क, Iroquois -1 (irx1) और Iroquois -3 (irx3) के निशान है कि barhl2 के अनुसार किया गया है कि क्रमशः मार्क दुम p2 और alar p2 और zli, बेसल अग्रमस्तिष्क और मध्यमस्तिष्क (चित्रा 1E) के निशान है कि morphogen श्श्श के लिए। विभिन्न जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का एक तुलनात्मक विश्लेषण से पता चलता है पूर्वकाल सीमा उस barhl की2 P2 अभिव्यक्ति पी 3 में fezf2 अभिव्यक्ति की दुम की सीमा abuts (चित्रा 1 ए)। Irx3 सह व्यक्त भविष्य zli (चित्रा 1 बी) में श के साथ है। P2 irx1 अभिव्यक्ति डोमेन के अंदर श्श्श (चित्रा 1 सी) 8 की है कि पूरक है। एक्स में barhl2 की अभिव्यक्ति पैटर्न चरण 35 पर tropicalis चित्रा -1 में दिखाया गया है। विकासशील उभयचर अग्रमस्तिष्क में इन जीनों की अभिव्यक्ति प्रदेशों का एक योजनाबद्ध आरेख चित्रा 1E में प्रदान की जाती है।

प्रोटोकॉल 2 एसी explants में जांच की गई श्श्श अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने श्श्श में भिगो आयनों विनिमय राल मोतियों की क्षमता का उपयोग करना। एक्स चरण भ्रूण barhl2, के साथ मिलकर पूर्वकाल neuroepithelial inducer नोगिन के लिए एन्कोडिंग mRNAs के साथ 4 और 8 कोशिकाओं में 4 पशु blastomeres में इंजेक्ट किया गया laevis ओएक इंजेक्शन अनुरेखक के रूप में TX2, irx3 और GFP। विरोधी बीएमपी कारक नोगिन की अभिव्यक्ति बीएमपी मार्ग को रोकता है और एसी 3 कोशिकाओं को एक तंत्रिका पहचान देता है। हम Anteriorised पशु कैप (एएसी) के रूप में नोगिन व्यक्त एसी को देखें। Blastocoel छत explants स्रावित एन टर्मिनल भाग की, एक वातानुकूलित माध्यम (मुख्यमंत्री) में भिगो एक आयनों विनिमय राल मनका के साथ संपर्क में 18 डिग्री सेल्सियस पर 2. एएसी 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे प्रोटोकॉल में वर्णित युक्त तैयार है, या नहीं कर रहे थे चूहे से morphogen ध्वनि का हाथी (एन श्श्श)। अंतर्जात श्श्श की अभिव्यक्ति ISH (चित्रा 2) द्वारा विश्लेषण किया गया था। Xenopus श्श्श (Xshh) की अभिव्यक्ति एन श्श्श (चित्रा 2 बी) के बिना मुख्यमंत्री में भिगो मनका के साथ संपर्क में कोशिकाओं में एन-श्श्श नहीं बल्कि साथ मुख्यमंत्री में भिगो मनका के साथ संपर्क में कोशिकाओं में पाया जाता है।

प्रोटोकॉल 3 का उपयोग कर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की क्षमता एक anoth से अलग करने के लिएएर जांच की गई। एक्स laevis भ्रूण mRNAs के साथ या otx2, barhl2 और irx3 बिना नोगिन के लिए एन्कोडिंग के साथ स्टेज 4 और 8 कोशिकाओं में 4 पशु ब्लास्टोमेरेस में इंजेक्शन के रूप में संकेत, उपयोग कर रहे थे ßGal या GFP ट्रेसर (चित्रा 3) के रूप में। स्टेज 8/9 एसी अलग कर दिया गया और ßGal- और GFP व्यक्त कोशिकाओं दोनों युक्त मिश्रित neuroepithelial कोशिकाओं से बना explants उत्पन्न करने के लिए फिर से एकत्रित। reaggregated explants 18 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत थे। ßGal गतिविधि 30 (चित्रा 3) के अनुसार लाल रंग में पता चला था। कोशिकाओं के व्यवहार को फिर से एकत्रित explants के भीतर अपने स्थानीयकरण का पालन करके मनाया गया। एएसी कोशिकाओं Otx2 (लाल) व्यक्त एएसी कोशिकाओं के साथ मिश्रित कर रहे हैं, जहां explants में, ßGal व्यक्त कोशिकाओं GFP व्यक्त कोशिकाओं से स्वतंत्र रूप से intermingled कोशिकाओं के दोनों प्रकार के (चित्रा 3 बी, 3 सी) को अलग नहीं है। इसके विपरीत, मेंकोशिकाओं (GFP) Otx2 व्यक्त जहां explants Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) -expressing कोशिकाओं (ßGal) के साथ मिश्रित कर रहे हैं, ßGal व्यक्त कोशिकाओं (लाल) एकजुट पैच फार्म और (पुनः एकत्रित explant के भीतर समान रूप से फैला हुआ नहीं है चित्रा 3 डी, 3E)।

प्रोटोकॉल 4 का उपयोग करना, प्रोग्राम किया एसी कोशिकाओं के व्यवहार विवो में जांच की गई। एक्स भ्रूण barhl2 और irx3 के साथ अकेले या एक साथ या तो otx2 साथ नोगिन के लिए एन्कोडिंग mRNAs के साथ 4 और 8 सेल चरणों में 4 पशु blastomeres में इंजेक्ट किया गया laevis। ßGal अनुरेखक के रूप में इस्तेमाल किया गया था। समानांतर में, भ्रूण इसी तरह mRNAs नोगिन के लिए एन्कोडिंग और चूहे से morphogen श्श्श की स्रावित एन टर्मिनल भाग (एन-श) के साथ इंजेक्शन थे। चरण 8/9 में एसी explants अलग कर दिया गया और तुरंत neuroepit से बना मिश्रित explants उत्पन्न करने के लिए एकत्रित कर रहे हैंhelial कोशिकाओं या तो व्यक्त एन श्श्श और Otx2, या व्यक्त एन श्श्श और Otx2, Barhl2 और Irx3 (BOI3)। मिश्रित explants के छोटे टुकड़े एक्स के तंत्रिका प्लेट में grafted थे मंच grafted कोशिकाओं ßGal धुंधला (लाल) के साथ चिह्नित किया गया 14. पर भ्रूण laevis। चरण 35 पर अंतर्जात श्श्श की अभिव्यक्ति ISH द्वारा विश्लेषण किया गया था। एक्स के पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट में grafted जब भ्रूण, BOI3 और एन श्श्श व्यक्त कोशिकाओं से बना मिश्रित explants zli कोशिकाओं के विशिष्ट दो सुविधाओं का विकास किया laevis: grafted कोशिकाओं Xshh व्यक्त की और पूर्वकाल neuroepithelial कोशिकाओं (चित्रा 3 सी) से अलग। कोशिकाओं को व्यक्त करने और एन Shh- एक्स में grafted कर रहे हैं - मिश्रित Otx2 से बना explants जब विपरीत, तंत्रिका प्लेट laevis, grafted कोशिकाओं श्श्श व्यक्त नहीं किया और अपने पड़ोसियों (चित्रा 3 बी) 8 से अलग नहीं किया था।


एक्स से चित्रा 1. फ्लैट पर चढ़कर तंत्रिका नलियों laevis और एक्स tropicalis पूरे माउंट डबल ISH भ्रूण (ए - डी)। WM-ish उपयोग किया जाता है fezf2, (ए - सी) पर जांच के रूप में barhl2, irx1, irx3, और श एक्स चरणों 30, 32 में भ्रूण laevis, और 35 और (डी) एक्स चरण 35 पर tropicalis भ्रूण संकेत के रूप में। प्रतिनिधि भ्रूण के तंत्रिका नलियों विच्छेदित और विच्छेदित न्यूरल ट्यूब के एक पक्ष को देखने, पृष्ठीय अप, पूर्वकाल बाएं से दिखाए जाते हैं प्रोटोकॉल 1 में वर्णित के रूप में फ्लैट बढ़ रहे हैं। मार्करों और चरणों संकेत कर रहे हैं। P2 के व्याख्यान चबूतरे वाला और दुम सीमाओं तीर के साथ संकेत कर रहे हैं। (एसी) पैमाने पर पट्टी 0.5 मिमी के लिए खड़ा है। (डी) एसकेल बार 0.1 मिमी के लिए खड़ा है। । St.30 पर अग्रमस्तिष्क मार्कर (ई) योजनाबद्ध barhl2 अभिव्यक्ति डोमेन रची लाइनों में संकेत दिया है; अभिव्यक्ति के क्षेत्रों fezf2 (गुलाबी), श (लाल), irx3 (पीला) और irx1 (हरा) के लिए दिखाए जाते हैं। पी prosomere के लिए खड़ा है। P2 के शीर्ष पर स्थित पीनियल ग्रंथी दिखाया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
आयनों विनिमय राल मोतियों के साथ संपर्क के माध्यम से प्रोग्राम explants में श अभिव्यक्ति की चित्रा 2. प्रेरण। छोटे एसी अनुरेखक के रूप में GFP के साथ, नोगिन, barhl2, otx2, और irx3 के लिए mRNA एन्कोडिंग के साथ इंजेक्शन भ्रूण से तैयार कर रहे हैं। एएसी च खड़ाया Anteriorised पशु कैप। Barhl2, Otx2 और Irx3 (एएसी BOI3) व्यक्त एएसी explants एक वातानुकूलित माध्यम में भिगो एक मनका (मुख्यमंत्री), या तो एन श्श्श युक्त है, या नहीं के रूप में संकेत के साथ संपर्क में 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं। explants Xenopus (एक्स) श की अभिव्यक्ति के लिए ISH से विश्लेषण कर रहे हैं। पैमाने पर पट्टी 0.5 मिमी के लिए। खड़ा है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
फिर से एकत्रित explants में सेल अलगाव व्यवहार की चित्रा 3. विश्लेषण। (ए)   संकेत के रूप में एक्स laevis भ्रूण नोगिन, otx2, barhl2 और irx3 के लिए mRNA एन्कोडिंग इंजेक्शन के साथ कर रहे हैं। ßGal और GFP अनुरेखक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। चरण में 8/9 छोटा एसी तैयार कर रहे हैं , अलग और GFP / ßGal मिश्रित प्रकार की कोशिकाओं से बना explants उत्पन्न करने के लिए फिर से एकत्रित। explants 18 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं और ßGal गतिविधि (लाल) से पता चला है। (बी - ई) दिखाए जाते हैं संकेत के रूप में प्रोटीन व्यक्त मिश्रित कोशिकाओं से बना प्रतिनिधि explants। एएसी Anteriorised पशु कैप के लिए खड़ा है। एसी कोशिकाओं को व्यक्त नोगिन (GFP) के साथ मिश्रित जब (बी, सी) नोगिन और Otx2 (ßGal) व्यक्त एसी कोशिकाओं को बेतरतीब ढंग से फैला है। (सी) (बी) के बढ़े हुए देखने। Barhl2, Otx2 और Irx3 (BOI3) (ßGal) व्यक्त (डी) एएसी कोशिकाओं regrouped और Otx2 (GFP) व्यक्त एएसी कोशिकाओं से अलग। (ई) (डी) के बढ़े हुए देखने। (बी, डी) पैमाने पर पट्टी 0.5 मिमी के लिए खड़ा है। (सी, ई) पैमाने पर पट्टी 0.2 मिमी के लिए खड़ा है।जी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एक चरण 14 भ्रूण के तंत्रिका प्लेट में grafted जब चित्रा 4. प्रोग्राम explants उनके विकास सुविधाओं का प्रदर्शन (ए) प्रायोगिक योजना:। संकेत के रूप में एएसी mRNAs के साथ इंजेक्शन भ्रूण से तैयार कर रहे हैं। मंच पर blastocoel की छत से 8/9 कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं और ßGal (लाल) व्यक्त मिश्रित प्रकार की कोशिकाओं से बना explants उत्पन्न करने के लिए एकत्रित कर रहे हैं। उनके भाई बहन पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट के भीतर एक चीरा में डाल दिया है चरण 14. मिश्रित explant (हरी आयत) का एक छोटा सा टुकड़ा पहुंच गया जब तक explants सुसंस्कृत हैं। मंच 35. संचालित भ्रूण एक्स का उपयोग कर WM-ish से विश्लेषण कर रहे हैं जब तक संचालित भ्रूण बड़े हो रहे हैं laevis श्श्श (Xshh) जांच के रूप में। ßGal गतिविधि लाल एसीसी में पता चला है30 को Ording। (बी, सी) मंच के grafted पक्षों 35 प्रतिनिधि न्यूरल ट्यूब के दिखाए जाते हैं, की ओर देखने के लिए, पृष्ठीय ऊपर, पूर्वकाल छोड़ दिया। Otx2 और एन श्श्श व्यक्त मिश्रित एएसी साथ grafted (बी)। Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) और एन श्श्श व्यक्त मिश्रित एएसी साथ grafted (सी)। Grafted कोशिकाओं को एक लाल सितारा के साथ संकेत कर रहे हैं। गुलाबी स्टार भावी diencephalon इंगित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तंत्रिका विकास (3,31,32 में समीक्षा) आसपास के ऊतकों से सेलुलर विकास कार्यक्रमों और संकेतों के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया द्वारा करवाया जाता है। यहाँ हम एक्स में इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रोटोकॉल का एक सेट का वर्णन बाह्य और तंत्रिका भाग्य दृढ़ संकल्प और इन विट्रो और इन विवो में तंत्रिका morphogenesis में शामिल आंतरिक कारकों का पता लगाने के लिए भ्रूण laevis। इन प्रोटोकॉल एक्स पर इस तरह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, tropicalis भ्रूण, हालांकि एक्स tropicalis भ्रूण एक्स तो चार बार छोटे होते हैं भ्रूण laevis। दोनों की जरूरत के लिए इस्तेमाल किया संदंश और टंगस्टन सुइयों महीन हो। जब संभव हो, एक्स का उपयोग laevis।

एक्स के सटीक दृश्य laevis और एक्स tropicalis तंत्रिका histogenic क्षेत्रों WM- ISH से विच्छेदित न्यूरल ट्यूब की ऊतकीय फ्लैट बढ़ते प्रयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। इस तकनीक को एक्स पर सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया था चरण 26 से भ्रूण laevisचरण 45 (चित्रा 1) और एक्स पर tropicalis 45 8,33 चरण के लिए चरण 30 से भ्रूण। पुराने भ्रूण तो युवा भ्रूण काटना करने के लिए आसान कर रहे हैं। इस तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए आसान है। यह विकास के विभिन्न चरणों पर न्यूरल ट्यूब पर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, अलग-अलग या संयुक्त, का विश्लेषण परमिट। इस प्रोटोकॉल के साथ यह दूसरे के साथ एक न्यूरल ट्यूब के एक तरफ की तुलना करने के लिए आसान है। इस Xenopus GOF और LOF प्रयोगों में बहुत उपयोगी है। न्यूरल ट्यूब के इंजेक्शन के पक्ष में मनाया दोष सीधे नियंत्रण पक्ष पर मनाया सामान्य विकास की घटनाओं के साथ तुलना की जा सकती। इस रणनीति के एक्स में GOF और LOF phenotypes का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है laevis 8,33 भ्रूण। इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम भ्रूण के ऊतकों के सही निर्धारण है। एक अधूरी निर्धारण न्यूरल ट्यूब से बाहरी झिल्ली के कुशल टुकड़ी को रोकता है। न्यूरल ट्यूब के प्री-विच्छेदन एसआईटी में प्रवेश की सुविधायू जांच। हालांकि एक बार अलग है, यह तंत्रिका नलियों कम करने के लिए आसान है। यह किसी भी नुकसान को रोकने के लिए ISH प्रक्रिया के दौरान भ्रूण का हिस्सा रखने की सलाह दी जाती है।

इन सभी प्रयोगों के लिए इस्तेमाल भ्रूण मजबूत हो सकता है और अच्छी तरह से ठीक करने की जरूरत की जरूरत है। अस्वस्थ भ्रूण के किसी भी बैच त्यागें। चरण 13 और मंच के बीच 15 एसी और भ्रष्टाचार explants काटना करने के लिए आदेश में यह एक्स विकसित करने के लिए संभव है (12-18 डिग्री सेल्सियस और 18-20 डिग्री सेल्सियस) से विभिन्न तापमान पर explants और भ्रूण laevis। उल्लेखनीय एक्स भ्रूण कोशिकाओं को किसी भी बाहरी पोषक तत्व के अलावा बिना कई दिनों के लिए अपने अस्तित्व के लिए अनुमति देने के लिए पर्याप्त जर्दी शामिल laevis। भ्रूण, एसी, या explant के किसी भी हस्तांतरण प्रक्रिया भ्रूण के ऊतकों को नुकसान नहीं करने के लिए सावधानी से किया जाना है। यह आवश्यक हो तो उसके अंत में एक टिप कटौती के साथ एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट या micropipette या तो उपयोग करने की सलाह दी जाती है। टिप अंत के व्यास भ्रूण का आकार, या explant के आकार को समायोजित किया जाता है, का तबादला किया जाना है।यह नोट के लायक है, एक 0.1% BSA समाधान के साथ कोटिंग pipettes प्लास्टिक के लिए ऊतक के छोटे-छोटे टुकड़ों के आसंजन को रोकता है।

एसी explants मजबूर जीन अभिव्यक्ति के माध्यम से, या एक समय और अंतरिक्ष नियंत्रित तरीके से बाह्य कारकों के लिए जोखिम के माध्यम से प्रोग्राम किया जा सकता है। हम एक explant और एक मनका के बीच सीधे संपर्क के माध्यम से स्थानीय प्रेरण अनुमति के लिए एक तकनीक का वर्णन है। यदि आवश्यक हो तो मोती आगे संदंश का उपयोग खंडित किया जा सकता है। अन्य पहले वर्णित रणनीतियों की तुलना में, इस तकनीक का शुद्ध कारकों, एक सटीक समय खिड़की में, अकेले या संयोजन में साथ स्थानीय प्रेरण के परीक्षण की अनुमति देता है।

सेल हदबंदी और फिर से संघ 34 के एक पहले से वर्णित दृष्टिकोण का प्रयोग, यह बैठा और मिश्रित एसी explants 8 में सेल गतिशीलता क्षमता, सेल अलगाव व्यवहार, और डिब्बे सीमाओं के गठन की जांच करने के लिए संभव है। सेल हदबंदी प्रक्रिया कम से कम 15 मिनट में शुरू होता है। Shakin से बचेंजी हदबंदी चरण के दौरान प्लेट कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए। एसी पिगमेंटड परतों में अच्छी तरह से अलग कर देना नहीं है। यह हदबंदी चरण के दौरान उन्हें हटाने की सिफारिश की है। एसी पिगमेंटड परतों की एक जोड़ी फिर से एकत्रित explant में छोड़ दिया जाता है। यह भ्रष्टाचार visualizing में मदद करता है। बाद में यह विकास के चरणों में विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है।

एक तंत्रिका प्लेट विस्तृत है में इस पांडुलिपि में एक प्रोटोकॉल मिश्रित explants प्रत्यारोपण के लिए। Xenopus भ्रूण में, तंत्रिका प्लेट चरण 13 और मंच 15. इन सभी चरणों में neuroepithelium भीतर प्रत्यारोपण के लिए इसलिए उपयुक्त हैं के बीच खुला है। एक्स चिपकने वाला गुण समय के साथ बदल ऊतकों laevis। यह एक समान विकास के चरण में एक मेजबान में एसी explants भ्रष्टाचार के लिए महत्वपूर्ण है। प्रारंभिक विकास के चरणों में, एक्स बहुत तेजी से 3/4 गुटनिरपेक्ष आंदोलन की मरम्मत में उगाया भ्रूण laevis। कुछ भ्रूण पीतक झिल्ली को हटाने के दौरान क्षतिग्रस्त हो गया है, तो यह 15 मिनट इंतजार करने के लिए उपयोगी हो सकता है,जो घाव भरने की प्रक्रिया घटित करने के लिए आवश्यक समय है। निवेशन grafted मेजबान ऊतक पर गिलास coverslip का एक टुकड़ा डाल द्वारा इष्ट किया जा सकता है, लेकिन यह एक आवश्यकता नहीं है। घाव भरने की प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न बल grafted कोशिकाओं हटा सकते हैं। भ्रष्टाचार एक coverslip साथ के रूप में, बाहरी दबाव के साथ में यह मजबूर किया जाता है जब मेजबान भ्रूण की आकृति विज्ञान बेहतर संरक्षित है। भ्रष्टाचार की सफलता का आकलन करने के लिए, एक फ्लोरोसेंट ट्रेसर explants में इंजेक्ट किया जा सकता है। न्यूरल ट्यूब बंद कर देता है जब तक grafted भ्रूण के भीतर फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की उपस्थिति देखे जा सकते हैं। एसी संस्कृति और ग्राफ्टिंग प्रयोगों में बड़ी खामी बैक्टीरिया या कवक संदूषण की आवृत्ति है। प्रोटोकॉल के हर कदम पर पकवान संक्रमण से बचने के रूप में अक्सर संभव के रूप में साफ या बाँझ सामग्री और बाँझ समाधान का प्रयोग करें। Grafted भ्रूण की लंबी अवधि संस्कृति के लिए हमेशा एंटीबायोटिक दवाओं और 15 डिग्री सेल्सियस के तापमान का उपयोग करें। एसी explants या agarose के साथ भ्रूण के लंबे समय तक संपर्क से बचें। हम observयह explant के जीवन प्रत्याशा कम कर सकते हैं कि एड। ग्राफ्टिंग तकनीक शक्तिशाली है, लेकिन समय लगता है। यह इसके साथ भाग्य दृढ़ संकल्प cues के लिए स्क्रीन करने के लिए है, लेकिन पहले से अपनी पसंद के ऊतक पर पर्याप्त जानकारी प्राप्त करने के लिए उचित नहीं है।

उसके परंपरागत फायदे के अलावा, Xenopus में हाल ही में आनुवंशिक अग्रिमों इस के लिए रास्ता खोल दिया मॉडल प्रणाली गहरी आरएनए अनुक्रमण और Chromatide Immunoprecipitation अनुक्रमण (चिप सेक) 5,35 द्वारा बड़े पैमाने पर जीनोमिक विश्लेषण का उपयोग जीन विनियामक नेटवर्क का पता लगाने के लिए। उत्कृष्ट RNAseq और जल्दी भ्रूण के विकास को कवर चिप Seq संदर्भ डेटा सेट कर रहे हैं। चिप seq विश्लेषण एक खामियों की सामग्री की एक बड़ी राशि जमा करने की जरूरत नहीं है। एसी explants की प्रोग्रामिंग एक विशिष्ट तंत्रिका ऊतक की एक बड़ी राशि का उत्पादन परमिट, और आंशिक रूप से कम से कम, यह तकनीकी सीमा पर काबू पाने में मदद करता है।

विकास कार्यक्रमों के अंतर्निहित न्यूरल ट्यूब अंगogenesis काफी हद तक विशेष रूप से रीढ़ में, संरक्षित कर रहे हैं। उभयचर का उपयोग कर प्राप्त सूचना कशेरुकी विकास 25,32,36-38 अंतर्निहित सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं की समझ में मदद करता है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति पुनर्योजी चिकित्सा और दवाओं की खोज के क्षेत्र में अनुसंधान के लिए प्रवेश द्वार खोल दिया है। IPSCs प्रतिलेखन कारकों के संयोजन का उपयोग कर दैहिक कोशिकाओं से प्रोग्राम किया जाता है। स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रोग्रामिंग संकेतों की खोज चल रही है। assays दवा स्क्रीनिंग में इस्तेमाल किया जा सकता है कि इन विट्रो में तंत्रिका व्युत्पन्न प्रकार की कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक मतलब प्रदान यहां का वर्णन है। उन्होंने यह भी IPSCs 39,40 के आगे reprogramming के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि तंत्रिका भाग्य निर्धारकों के लिए परीक्षण करने के लिए एक सस्ता और तेज तरीका प्रदान करते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde VWR  20909.290 Toxic
anion exchange resin beads Biorad 140- 1231
Bovine Serum Albumin  SIGMA A-7888 For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine  GIBCO 15751-045  antibiotic
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906  for bead preparation

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 108 विकास जीव विज्ञान, भ्रूण तंत्रिका भ्रष्टाचार अलगाव डिब्बे ध्वनि हाथी अग्रमस्तिष्क IPSC स्टेम
स्टेम सेल की तरह<em&gt; Xenopus</em&gt; भ्रूण Explants अर्ली तंत्रिका विकास संबंधी सुविधाओं का अध्ययन करने के लिए<em&gt; इन विट्रो</em&gt; और<em&gt; Vivo</em
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Durand, B. C. Stem cell-like… More

Durand, B. C. Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (108), e53474, doi:10.3791/53474 (2016).

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