Introduction
Il sistema nervoso vertebrato emerge dalla piastra neurale come uno strato omogeneo di cellule neuroepiteliali. Comprendere come sono indotte programmi di sviluppo, codificati, e stabilito durante la regionalizzazione della piastra neurale è, allo stato attuale, un obiettivo importante nella biologia dello sviluppo. Rispetto ad altri sistemi, il sperimentalmente suscettibili di Xenopus embrioni è un modello di riferimento per analizzare i primi passi di sviluppo neurale 1,2. E 'facile ottenere un gran numero di embrioni, e sviluppo esterno dà accesso ai primi passi della neurulazione 3. Molti strumenti sono a disposizione per manipolare sperimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) lo sviluppo embrionale. Micro-iniezione di mRNA o Morpholinos (MO), tra MO inducibile, insieme agli strumenti biochimiche e farmacologiche, permette di guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (OL) e determinata alterazione delle vie di segnalazione 4,5 controllato. Il blastocoel tetto ectoderma, situato attorno al polo animale di un blastula, o gastrula embrione molto precoce, e denominato 'Cap Animal' (AC), è una fonte di cellule pluripotenti che può essere programmato da manipolazione genica prima espianti preparazione. In questo manoscritto sono protocolli dettagliati per usare X. espianti laevis AC per testare in vitro e in vivo dei meccanismi molecolari e dei processi cellulari di sviluppo neurale sottostante.
Una tecnica è presentata, permettendo l'osservazione multa di modelli di espressione genica in un tubo neurale girino Xenopus, un passo preliminare per l'identificazione di segnali determinazione destino. Considerando che l'osservazione di tessuti piatto montato è comunemente usato nello studio di embrioni di pollo 6, non è stato correttamente descritto in Xenopus. La manipolazione dell'espressione genica mediante iniezione di mRNA sintetico o MO nei blastomeri di 2 o 4 embrioni stadio cella permette la programmazione di ACespianti 4. Per esempio l'inibizione della proteina morfogenetica (BMP) percorso dalla espressione del movimento anti-BMP fattore Noggin, dà un'identità neurale per celle AC 3. Il protocollo è dettagliata per eseguire esposizione locale e comandato a tempo di espianti AC ai segnali estrinseci tramite contatto diretto con una perlina di resina scambiatrice di anioni. Finalmente una tecnica è descritta per testare le caratteristiche di sviluppo delle progenitori neurali in vivo per il trapianto di espianti miste preparate da cellule distinte programmato dissociate e ri-associati.
L'embrione rana è un potente modello per lo studio precoce sviluppo neurale dei vertebrati. Combinando la manipolazione dell'espressione genica di espianto colture in vitro fornisce importanti informazioni per lo studio di neuroepitelio regionalizzazione, la proliferazione e morfogenesi 7-12. La programmazione di espianti AC consentito lo sviluppo di un cuore funzionale ex vivo 13,14. L'usodi espianto innesto 15 ha portato all'individuazione dello switch trascrizionale minimo indurre il programma di differenziazione cresta neurale 16. Il limitans zona per intrathalamica (ZLI) è un centro di segnalazione che secerne sonic hedgehog (Shh) per controllare la crescita e la regionalizzazione del prosencefalo caudale. Quando continuamente esposto a Shh, le cellule neuroepiteliali coexpressing il fattore geni tre trascrizione - Barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (Otx2) e Iroquois-3 (irx3) - acquistano due caratteristiche del vano ZLI: la competenza a esprimere shh, e la capacità di separare dalle cellule anteriore piastra neurale. Come un sistema modello, l'induzione di un destino ZLI in cellule neuroepiteliali verrà presentato 8.
Questi protocolli mirano a fornire semplici, a basso costo, e strumenti efficienti per i biologi dello sviluppo e altri ricercatori per esplorare il mec fondamentalehanisms di comportamenti chiave delle cellule neurali. Tali protocolli sono molto versatili e permettono la ricerca di una vasta gamma di segnali neurali determinazione estrinseci ed intrinseci. Esso consente a lungo termine in analisi in vivo di impegno lignaggio neurale, interazioni induttive e comportamenti delle cellule.
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Protocol
Gli esperimenti sono conformi alle normativa nazionale ed europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e con i principi sanciti a livello internazionale di sostituzione, riduzione e perfezionamento.
1. Flat-montaggio Xenopus laevis Girini anteriore del tubo neurale Dopo tutto il montaggio ibridazione in situ
- Ottenere X. laevis embrioni secondo le procedure standard 4 e invecchiare fino a raggiungere neurula palco 26 e più anziani (secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17.
- Fix X. laevis tadpoles incubandoli in una soluzione di 4% paraformaldeide (PFA). Rock and ruotare gli embrioni in un flaconcino di vetro da 2 ml, 1 a 1,5 ore a temperatura ambiente per la fase 26 di mettere in scena 38 embrioni, 2 ore a temperatura ambiente per gli embrioni in fasi successive.
ATTENZIONE: PFA è tossico per contatto e un sospetto cancerogeno. Dovrebbe essere manipolato sotto cappa.
NOTA: X One laevis nidiata èdi solito fissato in un flaconcino di vetro da 2 ml, ma un grande fiala di vetro può essere utilizzato. - Lavare gli embrioni nella stessa fiala utilizzando 1x PBS con 0,1% di Tween (PBT), 3 minuti a temperatura ambiente, due volte.
NOTA: Se non altrimenti specificato la PBS usato è con o senza calcio e magnesio. - Disidratare embrioni in 100% di metanolo (MeOH) per almeno 12 ore a RT nello stesso flaconcino. Modificare il MeOH 100% almeno due volte sotto il cofano con una micropipetta plastica.
NOTA: Il MeOH assume una colorazione giallastra come lipidi in essa disciolti. Attenzione il MeOH è tossico per inalazione e deve essere manipolato sotto una cappa. - Reidratare gli embrioni utilizzando la stessa flaconcino attraverso una serie graduata di bagni MeOH: MeOH 75% in PBS MeOH 50% in PBS MeOH 25% in PBS PBS due volte, ogni vasca 5-10 min a RT. Le soluzioni MeOH vengono modificate sotto il cofano con una micropipetta di plastica.
- Usando una pipetta di plastica, trasferire l'embrione deve essere sezionato in una piastra di Petri 60 millimetri riempito al top con PBT. Utilizzando due pinza sottile curarimuovere completamente gli occhi inserendo una pinza sottile tra gli occhi e il tubo neurale, a livello del gambo ottica. Staccare gli occhi dal tubo neurale. Introdurre con attenzione le pinze sotto l'ectoderma sovrastanti il tubo neurale. Con cura, staccare l'ectoderma partendo da dietro la testa e gettarlo.
- Eseguire un ISH doppia o singola con digossigenina-etichettati o sonde fluoresceina come descritto in precedenza 18,19.
- Dopo la ISH trasferire gli embrioni in una nuova 60 mm piatto Petri riempito l'alto con PBT con una pipetta di plastica.
- Utilizzando una pinza sottile staccare con cura il tubo neurale dal resto dell'embrione. In questa fase, il tubo neurale anteriore separa dal tubo posteriore neurale. Staccare con cautela restanti parti del ectoderma sovrastanti il tubo neurale, la notocorda che è vagamente collegato al di sotto del tubo neurale, le vescicole otic e restanti parti del mesoderma. Assicurarsi che il tubo neurale è privo di appendiciin questa fase.
NOTA: per evitare di danneggiare il tubo neurale eseguire tutte neurali trasferimento tubo / embrione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta, se necessario, con un taglio punta alla sua estremità. Il diametro della punta fine è adeguata alle dimensioni del tubo neurale. - Trasferire il tubo neurale sezionato (vedi nota passo 1.9) in una provetta da 1,5 ml piena di glicerolo al 50% diluito in PBS. Attendere i tubi neurali sono caduti al fondo della soluzione di glicerolo, di solito O / N a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione di glicerolo al 50% / PBS usando una micropipetta P1000 e aggiungere nello stesso tubo 1,5 ml di una soluzione di 90% glicerolo / PBS usando una micropipetta P1000. Attendere i tubi neurali cadono sul fondo della soluzione 90% glicerolo / PBS, solitamente O / N a 4 ° C.
NOTA: per l'archiviazione a lungo termine, di utilizzare il 90% di glicerolo / PBS più antibiotici per prevenire lo sviluppo di batteri. - Trasferire i tubi neurali su una lastra di vetro o un vetrino da microscopio con una pipetta di plastica trasferimento.
- Dissetta i tubi neurali lungo la dorsale e ventrale linee mediane utilizzando aghi di tungsteno. Durante questo passo i tubi neurali sono mantenute in 90% glicerolo / PBS.
- Montare le due lati del tubo neurale in 90% glicerolo / PBS utilizzando anelli di rinforzo coperto con vetrino coprioggetti.
- Fissare i coprioggetti con vernici e tenere a 4 ° C.
2. Cap Animal Espianti induzione utilizzando biglie scambio di anioni resina
- Trasferire 100 ml di perle di resina a scambio anionico in una provetta da 2 ml con una micropipetta P1000. Lavare le perline almeno cinque volte consecutive con acqua distillata sterile. Lasciare le perline per sedimentare sul fondo del tubo e sostituire l'acqua distillata sterile utilizzando una micropipetta P1000. Non toccare le perline.
- Lasciare le perline ammollo O / N in una provetta 2 ml riempita con acqua distillata sterile con Bovine Serum Albumin (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C.
- Due ore prima di raccogliere l'ACS, luogo la metà delle perline in un nuovo 1,5 mltubo con una micropipetta P1000. Sostituire l'acqua distillata sterile con 500 ml di mezzo contenente la molecola da testare per il suo potenziale induttivo, o noti per indurre un destino specifico. Mantenere l'altra metà delle perline, in quanto saranno utilizzati come controllo negativo.
- Incubare le perle a 4 ° C per almeno 2 ore.
- Eseguire tutte le fasi successive allo stereomicroscopio ed eseguire tutti i trasferimenti di CA con una micropipetta.
- Trasferire blastula o embrioni molto precoci gastrula in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA con una pipetta di trasferimento di plastica.
NOTA: Gli embrioni in via di sviluppo in C portata blastula e gastrula fasi 12 ° in 20-24 ore. - Rimuovere membrana vitellina dell'embrione con pinze come descritto in precedenza 20. Fissare l'embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo la membrana, lentamente staccarlo l'embrione. Eseguire questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell'embrione. Non danneggiare il lato animale dell'embrione.
- Isolare piccoli AC come descritto in precedenza 21. Il polo animale è parte pigmentata dell'embrione. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo le cellule ectodermiche. Assicurarsi che il tessuto è di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall'analisi.
- Mettete ogni AC in Terasaki piastre a pozzetti multipli a 0.5x modificate di Barth Saline (MBS) 4. Posizionare il AC nel pozzo con il lato pigmentata dell'animale, a contatto con il fondo rotondo del pozzo.
NOTA: pipette di rivestimento con una soluzione di BSA 0,1% impedisce l'adesione di piccoli pezzi di tessuto adesivo alla plastica. - Mettere una sferetta su ogni tappo con un P20 micropipetta. Se necessario, utilizzare pinze per posizionare accuratamente il tallone al centro del tappo.
NOTA: quando imbevuta di un mezzo condizionato, le perle sono colorati in rosa. Selezionare il maggior numero di coperline lored. - Incubare a temperatura ambiente (da 18 a 22 ° C) per 6 ore senza spostare la piastra Terasaki pozzetti. Il tallone attacca alla corrente alternata in meno di 2 ore.
- Posizionare la piastra pozzetti Terasaki sulla cima di documenti imbevuto di acqua. Coprire la piastra con un contenitore di plastica.
NOTA: Questo 'camera di umidita' impedisce l'evaporazione prematura dei pozzetti. - Cultura l'ACS a 0,5x MBS o 3/4 NAM (vedere il punto 4.1) nella camera umida, a 15-20 ° C fino a quando gli embrioni di pari livello hanno raggiunto la fase giusta per testare l'effetto del fattore.
- Fissare la AC per 1 ora in preparati al momento 4% PFA. Disidratare il ACs in 100% MeOH come precedentemente descritto (Passo 1.4).
3. Cap Animal Dissociazione cellulare e riaggregazione Prima Innesto in Xenopus laevis neurula
- Piatti petri Coat (60 mm) o 12 pozzetti piastre con 3% agarosio in acqua sterile o in PBS senza calcio e magnesio. Aggiungi abbastanza agarosio per coprire la bottom della capsula di Petri e il bene. Pre-riscaldare le piastre a RT (18-22 ° C). Facoltativamente, memorizzate le piastre per due giorni a 4 ° C per evitare la disidratazione.
- Preparare senza calcio salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)), e soluzione salina di Holtfreter (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mm HEPES, 0,1% BSA pH 7.6) 5. NOTA: la soluzione di CaCl 2 non può essere autoclavata.
- Riempire il agarosio rivestite bene verso l'alto con soluzione salina priva di calcio di Holtfreter.
- Preparare blastula o embrioni molto precoci gastrula per isolare i loro ACs come descritto in precedenza (punti 2,5-2,7).
- Isolare almeno 15 o fino a 30, 21 piccolo ACs. Utilizzando una pinza sottile tagliato un piccolo quadrato di tessuto dal polo animale. Il tessuto AC contiene solo celle ectodermiche ed è quindi di spessore uniforme. In caso contrario, rimuovere la AC dall'analisi.
NOTA: Il polo animale è il Embryparte pigmentata di o. - Trasferire l'ACS in un agarosio rivestite ben riempito al top con soluzione fisiologica di Holtfreter senza calcio. Posizionare l'ACS con il loro lato pigmentata rivolto verso l'alto.
NOTA: Il processo di dissociazione inizia rapidamente in soluzione salina di Holtfreter senza calcio. - Attendere qualche minuto per le cellule per iniziare dissociare. Osservare questo attraverso disaggregazione dei tessuti. Utilizzando una pinza sottile, separare lo strato pigmentato dal resto della AC e gettarli con un P20 micropipetta. Completa processo di dissociazione cella indica la separazione delle cellule tra loro.
NOTA: Uno o due strati pigmentati possono essere lasciati alla espianto ri-aggregati per aiutare la visualizzazione durante l'innesto. - Centrare le cellule utilizzando movimenti circolari della piastra. Usando una micropipetta p1000 rimuovere accuratamente quanto mezzo possibile. Fare attenzione a non toccare le cellule.
- Aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con calcio al pozzo. Trasferire l'ACS dissociatein una provetta da 1,5 ml.
NOTA: 2 ml tubi non possono essere utilizzati a causa della loro fondo rotondo. - Agglomerare le cellule per centrifugazione, 5 min ad una velocità massima di 2.000 giri al minuto per una centrifuga da banco (500 xg). Rimuovere con attenzione il surnatante con una micropipetta P1000.
- Aggiungi alle cellule dissociate 20 ml di soluzione fisiologica di Holtfreter con il calcio (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4.6 mM HEPES, 0,1% di BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5.
- Mantenere il dissociato ACs, da 3 a 6 ore a temperatura ambiente (18-22 ° C).
NOTA: È tempo necessario per le cellule di ri-aggregazione. La riaggregazione è visibile come le cellule formano una pallina sul fondo della provetta. - Staccare con cautela l'espianto dal fondo della provetta con l'aggiunta di 1 ml di 0,5x MBS o da 1 ml di 3/4 NAM (vedi punto 4.1). Trasferire l'espianto in un piatto non-rivestita con una pipetta di plastica trasferimento.
- Fase espianti che utilizzano i loro fratelli di controllo. Per uso a lungo termine cultura antibiotici: kanamycin (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml).
4. Accrescimento di animali Caps Espianti nella placca neurale di X. laevis Embrione
- Preparare 3/4 NAM (110 mM NaCl, KCl 2 mm, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0.1 mM EDTA, 1 NaHCO mm 3, 0.2x PBS, 50 mg / ml di gentamicina). Non tenere per più di 1 settimana per la dissezione e conservare a 4 ° C. NAM più vecchio può essere utilizzato per la preparazione di piatti dissezione agarosio rivestite (sotto).
- Piatti cappotto di Petri (60 mm), con il 3% agarosio in 3/4 NAM in cui piccoli fori sono stati realizzati utilizzando uno stampo in silicone, o la copertura di una racchetta da ping-pong.
NOTA: L'agarosio copre il fondo della capsula di Petri. Lasciare un po 'di spazio in modo che la capsula di Petri da riempire con 3/4 NAM. In alternativa, fare piatti dissezione con i non-essiccazione modellazione creta. All'interno l'argilla, spremere gli embrioni leggermente durante la procedura di dissezione. Scavare piccoli fori nellaagarosio usando pinze arrotondate Questo 'piatto dissezione' aiuta a tenere gli embrioni durante la procedura di dissezione. - Raccogliere strumenti di dissezione: pipette di plastica, un 'coltello sopracciglio' (realizzato con i capelli sopracciglio inclusi in paraffina sulla punta di una pipetta Pasteur di vetro) 22, due pinze dissezione fine, P1000 micropipetta e suggerimenti, un stereosmicroscope con ingrandimento 8-40X, una fonte di luce brillante con guide in fibra ottica. Tenere tutti gli strumenti di dissezione pulito; dopo ogni esperimento, sciacquare due volte con acqua distillata, una volta con 100% di etanolo e lasciare asciugare. Conservare lontano da polvere e, se necessario, gli strumenti di dissezione in autoclave metallo.
- Lasciate che la ri-aggregato AC (protocollo 3), e loro fratelli dissociato e X. embrioni laevis sviluppano fino a raggiungere stadio 13 (neurula) secondo Nieuwkoop e Faber tavolo di sviluppo 17. Per il trapianto all'interno della fase piastra neurale 13 per mettere in scena 15 embrioni vengono utilizzati.
- Effettuare tuttofasi successive allo stereomicroscopio.
- Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni in PBS con calcio e magnesio integrato con 0,2% di BSA. Rimuovere membrana vitellina dell'embrione come descritto in precedenza 20. Fissare l'embrione con una pinza. Pizzicare la membrana vitellina con il lato delle pinze altri. Tenendo saldamente la membrana, lentamente staccarlo l'embrione.
NOTA: Effettuare questa procedura sul ventrale (vegetale) lato dell'embrione. Non danneggiare gli embrioni piastra neurale. Se gli embrioni sono stati danneggiati durante la rimozione fase di membrana vitellina, di trasferire gli embrioni in una capsula di Petri 60 millimetri contenente 3/4 NAM con un trasferimento pipetta di plastica e attendere 15 minuti, un tempo sufficiente per il processo di guarigione a verificarsi. - Compila il piatto dissezione verso l'alto con fresco 3/4 NAM.
- Usando una pipetta di trasferimento di plastica, di trasferire gli embrioni senza la loro membrana vitellina nel piatto dissezione. Mettere gli embrioni lato dorsale fino ini pozzi. Durante il processo di trasferimento non consentono l'embrione di entrare in contatto con l'interfaccia aria-liquido dal X. laevis sono lisati dalla tensione superficiale.
- Trasferire il espianto AC da innestare nel piatto dissezione con una pipetta di trasferimento di plastica o una micropipetta P1000. Una volta che la pipetta è all'interno del liquido, consentire gli espianti di affondare lentamente per gravità, o spingere molto delicatamente.
- Mantenere gli embrioni con pinza arrotondati. Con il coltello sopracciglio fare un'incisione nella piastra neurale in cui si intende innestare pezzo del vostro espianto.
NOTA: Nella fase 14 la piegatura anteriore della piastra neurale può essere utilizzato come punto di riferimento, segna il territorio diencefalo (Figura 4). - Tagliare un piccolo pezzo di neuroepitelio, con pinze arrotondate e un coltello sopracciglio. Tagliare un piccolo pezzo di espianto con il coltello sopracciglio.
NOTA: Il pezzo di espianto dovrebbe essere circa la stessa dimensione e forma come la zona ablato neuroepitelio. Posizionare il pezzo di espianto nell'incisione neuroepitelio utilizzando il coltello sopracciglio e una pinza sottile. Assicurarsi che l'espianto si attacca rapidamente per l'embrione. - In alternativa, inserire un pezzo di vetro coprioggetto sul embrione innestato di mantenere l'innesto in posizione. Per fare questo, tagliare un bel vetrino di vetro in pezzi molto piccoli con pinze grossolani. Assicurarsi che la dimensione è di circa 1,5 mm 2. Immergere i pezzi in una capsula di Petri contenente 3/4 NAM o PBS con pinze. Scegliere un pezzo di vetro più grande della embrione per evitare di danneggiarlo. L'embrione sarà un po 'appiattito.
- Attendere almeno 30 minuti senza muoversi, o spostare solo il piatto dissezione delicatamente. Lasciate che l'embrione recuperare per 30 minuti a 2 ore e rimuovere delicatamente il vetrino, se necessario. Pipetta con attenzione gli embrioni innestati in un piatto pulito pieno di 3/4 NAM, utilizzando la pipetta plastica.
NOTA: Innestata embrioni tendono a sviluppare batteri o funghi contaminazione. A lungo termine culture utilizzare antibiotici: kanamicina (50 ug / ml), ampicillina (50 ug / ml) e gentamicina (50 mg / ml).
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Representative Results
Sulla base di considerazioni morfologiche in specie diverse, manipolazioni embriologici, e il pattern di espressione di geni regolatori, un modello concettuale che sostiene la piastra neurale è diviso in segmenti trasversali e longitudinali che definiscono una griglia sviluppo generare campi histogenic distinte. Nel placca neurale, la primordi del prosencefalo, mesencefalo, rombencefalo e del midollo spinale sono tutti già stabilito lungo l'asse antero-posteriore (AP) durante la gastrulazione (rivisto in 23-25). Durante neurulazione, i campi histogenic possono essere rilevate come domini spazialmente ristretta di espressione genica. Sulla base dei pattern di espressione di geni regolatori, il primordio prosencefalo è suddiviso in sei segmenti trasversali che generano campi distinti histogenic chiamati prosomeres (p). Ogni prosomere è diviso in una ventrale (basale) e una (Alar) parte dorsale (Inviato in 26,27). Nella anfibi, il prosomere 2(p2) dà luogo alla epitalamo e talamo e al suo organizzatore Z ona L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (recensito in 28,29).
In figura 1 sono mostrati il piatto montaggio di X. laevis e X. tubi tropicalis anteriore neurali nelle fasi 30, 32, e 35 dopo WM-DISH. WM-ISH sono stati eseguiti secondo il protocollo 1 utilizzando sonde per i fattori di trascrizione fezf2 che segna il telencefalo e p3, barhl2 che segna p2, orli corticali e il mesencefalo, Iroquois-1 (irx1) e Iroquois-3 (irx3) che, rispettivamente, marchio caudale p2 e p2 alari e per la Shh morfogeno che segna il ZLI, prosencefalo basale e mesencefalo (Figura 1E). Un'analisi comparata dei vari modelli di espressione genica rivela che il limite anteriore di barhl2 espressione p2 attesta il limite caudale espressione fezf2 in p3 (Figura 1A). Irx3 è co-espressa con shh in futuro ZLI (Figura 1B). All'interno p2 dominio espressione irx1 è complementare a quella di shh (Figura 1C) 8. Il pattern di espressione di barhl2 in X. tropicalis allo stadio 35 è mostrato nella Figura 1D. Un diagramma schematico dei territori di espressione di questi geni nel proencefalo sviluppo anfibio è fornito in Figura 1E.
Utilizzo del protocollo 2 la capacità di scambio anionico perle in resina imbevute di Shh per indurre l'espressione di Shh è stato studiato in espianti SCA. X. laevis embrioni sono stati iniettati nei 4 blastomeri animali alle cellule 8 4 e in scena con mRNA codificanti per anteriore neuroepiteliale induttore zucca insieme con barhl2, oTX2, irx3 e GFP come tracciante iniezione. L'espressione del fattore Noggin anti-BMP inibisce il percorso BMP e dà un'identità neurale per celle AC 3. Ci riferiamo a AC esprimere Noggin come Anteriorised protezione animale (AAC). Blastocele espianti tetto vengono preparati come descritto nel protocollo 2. Gli AAC sono state coltivate per 48 ore a 18 ° C in contatto con una perlina di resina scambiatrice di anioni imbevuto di terreno condizionato (CM) contenente, o meno, la parte N-terminale di secreto il riccio morfogeno sonora di ratto (N-Shh). L'espressione di shh endogena è stato analizzato mediante ISH (Figura 2). Espressione di Xenopus shh (Xshh) viene rilevato in cellule in contatto con il tallone imbevuto di CM con N-Shh ma non nelle cellule a contatto con il tallone imbevuto CM senza N-Shh (Figura 2B).
Utilizzo del protocollo 3 la capacità di diversi tipi di cellule di segregare un anoth daER è stata studiata. X. embrioni laevis sono stati iniettati nei 4 blastomeri animali alle cellule 8 4 e in scena con mRNA codifica per zucca con o senza Otx2, barhl2 e irx3, come indicato, utilizzando ßGal o GFP come traccianti (Figura 3A). Fase 8/9 AC erano dissociati e ri-aggregati per generare espianti composte da elementi neuroepiteliali misti contenenti sia ßGal- e le cellule che esprimono GFP-. Gli espianti reaggregated sono state coltivate per 48 ore a 18 ° C. attività ßGal stato rivelato in rosso a seconda 30 (figura 3A). Il comportamento delle cellule è stata osservata seguendo la loro localizzazione all'interno espianti ri-aggregati. In espianti dove le cellule AACS si mescolano con le cellule che esprimono Otx2 AACS (rosso), le cellule che esprimono ßGal non segregano dalle cellule GFP che esprimono entrambi i tipi di cellule intermediato liberamente (Figura 3B, 3C). Al contrario, inespianti dove le cellule (GFP) Otx2 esprimono sono mescolati con Barhl2, Otx2, irx3 (BOI3) cellule esprimente (ßGal), le cellule che esprimono ßGal (rosso) formano chiazze coesivi e non si diffondono in modo uniforme all'interno del espianto ri-aggregati ( Figura 3D, 3E).
Utilizzando il protocollo 4, il comportamento delle cellule AC programmate è stato studiato in vivo. X. laevis embrioni sono stati iniettati nei 4 blastomeri animali a 4 e 8 celle fasi con mRNA codificanti per zucca con Otx2 da solo o insieme con barhl2 e irx3. ßGal è stato utilizzato come tracciante. In parallelo, gli embrioni sono stati iniettati con mRNA simile codifica per zucca e la parte secreto N-terminale della shh morfogeno di ratto (N-Shh). Nella fase 8/9, espianti AC sono stati dissociati e immediatamente ri-aggregati per generare espianti misti composti da neuroepitcellule che esprimono helial sia N-Shh e Otx2, o di esprimere N-Shh e Otx2, Barhl2 e irx3 (BOI3). Piccoli pezzi di espianti misti sono stati innestati nella placca neurale di X. laevis embrioni allo stadio 14. Le cellule trapiantate sono state segnate con ßGal colorazione (rosso). Nella fase 35 l'espressione di Shh endogena è stata analizzata mediante ISH. Quando innestato nella piastra neurale anteriore di X. laevis embrioni, espianti miste composte da BOI3 e N-Shh cellule che esprimono sviluppato due caratteristiche specifiche delle cellule ZLI: le cellule trapiantate hanno espresso Xshh e segregate dalle cellule neuroepiteliali anteriori (Figura 3C). Al contrario, quando espianti misti composti da Otx2 - e N-Shh- che esprimono le cellule si innestano nel X. laevis placca neurale, le cellule trapiantate non hanno espresso Shh e non segregano dai loro vicini (Figura 3B) 8.
Figura 1. tubi neurali piatti montato da X. laevis e X. tropicalis embrioni tutto il montaggio doppio ISH (A - D). WM-ISH viene eseguita utilizzando fezf2, barhl2, irx1, irx3 e Shh come sonde su (A - C) X. laevis embrioni a stadi 30, 32, e 35 e (D) X. tropicalis embrione allo stadio di 35 come indicato. I tubi neurali di embrioni rappresentativi sono sezionati e piatto montato come descritto nel protocollo 1. I tubi neurali sezionati sono indicati da una vista laterale, dorsale fino, anteriore sinistra. Sono indicati i marcatori e le fasi. I confini rostrale e caudale di P2 sono indicati con le frecce. (AC) La barra di scala è sinonimo di 0,5 mm. (D) I scale barra sta per 0,1 mm. . (E) Schema di marcatori proencefalo a st.30 barhl2 dominio espressione è indicato in linee tratteggiate; Aree di espressione sono indicati per fezf2 (rosa), Shh (rosso), irx3 (giallo) e irx1 (verde). p sta per prosomere. La ghiandola pineale situata sulla cima di p2 è mostrato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'induzione di Shh espressione negli espianti programmati tramite il contatto con perle in resina a scambio anionico. Piccole AC sono preparati da embrioni iniettati con mRNA codificante per zucca, barhl2, Otx2, e irx3, con GFP come tracciante. AAC sta fo Anteriorised protezione animale. Gli espianti AAC esprimono Barhl2, Otx2 e irx3 (AAC BOI3) sono coltivate per 48 ore in contatto con un tallone imbevuto di un mezzo condizionato (CM) sia contenente N-Shh, o no, come indicato. Gli espianti sono analizzati mediante ISH per l'espressione di Xenopus (X) shh. La barra di scala è sinonimo di 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Analisi del comportamento segregazione cellulare in espianti ri-aggregati. (A) Embrioni X. laevis sono iniettati con mRNA codificante per zucca, Otx2, barhl2 e irx3 come indicato. ßGal e GFP sono utilizzati come traccianti. Nella fase 8/9 piccoli AC sono preparati , Dissociato e ri-aggregati per generare espianti fatti di GFP / ßGal tipi di cellule miste. Gli espianti sono coltivate per 48 ore a 18 ° C e l'attività ßGal si rivela (rosso). (B - E) espianti Rappresentante composte da elementi contrastanti che esprimono proteine come indicato sono mostrati. AAC sta per Anteriorised Cap Animal. (B, C) le cellule che esprimono ACs Noggin e Otx2 (ßGal) distribuite in modo casuale quando sono mescolati con le cellule che esprimono ACs Noggin (GFP). (C) Visualizzazione ingrandita della (B). Cellule (D) AACS esprimono Barhl2, Otx2 e irx3 (BOI3) (ßGal) raggruppate e segregati dalle cellule che esprimono Otx2 AACS (GFP). (E) Visualizzazione ingrandita della (D). (B, D) La barra di scala è sinonimo di 0,5 mm. (C, E) La barra di scala è sinonimo di 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. programmato espianti espongono le loro caratteristiche di sviluppo quando innestate nella piastra neurale di uno stadio embrionale 14 (A) schema sperimentale:. AAC vengono preparati da embrioni iniettati con mRNA come indicato. Nella fase 8/9 cellule dal tetto del blastocele sono dissociate e ri-aggregati per generare espianti fatti di tipi di cellule miste che esprimono ßGal (rosso). Gli espianti sono coltivati fino a raggiungere i loro fratelli fase 14. Un piccolo pezzo di espianto misto (rettangolo verde) è messo in una incisione all'interno della piastra neurale anteriore. Embrioni Operated sono cresciuti fino a fase 35. embrioni Operated sono analizzati da WM-ISH utilizzando X. laevis Shh (Xshh) come sonda. attività ßGal si rivela in rosso according a 30. (B, C) I lati innestate di stage 35 tubi neurali rappresentativi sono mostrati, vista laterale, dorsale fino, anteriore sinistra. (B) innestato con AAC misti esprimono Otx2 e N-Shh. (C) innestato con AAC misti esprimono Barhl2, Otx2, irx3 (BOI3) e N-Shh. Cellule trapiantate sono indicati con una stella rossa. La stella rosa indica il potenziale diencefalo. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sviluppo neurale è orchestrata da una complessa interazione tra programmi di sviluppo cellulari e segnali dai tessuti circostanti (Recensito a 3,31,32). Qui si descrive un set di protocolli che possono essere utilizzati in X. laevis embrioni per esplorare fattori estrinseci ed intrinseci coinvolti nella determinazione destino neurale e la morfogenesi neuronale in vitro e in vivo. Questi protocolli possono essere usati come tali X. embrioni tropicalis, tuttavia X. embrioni tropicalis sono quattro volte più piccoli poi X. laevis embrioni. Entrambe le pinze e gli aghi di tungsteno necessità usati per essere più fine. Se possibile, utilizzare X. laevis.
Visualizzazione precisa di X. laevis e X. tropicalis campi histogenic neurali possono essere ottenuti utilizzando il montaggio istologico piano di tubi neurali sezionati da WM-ISH. Questa tecnica è stata eseguita con successo su X. laevis embrioni dallo stadio 26 afase 45 (Figura 1) e X. tropicalis embrioni da palcoscenico per mettere in scena 45 30 8,33. Embrioni più anziani sono più facili da sezionare embrioni quindi più giovani. Questa tecnica è di facile esecuzione. Permette l'analisi dei pattern di espressione genica, separatamente o congiuntamente, tubi neurali a diversi stadi di sviluppo. Con questo protocollo è facile confrontare un lato di un tubo neurale con l'altra. Questo è molto utile in Xenopus GOF e LOF esperimenti. I difetti osservati sul lato iniettato del tubo neurale possono essere confrontati direttamente con gli eventi evolutivi normali osservati sul lato di comando. Questa strategia è stata utilizzata per analizzare GOF e LOF fenotipi in X. laevis embrioni 8,33. Un passo importante in questo protocollo è la corretta fissazione dei tessuti embrionali. Un fissaggio incompleta impedisce il distacco efficace dell'ectoderma dal tubo neurale. La pre-dissezione del tubo neurale facilita la penetrazione di sit inSonde u. Tuttavia, una volta isolato, è facile perdere i tubi neurali. È consigliabile mantenere parte dell'embrione durante la procedura ISH per prevenire eventuali perdite.
Gli embrioni utilizzati per tutti questi esperimenti devono essere robusti e hanno bisogno di guarire bene. Eliminare ogni partita di embrioni sani. Al fine di analizzare ACs e espianti innesto tra lo stadio e lo stadio 15 13 è possibile coltivare X. laevis espianti e embrioni a diverse temperature (da 12-18 ° C e 18-20 ° C). Degno di nota X. laevis cellule embrionali contengono abbastanza tuorlo per permettere la loro sopravvivenza per diversi giorni senza aggiunta di qualsiasi sostanza nutritiva esterna. Per non danneggiare i tessuti embrionali, qualsiasi procedura di trasferimento di embrioni, AC, o espianto deve essere fatto con attenzione. Si consiglia di utilizzare una pipetta di plastica o micropipetta se necessario, con un taglio punta alla sua estremità. Il diametro della estremità di punta è regolata alla dimensione dell'embrione, o la dimensione di espianto, da trasferire.È degno di nota, pipette di rivestimento con una soluzione di BSA 0,1% impedisce l'adesione di piccoli pezzi di tessuto alla plastica.
Espianti AC possono essere programmati attraverso l'espressione genica forzata, o attraverso l'esposizione a fattori estrinseci in maniera tempo e spazio controllato. Descriviamo una tecnica che permette ad induzione locale tramite il contatto diretto tra un espianto e una perlina. Se necessario, le perline possono essere ulteriormente frammentati con pinze. Rispetto ad altre strategie precedentemente descritte, questa tecnica permette la sperimentazione di induzione locale con fattori puri, soli o in combinazione, in una finestra di tempo preciso.
Usando un approccio precedentemente descritto di dissociazione cellulare e riassociazione 34, è possibile indagare capacità motilità cellulare, comportamenti segregazione cellulare e formazione di confini vano in sandwich e AC mista espianti 8. Il processo di dissociazione cellulare inizia in meno di 15 min. Evitare shaking la piastra nella fase di dissociazione per prevenire la perdita di cellule. Gli strati pigmentati AC non dissociano bene. Si consiglia di rimuoverli durante la fase di dissociazione. Un paio di AC strati pigmentati sono lasciati nel espianto ri-aggregati. Essa aiuta a visualizzare l'innesto. Non interferisce con l'analisi in fasi successive dello sviluppo.
In questo manoscritto un protocollo trapiantare espianti misti in un piatto neurale è dettagliata. In embrioni di Xenopus, la piastra neurale è aperto tra il 13 e il palcoscenico palcoscenico 15. Queste fasi sono quindi opportuno per il trapianto all'interno neuroepitelio. X. laevis tessuti proprietà adesive cambiano con il tempo. E 'importante innestare espianti AC in un host in una fase di sviluppo simile. Nelle fasi precoci dello sviluppo, X. laevis embrioni coltivati in 3/4 riparazione NAM estremamente veloce. Se alcuni embrioni sono stati danneggiati durante la rimozione della membrana vitellina può essere utile aspettare 15 min,che è il tempo necessario per il processo di guarigione a verificarsi. L'inserimento può essere favorito mettendo un pezzo di vetro coprioggetto sul tessuto ospite innestato, ma non è un requisito. La forza generata dal processo di guarigione può estrudere le cellule innestate. Morfologia dell'embrione host è meglio mantenuta quando l'innesto è costretto con pressione esterna, come con un vetrino. Per valutare il successo del trapianto, un tracciante fluorescente può essere iniettato nel espianti. La presenza di cellule fluorescenti all'interno dell'embrione innestato può essere visualizzato finché il tubo neurale si chiude. Il principale svantaggio di coltura e di innesto AC esperimenti è la frequenza di batteri o funghi contaminazione. Utilizzare soluzioni di materiali e sterili puliti o sterili più spesso possibile per evitare la contaminazione piatto in ogni fase del protocollo. Per la coltura a lungo termine di embrioni innestate sempre utilizzare antibiotici e una temperatura di 15 ° C. Evitare il contatto a lungo termine di espianti AC o embrioni con agarosio. Noi ObservEd che può ridurre l'aspettativa di vita del trapianto. La tecnica dell'innesto è potente, ma richiede tempo. Non è consigliabile per lo screening per spunti determinazione destino con esso, ma di acquisire informazioni sufficienti sul vostro tessuto di scelta in anticipo.
Oltre alle sue tradizionali vantaggi, i recenti progressi genetici nel Xenopus hanno aperto la strada a questo sistema modello per esplorare reti di regolazione genica che utilizzano su larga scala l'analisi genomica per sequenziamento profondo RNA e Chromatide Immunoprecipitazione-sequencing (ChIP-Seq) 5,35. Ci sono eccellenti RNAseq e set di dati di riferimento Chip-Seq coprono sviluppo embrionale precoce. Uno degli svantaggi di analisi ChIP-seq è la necessità di raccogliere grandi quantità di materiale. Programmazione di espianti AC permette la produzione di una grande quantità di un tessuto neurale specifico, e almeno in parte, aiuta a superare questo limite tecnico.
I programmi di sviluppo sottostante organo del tubo neuraleogenesis sono in gran parte conservati, soprattutto nei vertebrati. Le informazioni raccolte con gli anfibi aiuta nella comprensione dei processi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo dei vertebrati 25,32,36-38. I recenti progressi nel campo delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) ha aperto i gateway per la ricerca nel campo della medicina rigenerativa e scoperta di nuovi farmaci. iPSCs sono programmati dalle cellule somatiche utilizzando una combinazione di fattori di trascrizione. La ricerca di spunti di programmazione per le cellule staminali è in corso. I saggi descrivono qui di fornire un mezzo per generare tipi di cellule neurali di derivazione in vitro che potrebbero essere utilizzati per lo screening di stupefacenti. Essi forniscono inoltre un modo economico e veloce per verificare determinanti destino neurali che possono essere utilizzati per un'ulteriore riprogrammazione di iPSCs 39,40.
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
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