Introduction
척추 동물의 신경계 세포의 neuroepithelial 균질 층으로서 신경 판으로부터 나온다. 개발 프로그램은 신경 판의 지역화 동안, 유도 인코딩 설립하는 방법을 이해하는 것은, 현재, 발달 생물학의 주요 목표입니다. 다른 시스템에 비해, 실험적 의무 Xenopus의 배아는 신경 발달의 초기 단계 1,2- 분석을위한 선택의 모델이다. 이 배아의 큰 숫자를 얻기 쉽고, 외부 개발 neurulation 3의 첫 번째 단계에 액세스 할 수 있습니다. 많은 도구를 실험적으로 Xenopus의 laevis의 (X를 laevis의) 배아 발달을 조작 할 수 있습니다. 마이크로 주입 함께 약리 도구를 유도 수법의 포함의 mRNA 또는 morpholinos (MO),의는, 함수의 이득 (GOF)과 기능 (LOF)의 손실과 경로 4,5 신호의 특정 변경을 제어 허용한다. 즐stocoel 지붕 외배엽은 포배, 또는 초기 낭배 배아 동물 기둥 주위에 위치하며 "동물 캡 '(AC)라고도 유전자 발현 이전에의 조작에 의해 프로그램 될 수있는 다 능성 세포의 공급원은 준비 외식. 이 원고 X.를 사용하는 상세한 프로토콜은 laevis의 교류 외식은 시험관 및 생체 분자 메커니즘 및 세포 프로세스 기본 신경 개발에서 테스트합니다.
기술은 제노 올챙이 신경 튜브에서의 유전자 발현 패턴의 미세 관찰 운명 결정 큐의 식별에 예비 단계를 허용되게된다. 평면 장착 조직 관찰은 통상적으로 병아리 배아 (6)의 연구에서 사용되는 반면, 그것은 적절 제노 푸스에서 설명되지 않았다. 2 또는 4 세포 단계의 배아의 할구로 합성의 mRNA 또는 MO 주입에 의한 유전자 발현의 조작은 AC의 프로그래밍을 할 수 있습니다(4) 외식. 안티 BMP 요인 머리의 발현에 의해 뼈 형태 형성 단백질 (BMP) 경로의 예를 억제를 들어, AC 세포 3에 신경 정체성을 제공합니다. 프로토콜은 음이온 교환 수지 입자와 직접 접촉을 통해 외인성 단서 AC 이식편의 로컬 시간 및 노출 제어를 수행하기위한 상세한된다. 마지막 기술은 분해 및 재 관련 프로그램 별개의 세포로부터 제조 된 혼합 외식의 이식에 의해 생체 내에서 신경 전구 세포의 발달 기능을 테스트하기위한 기술되어있다.
개구리 배아 초기 척추 동물의 신경 발달을 연구하는 강력한 모델이다. 유전자 발현의 조작을 결합하여 체외 배양을 절편하기 neuroepithelium의 지역화, 확산 및 형태 형성 7-12의 연구에 중요한 정보를 제공합니다. AC 외식의 프로그래밍은 생체 13,14 기능 중심의 개발을 허용. 사용이식 절편의 15는 신경 능선 차별화 프로그램 (16)을 유도하는 최소한의 전사 스위치의 식별되었다. 조나의 limitans의 intrathalamica (ZLI)는 꼬리 전뇌의 성장과 지역화를 제어하는 소닉 고슴도치 (쉬)를 분비 신호 센터입니다. 연속적 쉬에 노출 될 때, 세 가지 전사 인자 유전자 coexpressing neuroepithelial 세포 - barH 형 호 메오 -2- (barhl2)는 orthodenticle -2- (의 Otx2)과 이로쿼이 -3- (irx3는) - ZLI 구획의 두 가지 특성을 획득 님 역량 쉿 표현, 그리고 앞쪽에 신경 판 세포로부터 분리 할 수있는 능력. 모델 시스템으로, neuroepithelial 세포에 ZLI 운명의 유도는 8 표시됩니다.
이러한 프로토콜은 기본 MEC를 탐험 발달 생물 학자와 다른 연구자에 대한 간단하고 저렴하고 효율적인 도구를 제공을 목표로키 신경 세포 행동의 hanisms. 이러한 프로토콜은 매우 다재다능하고 외부와 고유 신경 결정 큐의 큰 범위의 조사를 할 수 있습니다. 그것은 신경 계통 약속, 유도 상호 작용과 세포 행동의 생체 분석에서 장기를 허용합니다.
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Protocol
실험은 과학적 목적 및 교체, 감소 및 정제 국제적으로 확립 된 원칙에 사용되는 동물의 보호에 관한 국가와 유럽의 규정을 준수합니다.
Xenopus의 1. 평면 장착 후 올챙이 앞쪽에 신경 튜브를 laevis의 현장 하이브리드에서 전체 마운트
- X를 얻습니다 표준 절차 4 그들이 26 세 이상 (Nieuwkoop 및 페이버 발달 테이블 (17)에 따라 neurula 단계에 도달 할 때까지 그들을 나이에 따라 배아를 laevis의.
- 수정 (X) 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)의 용액에 이들을 배양하여 laevis의 올챙이. 38 배아, 나중 단계에서 배아에 대한 실온에서 2 시간 무대 무대 26, 1 실온에서 시간 1.5을 바위와 2 mL 유리 병에 배아를 돌립니다.
주의 : PFA는 연락처 및 의심되는 발암 물질에 의한 독성. 그것은 후드 아래에 조작해야합니다.
참고 : 하나의 X를 laevis의의 무리입니다보통 2 mL 유리 바이알에 고정되지만 큰 유리 바이알이 사용될 수있다. - 두 번, 0.1 % 트윈 (PBT)와 1X PBS를 사용하여 동일한 유리 병에 배아, 실온에서 3 분을 씻으십시오.
참고 : 그렇지 않으면 사용 된 PBS를 지정하지 않으면 또는 칼슘과 마그네슘없이. - 동일한 바이알을 실온에서 적어도 12 시간 동안 100 % 메탄올 (MeOH 중)에서 배아 탈수. 플라스틱 마이크로 피펫을 이용하여 후드의 두 배 이상을 MeOH 100 %로 변경.
주 : 메탄올이에 용해 지질로 약간 노란색으로 변합니다. 메탄올은 흡입 독성 및 후드 조작해야합니다주의. - PBS, 메탄올 PBS에서 50 %, 두 번 PBS, PBS에 메탄올 25 %, 실온에서 각 조 ~ 10 분에 메탄올 75 % : 등급 메탄올 화장실의 시리즈를 통해 같은 병을 사용하여 배아를 재수. 메탄올 용액은 플라스틱 마이크로 피펫 후드 변경된다.
- 플라스틱 피펫을 사용하여 배아 PBT와 정상에 가득 60mm 페트리 접시에 해부 될 전송할 수 있습니다. 두 미세 집게 관리를 사용하여완전히 광학 줄기의 수준에서, 눈과 신경 튜브 사이에 하나의 미세 집게를 삽입하여 눈을 제거합니다. 신경 튜브에서 눈을 분리합니다. 조심스럽게 신경 튜브 위에 놓인 외배엽 아래 집게를 소개합니다. 주의, 머리 뒤에서 시작하는 외배엽을 벗겨 폐기.
- 사용하여 이중 또는 단일 ISH를 수행 제닌 표지 또는 이전 등의 형광 표지 된 프로브 (18, 19)을 설명했다.
- ISH는 PBT는 플라스틱 피펫을 사용하여 함께 상단에 가득 찬 새로운 60mm 페트리 접시에 배아를 전송 한 후.
- 미세 집게를 사용하여 조심스럽게 배아의 나머지 부분에서 신경 튜브를 분리합니다. 이 단계에서, 전방 신경관은 후방 신경 튜브로부터 분리시킨다. 조심스럽게 신경 튜브, 느슨하게 신경 튜브, 귀의 소포 및 중배엽의 나머지 부분 아래에 붙어있는 척색 위에 놓인 외배엽의 나머지 부분을 분리합니다. 신경관이 어떤 부록없는 있는지 확인이 단계에서.
참고 : 필요한 경우 끝에서 끝 잘라 플라스틱 전송 피펫 모든 신경 튜브 / 배아 이식 또는 마이크로 피펫을 수행 신경관 손상을 방지합니다. 선단의 직경은 신경관의 크기로 조정된다. - 해부 신경 튜브로 이동 PBS에 희석하여 50 % 글리세롤 가득 1.5 ML 튜브에 (주 단계 1.9 참조). 신경 튜브 글리세롤 솔루션의 바닥에 떨어졌다 때까지 4 ° C에서 일반적으로 O / N, 기다립니다.
- 50 % 글리세롤 용액을 제거 / PBS는 마이크로 피펫 P1000를 사용하고 동일한 1.5 ㎖의 튜브에 마이크로 피펫을 이용 P1000 90 % 글리세롤 / PBS 용액을 추가한다. 신경 튜브를 4 ° C에서 보통, 90 % 글리세롤 / PBS 용액의 바닥에 O / N 떨어질 때까지 기다리십시오.
주 : 장기간 보관시 세균 발생을 예방하기 위해 90 % 글리세롤 / PBS 플러스 항생제를 사용한다. - 유리판 또는 플라스틱 전송 피펫 현미경 슬라이드에 신경 튜브 옮긴다.
- 지지느러미와 텅스텐 바늘을 사용하여 복부 midlines 따라 신경 튜브 종파. 그 단계에서 신경 튜브는 90 % 글리세롤 / PBS에 보관됩니다.
- 유리 커버 슬립으로 덮여 보강 링을 사용하여 90 % 글리세롤 / PBS에 신경 튜브의 양면을 탑재합니다.
- 니스로 된 커버를 고정하고 4 ℃에서 보관하십시오.
음이온 교환 수지 비즈를 사용하여 2. 동물 모자의 Explants 유도
- 마이크로 피펫을 사용 P1000 2 ㎖의 튜브에 음이온 교환 수지 비드 100 ㎕를 전송. 멸균 증류수로 구슬을 적어도 연속 5 회 반복한다. 비드가 튜브의 바닥에 침전 및 마이크로 피펫 P1000을 사용 멸균 증류수를 대체 할 수있다. 구슬을 만지지 마십시오.
- 비즈 4 ° C에서 소 혈청 알부민 (BSA) (10 ㎎ / ㎖)을 멸균 증류수로 채워진 2 ML 튜브에서 O / N을 담가 보자.
- 두 시간 새로운 1.5 ml의로는 ACS, 구슬 대신 절반을 수집하기 전에마이크로 피펫 P1000을 사용하여 관. 분자를 포함하는 매체의 500 μL가 유도 가능성을 테스트하거나 특정 운명을 유도하는 것으로 알려져 수와 멸균 증류수를 교체합니다. 그들은 음성 대조군으로 사용되는 바와 같이, 비드의 나머지 절반을 유지한다.
- 적어도 2 시간 동안 4 ℃에서 인큐베이션 구슬.
- 실체 현미경 아래 모든 후속 단계를 수행하고 마이크로 피펫 모든 AC 전송을 수행합니다.
- 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 0.2 % BSA 보완 칼슘, 마그네슘과 PBS로 포배 또는 초기 낭배의 배아를 전송합니다.
참고 : 배아는 20-24 시간에 12 ° C의 범위의 포배와 낭배 단계에서 개발. - 이전 20 설명 된대로 집게를 사용하여 배아의 난황 막을 제거합니다. 한 집게와 배아를 수정. 다른 집게의 측면과 난황 막 핀치. 막 잡고 천천히 배아를 벗겨. VEN에서이 절차를 수행배아의 TRAL (식물) 측. 배아의 동물 측에 손상을주지 마십시오.
- 이전 21 설명 된 바와 같이 작은 AC들을 격리 할 것. 동물 극은 배아의 착색 된 부분이다. 통해 미세 집게 동물 극에서 조직의 작은 사각형을 잘라. AC 조직은 외배엽 세포가 포함되어 있습니다. 조직이 균일 한 두께의 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 분석에서 AC를 제거합니다.
- 바스의 식염수 (MBS) 4 수정 0.5 배에 테라 사키 멀티 웰 플레이트의 각 교류를 놓습니다. 잘의 둥근 바닥과 접촉, 아래로 착색 된 동물면 우물에 AC를 놓습니다.
주 : 0.1 % BSA 용액으로 코팅 피펫은 플라스틱에 접착 조직의 작은 조각의 접착을 방지한다. - 마이크로 피펫의 P20를 사용하여 각 캡에 하나의 구슬을 놓습니다. 필요한 경우라면, 상기 캡의 중심에 비드를 배치하는 집게를 사용한다.
주 : 조정 배지에 담가 때, 구슬 핑크 색상으로되어 있습니다. 대부분의 공동 선택lored 구슬. - 테라 사키 멀티 웰 플레이트를 이동하지 않고 실온에서 6 시간 동안 (18 22 ° C)에서 품어. 비드 미만 2 시간에서 AC 스틱.
- 물에 적신 종이 위에 테라 사키 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 플라스틱 용기와 함께 접시를 커버.
참고 :이 '습도 챔버는'우물의 조기 증발을 방지 할 수 있습니다. - 형제 배아가 인자의 효과를 테스트하기 위해 올바른 단계에 도달 할 때까지 배양 0.5X MBS 또는 3/4 남에서 ACS는 15-20 ℃에서 습도 챔버 (단계 4.1 참조).
- 갓 준비한 4 % PFA 1 시간 동안는 ACS를 수정합니다. 이전에 (단계 1.4)에 설명 된대로 100 % 메탄올로는 ACS를 탈수.
3. 동물 캡 세포 해리와 재 응집 Xenopus의 laevis의 Neurula에 접목하기 전에
- 코트 배양 접시 (60mm) 또는 칼슘과 마그네슘이없는 PBS 멸균 또는 3 % 아가로 오스 12 웰 플레이트. B를 커버하기에 충분한 아가로 오스 추가페트리 접시 또는 잘 ottom. RT (18 ~ 22 ℃로)에서 번호판을 미리 따뜻하게. 선택적으로, 탈수를 방지하기 위해 4 ° C에서 며칠에 대한 번호판을 저장.
- 준비 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수 (60 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터의 KCl, 4.6 mM의 HEPES, 0.1 % BSA (A-7888 시그마의 pH 7.6)) 및 Holtfreter의 식염수 (60 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터의 KCl, 0.9 mM의 염화칼슘 2, 4.6 밀리미터 HEPES, 0.1 % BSA 산도 7.6) 5. 주 : 염화칼슘 (2)의 용액을 멸균 할 수 없다.
- 아가로 오스 코팅 된 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수 상단에 잘 채 웁니다.
- 전술 한 바와 같이 자신의 ACS 분리 포배 또는 초기 낭배 배아를 준비 (2.7 2.5 단계).
- 적어도 15, 30, 작은 AC들 (21)까지 격리합니다. 통해 미세 집게 동물 극에서 조직의 작은 사각형을 잘라. AC 조직은 외배엽 세포를 포함하기 때문에 균일 한 두께의입니다. 그렇지 않은 경우, 분석에서 AC를 제거합니다.
주 : 동물 극 엠브리입니다O의 색소 부분. - 으로는 ACS 이동 아니라 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수 정상에 가득 아가로 오스 코팅. 그들의 착색 된면이 위를 향으로는 ACS를 놓습니다.
주 : 해리 과정은 칼슘이없는 Holtfreter의 식염수에 신속하게 시작합니다. - 세포가 해리 시작하는 데 몇 분 정도 기다립니다. 조직의 세분화를 통해이를 준수하십시오. 미세 핀셋을 이용하여, AC의 나머지 부분에서 착색 층을 분리하고 마이크로 피펫 P20 그들을 버린다. 완전한 세포 분리 과정은 서로 세포의 분리를 나타낸다.
참고 : 하나 또는 두 개의 색소 층이 접목 동안 시각화하는 데 도움이 재 집계 절편 내에 남아있을 수 있습니다. - 원형 플레이트의 움직임을 이용하여 세포를 중심. 마이크로 피펫을 사용하여 조심스럽게 가능한 매체를 제거 P1000. 세포를 만지지 않도록주의하십시오.
- 우물에 칼슘 Holtfreter의 식염수 1 ML을 추가합니다. 해리 AC들로 이동1.5 ML 튜브에.
주 : 2 ml의 튜브가 둥근 바닥으로 인해 사용할 수 없습니다. - 벤치 원심 분리기 (500 XG) 2,000 rpm의 최대 속도로 원심 분리하여 5 분간 세포 펠렛. 마이크로 피펫 P1000 조심스럽게 뜨는을 제거합니다.
- 해리 세포에 칼슘 Holtfreter의 식염수 (60 mM의 염화나트륨, 0.7 밀리미터의 KCl, 0.9 mM의 염화칼슘 2, 4.6 mM의 HEPES의 20 μl를 추가, 0.1 % BSA (A-7888 시그마의 pH 7.6) 5.
- 해리 AC들, 3 (18 ~ 22 ° C를) RT에서 시간 6 유지.
참고 :이 세포가 재 집계를하는 데 필요한 시간이다. 세포가 튜브의 바닥에 작은 공 모양으로 재 응집이 보인다. - MBS의 0.5 배 또는 3/4 NAM 1 ㎖를 1 ㎖를 첨가하여 튜브의 바닥으로부터 신중 이식편을 분리한다 (단계 4.1 참조). 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 코팅되지 않은 판에 절편을 전송합니다.
- 그들의 통제 형제를 사용하여 외식 무대. 장기 문화를 사용 항생제 : kanamyCIN (50 μg의 / ㎖), 암피실린 (50 μg의 / mL) 및 젠타 마이신 (50 μg의 / ㎖).
동물의 4. 손톱은 X의 신경 플레이트에서의 Explants 모자 laevis의 배아
- 3/4 NAM 준비 (110 mM의 염화나트륨, 2 밀리미터의 KCl, 1 mM의 칼슘을 (NO 3) 2, 1mM의 황산, 0.1 mM의 EDTA, 1mM의 수 NaHCO3, 0.2X PBS,를 50㎍ / ㎖ 젠타 마이신). 4 ° C에서 해부 및 저장을 위해 1 개 이상의 주 동안 보관하지 마십시오. 오래된 NAM은 아가 로스 코팅 해부 접시 (아래)의 제조에 사용될 수있다.
- 코트 배양 접시 작은 구멍을 실리콘 몰드, 또는 탁구 라켓의 커버 중 하나를 사용하여 제조 된 3/4되는 NAM에 3 % 아가 로스 (60mm).
주 : 아가로 오스는 배양 접시의 바닥을 다룹니다. 페트리 접시는 3/4 NAM으로 채울 수 있도록 공간을 둡니다. 또는 비 건조 모델링 점토와 해부 요리를합니다. 점토 내에서 해부 과정에서 약간 배아를 짠다. 작은 구멍을 파아가로 오스 둥근 집게에게이 '해부 접시'를 사용하여 절개 과정에서 배아를 유지하는 데 도움이됩니다. - 해부 도구를 수집 : 플라스틱 전송 피펫을, 22 개의 미세 해부 집게, P1000의 마이크로 피펫, 팁, 확대 8-40X와 stereosmicroscope (유리 파스퇴르 피펫의 끝에서 파라핀에 포함 된 눈썹 머리로 만든) '눈썹 칼' 광섬유 가이드 밝은 광원. 깨끗한 모든 해부 도구를 유지; 각 실험 후, 한 번에 100 % 에탄올, 증류수로 두 번을 세척하여 건조 할 수 있습니다. 금속 해부 도구 먼지로부터 필요한 오토 클레이브 경우 멀리 보관하십시오.
- 하자 해리와 재 집계 AC들 (프로토콜 3), 그들의 형제 자매 (X) 그들은 단 13 (neurula)에 도달 할 때까지 laevis의 배아는 Nieuwkoop 및 페이버 발달 테이블 (17)에 따라 개발한다. 15 배아를 스테이지로 신경 판 단 (13) 내 이식에 사용됩니다.
- 모든 수행실체 현미경 아래에 다음 단계.
- 플라스틱 이전 피펫을 사용하여, 0.2 % BSA로 보충 칼슘 및 마그네슘과 PBS로 배아를 옮긴다. 이전 20 설명 된대로 배아의 난황 막을 제거합니다. 한 집게와 배아를 수정. 다른 집게의 측면과 난황 막 핀치. 단단히 막를 잡고 천천히 배아를 벗겨.
참고 : 배아의 복부 (식물) 측에서이 절차를 수행합니다. 태아에게 신경 판을 손상시키지 마십시오. 배아 난황 막 제거 공정 중에 손상되었을 경우, 플라스틱 이전 피펫을 사용하여 3/4 NAM을 포함하는 60mm 페트리 접시에 배아를 전송하고 15 분, 치료 과정이 발생 할 수있는 충분한 시간을 기다린다. - 신선한 3/4 NAM으로 가기 해부 접시에 입력합니다.
- 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 해부 접시에 자신의 난황 막없이 배아를 전송합니다. 들로 태아에게 등의 측면 배치우물. 전사 과정 중 배아 X. 보낸 공기 - 액체 계면과의 접촉에 들어 가지 않도록 할 laevis의이 표면 장력에 의해 용해된다.
- AC 이식편을 전송하는 플라스틱 전송 피펫 또는 마이크로 피펫 P1000을 사용하여 절개 판에 이식한다. 피펫은 액체 내부되면, 외식 천천히 중력에 의해 아래로 가라, 또는 아주 부드럽게 밀어 수 있습니다.
- 둥근 집게와 배아를 유지한다. 눈썹 칼 당신이 당신의 절편의 조각을 접목하려는 신경 판에 절개를합니다.
참고 : 신경 판의 전방 굴곡이 랜드 마크로 사용할 수있는 단계 14에서,이 간뇌의 영역 (그림 4)를 표시합니다. - , neuroepithelium의 작은 조각을 잘라 둥근 집게와 눈썹 있입니다을 사용. 눈썹 칼 이식편의 작은 조각을 잘라.
주 : 이식편의 조각 neuroepithelium 절제 영역과 동일한 크기 및 형상에 관한이어야한다. 눈썹 칼과 미세 집게를 사용 neuroepithelium 절개로 이식편의 조각을 놓습니다. 이식편 빠르게 배아에 연결되었는지 확인합니다. - 또한 장소에 이식을 유지하기 위해 이식 배아에 유리 커버 슬립의 조각을 놓습니다. 이렇게하려면 거친 집게를 사용하여 아주 작은 조각으로 고급 유리 커버 슬립을 잘라. 크기가 약 1.5 mm이 있는지 확인하십시오. 3/4 NAM 또는 PBS를 사용하여 집게를 포함하는 페트리 접시에 조각을 담가. 그것은 손상을 방지하기 위해서 배아보다 큰 유리 조각을 선택합니다. 배아는 조금 평평하게 될 것입니다.
- 이동하지 않고 적어도 30 분 동안 기다리거나 만 부드럽게 해부 판을 이동합니다. 배아는 2 시간 30 분 동안 회복하고 필요한 경우 부드럽게 커버 슬립을 제거하자. 조심스럽게 플라스틱 전송 피펫을 사용하여, 3/4 NAM 가득 깨끗한 접시에 이식 배아를 피펫.
주 : 그래프트 된 배아는 세균 또는 진균의 오염을 개발하는 경향이있다. 장기 C의 경우가나 마이신 (50 μg의 / ㎖), 암피실린 (50 μg의 / mL) 및 젠타 마이신 (/ ㎖를 50㎍) ulture 항생제를 사용한다.
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Representative Results
다른 종, 배아 조작 및 조절 유전자의 발현 패턴의 형태를 고려하여, 개념적 모델은 신경 판 구별 histogenic 필드를 생성 발달 그리드를 정의하는 가로 및 세로의 세그먼트로 분할되어 있음을 보유하고있다. 신경 판에서 전뇌, 중뇌, 후뇌와 척수의 primordia 모든 이미 (23-25 검토) 낭 배기 중에 안테 - 후부 (AP) 축을 따라 설정됩니다. neurulation 동안 histogenic 필드는 유전자 발현의 공간적으로 제한된 영역으로 검출 할 수있다. 조절 유전자의 발현 패턴에 기초하여, 전뇌 primordium는 prosomeres (p)라고 구별 histogenic 필드를 생성 횡 여섯 개의 세그먼트로 분할된다. 각 prosomere은 복부 (기초)와 (26, 27에서 검토) 지느러미 (ALAR) 부분으로 나누어 져 있습니다. 양서류에서, prosomere 2(P2)는 epithalamus 및 시상 및 그 주최자 (28, 29에서 검토) Z오나 L imitans 나는 ntrathalamica (ZLI) (8)을 발생시킨다.
그림 1은 X의 평면 장착을 나타내었다 laevis의과 (X) tropicalis 신경 전방 단 (30, 32)에 튜브 및 WM-DISH 후 35. WM-ISH 프로토콜 즉 telencephalon 및 P3를 표시 fezf2 전사 인자에 대한 프로브를 사용하여 1, P2, 대뇌 피질의 옷단과 중뇌, 이러 쿼이-1 (irx1)와 이러 쿼이-3 (irx3)를 표시 barhl2에 따라 수행하고 그 각각 마크 꼬리의 P2와 ALAR P2와 ZLI, 기저 전뇌와 중뇌 (그림 1E)를 표시하는 morphogen 쉿합니다. 다양한 유전자 발현 패턴의 비교 분석은 밝혀 전방 한계 그 barhl의2 (P2)의 발현이 P3에 fezf2 식의 꼬리 제한을 접촉 (그림 1A). irx3 공동 발현 미래 ZLI (그림 1B)에서 쉬와 함께입니다. P2 irx1 발현 도메인 내부 쉬 (도 1C) (8)의 것과 상보 적이다. X에서 barhl2의 발현 패턴 단계 35 tropicalis는도 1d에 도시되어있다. 개발 양서류 전뇌에서이 유전자의 발현 지역의 개략도는 그림 1E에 제공됩니다.
프로토콜 2 ACS 데이터 이식편 조사 하였다 쉬 발현을 유도 쉬 배어 음이온 교환 수지 비드의 능력을 사용. X. 무대 배아 barhl2와 함께 전방 neuroepithelial 유도의 머리 인코딩의 mRNA와 4, 8 세포에 4 동물 할구에 주입했다 laevis의 오사출 추적 등 TX2, irx3 및 GFP. 안티 BMP 인자 머리의 발현은 BMP 경로를 억제하고 세포 AC 3 신경 ID를 제공한다. 우리는 Anteriorised 동물 모자 (AAC)로 머리를 표현 AC를 참조하십시오. Blastocoel 지붕 이식편은 분비 N 말단 부위의 조정 배지 (CM)에 침지 음이온 교환 수지 비드에 접촉 18 ° C에서 2 AACS 48 시간 동안 배양 한 후, 프로토콜에 기술 된 바와 같이 함유 제조하거나하지 않은 쥐에서 morphogen 소닉 고슴도치 (N-쉬). 쉬의 내인성 발현 ISH (도 2)에 의해 분석 하였다. Xenopus의 쉿 (Xshh)의 발현 N-쉬 (그림 2B)없이 CM에 배어 구슬과 접촉 세포에서 N-쉬 아니라 함께 CM에 배어 구슬과 접촉 세포에서 감지된다.
3 프로토콜을 이용하여 다른 유형의 세포의 능력은 하나로부터 분리하는 anoth어 조사 하였다. (X) laevis의 배아는 mRNA를 함께 또는의 Otx2, barhl2 및 irx3없이 머리 인코딩 무대 4, 8 세포에 4 동물 할구에 주입 된 바와 같이, 사용하고 ßGal 또는 GFP 추적자 (그림 3A) 등. 단계 8/9 AC들은 해리하고 ßGal- 및 GFP 발현 세포를 모두 포함하는 혼합 neuroepithelial 세포로 구성 절편을 생성하는 데 다시는 집계. reaggregated 외식은 18 ℃에서 48 시간 동안 배양 하였다. ßGal 활동 30 (그림 3A)에 따라 빨간색으로 밝혀졌다. 셀의 동작은 재 응집 이식편 내에서의 위치 파악을 따라 관찰되었다. AACS 세포의 Otx2 (적색) AACS 발현하는 세포와 혼합 이식편에서 ßGal 발현 세포에서는 GFP 발현 세포에서 자유롭게 혼합 된 세포의 두 가지 유형 (도 3B, 3C)을 분리하지 않는다. 이에 대하여,의세포 (GFP)을의 Otx2 발현 외식이 Barhl2,의 Otx2, Irx3 (BOI3) 발현 세포 (ßGal)와 혼합, ßGal 발현 세포 (적색) 응집력 패치를 형성하고, (재 집계 절편 내에 균일하게 확산되지 않습니다 그림 3D, 3E).
4 프로토콜 사용 AC 프로그래밍 셀의 동작은 생체 내에서 조사 하였다. X. 배아 barhl2과 irx3 혼자 또는 함께 하나의 Otx2와 머리 인코딩의 mRNA와 4, 8 셀 단계에서 4 동물 할구에 주입했다 laevis의. ßGal은 추적자로 사용되었다. 병행하여, 배아 유사의 mRNA가 머리 인코딩 및 쥐에서 morphogen 쉿의 분비 N- 말단 부분 (N-쉬) 주사 하였다. 단계 8/9에서 AC 외식은 해리하고 즉시 neuroepit로 구성된 혼합 절편을 생성하는 집계 다시helial 세포 중 하나를 표현하는 N-쉬와의 Otx2, 또는 표현 N-쉬와의 Otx2, Barhl2 및 Irx3 (BOI3). 혼합 외식의 작은 조각은 X의 신경 판에 이식되었다 무대 이식 세포가 ßGal 염색 (적색)으로 표시 하였다 (14)에 배아를 laevis의. 단계 35에서 내인성 쉬의 발현 ISH 의해 분석 하였다. X의 앞쪽에 신경 판으로 이식 할 때 배아, BOI3 및 N-쉬 발현하는 세포로 구성된 혼합 외식가 ZLI 세포의 특정 두 가지 기능을 개발 laevis의 : 이식 세포 Xshh을 표현하고 전방 neuroepithelial 세포 (그림 3C)에서 분리. 발현 세포 및 N-Shh- X.에 그래프트된다 - 혼합의 Otx2 이식편이 이루어지는 반면에 신경 판을 laevis의, 이식 세포는 쉿 표현하지 않았고 이웃 (그림 3B) (8)로부터 분리하지 않았다.
(X)에서 그림 1. 평면에 장착 된 신경 튜브 laevis의과 (X) tropicalis는 전체 마운트 더블 ISH 배아 (- D). WM-ISH를 사용하여 수행됩니다 fezf2, (A - C)에 프로브로 barhl2, irx1, irx3, 그리고 쉬 (X) 단계 (30, 32)에서 배아 laevis의, 및 35 (D) X. 단계 35에서 tropicalis 배아는 표시로. 대표 배아의 신경 튜브 해부 및 해부 신경 튜브 사이드 뷰, 지느러미까지, 전방 왼쪽에서 표시됩니다 프로토콜 1에 설명 된 바와 같이 평면 장착되어있다. 마커와 단계가 표시됩니다. P2의 주동이의와 꼬리 경계는 화살표로 표시됩니다. (AC) 스케일 바는 0.5 mm를 의미합니다. (D)의케일 바는 0.1 mm를 의미합니다. . st.30에서 전뇌 마커 (E) 도식은 barhl2 표현 도메인은 사선으로 표시됩니다; 표현의 영역은 fezf2 (핑크), 쉬 (적색), irx3 (노란색)과 irx1 (녹색)에 대한 표시됩니다. p는 prosomere을 의미합니다. P2의 상단에있는 송과선이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
음이온 교환 수지 비즈와의 접촉을 통해 프로그램 외식에 쉬 표현의 그림 2. 유도. 작은 AC들은 추적으로 GFP와, 머리, barhl2,의 Otx2 및 irx3에 대한 mRNA의 인코딩을 주입 배아에서 준비가되어 있습니다. AAC는 F 스탠드또는 Anteriorised 동물 모자. Barhl2,의 Otx2 및 Irx3 (AAC BOI3)를 표현 AAC 외식은 에어컨 매체에 배어 구슬 (CM) 중, N-쉬를 포함 여부를 지시 된 바와 같이 접촉에서 48 시간 동안 배양한다. 외식은 Xenopus의 (X) 쉬의 표현 ISH에 의해 분석된다. 스케일 바는 0.5 mm에 대한. 서 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
재 집계 외식 세포의 분리 동작 그림 3. 분석. (A) 표시된대로 X를 laevis의 배아는 머리,의 Otx2, barhl2 및 irx3에 대한 mRNA의 인코딩으로 주입된다. ßGal 및 GFP는 추적자로 사용된다. 단계에서 8/9 작은 AC를 준비하고 있습니다 해리 및 GFP / ßGal 혼합 세포 유형 이루어지는 이식편을 생성하는 재 응집이. 외식은 18 ℃에서 48 시간 동안 배양하고 ßGal 활동 (빨간색)를 공개한다. (B - E) 도시되는 바와 같이 단백질을 발현하는 세포로 이루어진 혼합 주제 이식편. AAC는 Anteriorised 동물 모자를 의미합니다. ACS 데이터 세포 발현 머리 (GFP)와 혼합하는 경우 (B, C) 머리와의 Otx2 (ßGal)를 표현하는 ACS 데이터 세포가 무작위로 확산. (C), (B)의 확대도. Barhl2,의 Otx2 및 Irx3 (BOI3) (ßGal)을 표현 (D) AACS 세포는 전열을 정비하고의 Otx2 (GFP)을 표현하는 AACS 세포로부터 분리. (E) (D)의 확대도. (B는 D) 규모의 바는 0.5 mm를 의미합니다. (C, E) 스케일 바는 0.2 mm를 의미합니다.G "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
단계 14 배아의 신경 판에 이식 할 때 그림 4. 프로그래밍 외식은 개발 기능을 나타낸다 (A) 실험 계획 :. 지시 된 바와 같이 AACS는 mRNA를 주입 배아에서 준비가되어 있습니다. 단계 blastocoel의 지붕에서 8/9 세포 해리되고 ßGal (적색) 발현 혼합 세포 유형 이루어지는 이식편을 생성하는 응집 재. 그들의 형제 자매가 전방 신경 판에서 절개에 투입 단계 (14) 혼합 된 절편 (녹색 사각형)의 작은 조각에 도달 할 때까지 외식 배양한다. 단계 (35) 운영 배아는 X를 사용하여 WM-ISH에 의해 분석 될 때까지 운영 배아는 성장 laevis의 쉬 (Xshh) 프로브로. ßGal 활동은 빨간 ACC에서 밝혀30 ORDING. (B, C) 단계의 이식면 35 대표적인 신경 튜브가 표시되어, 사이드 뷰, 지느러미까지, 전방 왼쪽. 및 N-의 Otx2 쉬 표현 혼합 AACS 그라프 (B). Barhl2,의 Otx2, Irx3 (BOI3) 및 N-쉬을 표현 혼합 된 AACS 그라프 (C). 이식 세포 레드 스타로 표시됩니다. 핑크 스타는 미래의 간뇌를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신경 개발은 (3,31,32 검토) 주변 조직에서 세포 발달 프로그램과 신호 사이의 복잡한 상호 작용에 의해 조율된다. 여기서 우리는 X.에 사용될 수있는 프로토콜의 집합을 기술 외부 및 신경 운명 결정과 시험관 및 생체 내에서 신경 형태 형성에 관여하는 본질적인 요소를 탐구하는 배아를 laevis의. 이러한 프로토콜은 X.에 그대로 사용 할 수있다 tropicalis 배아 그러나 X. tropicalis 배아는 X의 다음 네 번 작은 배아를 laevis의. 모두 필요성을 사용하는 집게와 텅스텐 바늘은 미세한한다. 가능하면 X를 사용 laevis의.
X의 정확한 시각화 laevis의과 (X) tropicalis 신경 histogenic 필드 WM- ISH 해부 신경 튜브 학적 평면 마운팅을 사용하여 달성 될 수있다. 이 기술은 X.에 성공적으로 수행 하였다 단계 26에 배아를 laevis의단계 45 (그림 1)과 X에서 tropicalis 45 8,33를 준비하는 단계 (30)로부터 배아. 이전 배아는 젊은 배아를 해부하기 쉽다. 이 기술은 수행이 용이하다. 그것은 상이한 발달 단계에서 신경 튜브 유전자 발현 패턴, 또는 결합 된 별도의 분석을 허용한다. 이 프로토콜로는 서로 신경 튜브의 한쪽을 쉽게 비교할 수있다. 이것은 Xenopus의 GOF과 LOF 실험에서 매우 유용하다. 신경 튜브의 주입면에 결함이 관찰 직접 제어 측면에서 관찰 정상적인 발달 이벤트와 비교 될 수있다. 이 전략은 X에서 GOF과 LOF 표현형을 분석하는 데 사용되었습니다 laevis의는 8,33 배아. 이 프로토콜의 하나의 중요한 단계는 배아 조직의 정확한 고정이다. 불완전한 고정은 신경 튜브에서 외배엽의 효율적인 분리를 방지 할 수 있습니다. 신경관의 사전 해부 앉아에의 침투를 용이하게U 프로브. 그러나 일단 격리, 이는 신경 튜브 손실하기 쉽다. 그것은 손실을 방지하기 위해 ISH 절차 동안 배아의 일부를 유지하는 것이 바람직하다.
모든 실험에 사용되는 배아는 견고하고 잘 치료해야 할 필요가있다. 건강에 해로운 배아의 배치를 폐기하십시오. 단계 13 단계 (15) 사이에 AC들과 이식 절편을 해부하기 위해이 X를 성장시킬 수있다 (12 ~ 18 ° C와 18 ~ 20 ° C로부터) 다양한 온도에서 외식 및 배아를 laevis의. 주목할만한 X. 배아 세포가 외부 영양제의 첨가없이 며칠 동안 생존 할 수 있도록 충분 laevis의 난황을 함유. , 배아, AC, 또는 이식편의 전송 절차를 배아 조직에 손상을주지하려면 신중하게 수행해야합니다. 이 필요한 경우 끝에서 끝 잘라 플라스틱 전송 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하는 것이 좋습니다. 선단의 직경은 배아의 크기, 또는 이식편의 크기로 조정하고, 전송한다.그것은주의의 가치, 0.1 % BSA 용액으로 코팅 피펫은 플라스틱에 조직의 작은 조각의 부착을 방지 할 수 있습니다.
AC 이식편 강제 유전자 발현을 통해, 또는 시간 및 공간 - 제어 방식으로 외적 요인들에 대한 노출을 통해 프로그래밍 될 수있다. 우리는 이식편와 비드 사이의 직접 접촉을 통해 로컬 유도를 허용하는 기술을 설명한다. 필요한 경우 비드는 상기 집게를 사용하여 단편화 할 수있다. 다른 전략 전술에 비해,이 방법은 순수한 요인 정확한 시간 창에서, 단독으로 또는 조합으로 로컬 유도 시험을 허용한다.
세포의 분리와 재 연관 (34)의 전술 한 방법을 사용하면, 그것을 협지 혼합 AC 이식편 8 세포 운동성 용량, 셀 분리 동작과 구획 경계의 형성을 조사 할 수있다. 세포 분리 과정은 이하에서 15 분에 시작한다. 흔들리는 피g 해리 단계 동안 플레이트는 세포의 손실을 방지 할 수있다. AC 색소 층이 잘 해리되지 않습니다. 그것은 해리 단계에서 제거하는 것이 좋습니다. AC 색소 층의 부부 재 집계 절편에 남아 있습니다. 그것은 이식을 시각화하는 데 도움이됩니다. 그것은 나중에 발달 단계에서 분석을 방해하지 않습니다.
신경 판을 자세히 설명으로이 원고에서 프로토콜이 혼합 된 외식을 이식한다. Xenopus의 배아에서 신경 판 단 (13)과 단 (15)이 단계는 neuroepithelium 내 이식에 따라서 적합한 사이에 열려 있습니다. (X) 접착 특성이 시간에 따라 변화 조직을 laevis의. 그것은 유사한 발달 단계에서 호스트로 AC 이식편을 이식하는 것이 중요합니다. 초기 발달 단계에서, (X) 매우 빠른 3/4 NAM 수리에서 자란 배아를 laevis의. 일부 배아 난황 막을 제거하는 동안 파손 된 경우는 15 분간을 기다려야하기 유용 할 수있다,이는 치유 과정이 발생하는 데 필요한 시간이다. 삽입 이식 숙주 조직에 유리 커버 슬립의 조각으로 바꾸어 선호 될 수 있지만, 그것은 필요하지 않다. 치유 과정에 의해 생성 된 힘은 그래프트 셀을 압출 할 수있다. 그래프트는 커버 슬립와 같이 외부 압력으로 강요 될 때 호스트 배아의 형태가 잘 유지된다. 이식의 성공 여부를 평가하기 위해, 형광 트레이서은 이식편에 주입 될 수있다. 신경관이 닫힐 때까지 이식 배아 내에서 형광 세포의 존재는 시각화 할 수 있습니다. AC 문화와 접목 실험의 주요 단점은 세균이나 곰팡이 오염의 주파수이다. 프로토콜의 모든 단계에서 요리 오염을 방지하기 위해 가능한 한 자주 청소하거나 멸균 재료와 멸균 솔루션을 사용합니다. 그래프트 배아의 장기간 배양에 항상 항생제와 15 ° C의 온도를 사용한다. AC 외식 또는 아가로 오스와 배아의 장기 접촉을 피하십시오. 우리는 observ이 이식편의 수명을 감소시킬 수 있다는 에디션. 그 래프팅 방법은 강력하지만 시간 소모적이다. 그것은과 운명을 결정 단서을 선별하는 것이 아니라 사전에 선택의 당신의 조직에 충분한 정보를 획득하지 않는 것이 좋습니다.
전통적인 장점 옆에, Xenopus의 최근 유전 발전이 길을 열어 모델 시스템은 깊은 RNA 염기 서열과 Chromatide 면역 침전 시퀀싱 (칩 SEQ) 5,35에 의해 대규모 게놈 분석을 사용하여 유전자 조절 네트워크를 탐험. 우수한 RNAseq 및 초기 배아 발달을 다루는 칩 서열 참조 데이터 세트가 있습니다. 칩 서열 분석 단점 중 하나는 많은 양의 재료를 수집 할 필요가있다. AC 이식편의 프로그래밍은 특정 신경 조직의 대량 생산을 가능하게하고, 적어도 부분적으로, 이러한 기술적 한계를 극복하는 데 도움이.
개발 프로그램 기본 신경관 기관ogenesis 크게 특히 척추 동물에 보존되어있다. 양서류를 사용하여 획득 한 정보는 척추 개발 25,32,36-38을 기본 세포 및 분자 프로세스의 이해에 도움이됩니다. 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) 분야의 최근 발전은 재생 의학 및 신약 개발의 연구를위한 게이트웨이를 열었습니다. iPSCs는 전사 인자의 조합을 사용하여 체세포에서 프로그래밍된다. 줄기 세포 프로그래밍 단서의 검색이 진행 중입니다. 분석법은 약물 스크리닝에 사용될 수있는 시험 관내 - 유도 신경 세포 유형을 생성하는 평균을 제공 여기 설명한다. 또한 iPSCs 39, 40의 추가 프로그래밍에 사용될 수 신경 운명 결정에 대해 테스트하는 저렴하고 빠른 방법을 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
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