Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Stamcellelignende Published: February 2, 2016 doi: 10.3791/53474
Automatic Translation
1,2,3,4
1Institut Curie, 2UMR 3387, CNRS, 3PSL Research University, 4Université Paris-Sud

Introduction

Virveldyr nervesystemet kommer fra det nevrale plate som et homogent lag av neuroepithelial celler. Forstå hvordan utviklingsprogrammene blir indusert, kodet, og etablert under regionalisering av nevrale plate er i dag, et hovedmål i utviklingsbiologi. Sammenlignet med andre systemer, er eksperimentelt mottagelig Xenopus embryo en modell av valget for å analysere tidlige trinn av nevral utvikling 1,2. Det er lett å få tak stort antall av embryoer, og ekstern utvikling gir tilgang til de aller første trinnene i neurulation tre. Mange verktøy er tilgjengelige for eksperimentelt manipulere Xenopus laevis (X. laevis) embryonal utvikling. Mikro-injeksjon av mRNA eller morpholinos (MO), inkludert induserbare Mos, sammen med biokjemiske og farmakologiske verktøy, tillater kontrollert gevinst på funksjon (GOF) og tap av funksjon (LOF) og spesifikk endring av signalveier 4,5. The blastocoel tak ektoderm, plassert rundt dyret pol av en blastula, eller et meget tidlig gastrula embryo, og refereres til som "Animal Cap '(AC), er en kilde til pluripotente celler som kan programmeres ved manipulering av genekspresjon før eksplantater forberedelse. I dette manuskriptet er detaljerte protokoller å bruke X. laevis AC explants å teste in vitro og in vivo molekylære mekanismer og cellulære prosesser underliggende nevrale utvikling.

En teknikk er presentert, slik fin observasjon av genutrykksmønster i en Xenopus rumpetroll nevralrøret, et tidlig trinn i identifiseringen av skjebnen besluttsomhet signaler. Mens observasjon av flatmontert vev er ofte brukt i studiet av kyllingfoster 6, det har ikke vært riktig beskrevet i Xenopus. Manipulering av genuttrykk ved å injisere syntetisk mRNA eller MO inn i blastomeres av 2 eller 4 celle scene embryoer tillater programmering av ACeksplantater 4. For eksempel hemming av Bone Morfogenetisk protein (BMP) veien ved ekspresjon av anti-BMP faktor Noggin, gir et nevralt identitet til AC-3 celler. Protokollen er beskrevet for å utføre lokal og tidsstyrt eksponering av AC-eksplantater til ytre signaler via direkte kontakt med en anionbytterharpiks vulst. Endelig en teknikk er beskrevet for testing utviklingstrekk av nevrale stamceller in vivo ved transplantasjon av blandede eksplantater preparert fra forskjellige programmerte celler dissosierte og re-forbundet.

Frosken embryo er en kraftig modell for å studere tidlig virveldyr neural utvikling. Kombinere manipulering av genuttrykk eksplanterer in vitro kulturer gir viktig informasjon i studiet av neuroepithelium regionalisering, spredning, og morphogenesis 7-12. Programmeringen av AC eksplantater tillatt utvikling av en funksjonell hjerte ex vivo 13,14. Brukenav eksplantat pode 15 førte til identifisering av den minimale induserende transkripsjonen bryteren neural crest differensieringsprogram 16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) er et signal senter som utskiller Sonic pinnsvin (Shh) for å kontrollere veksten og regionalisering av halebrain. Når kontinuerlig utsatt for Shh, neuroepithelial celler coexpressing de tre transkripsjonsfaktorer gener - barH lignende homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) og Iroquois-3 (irx3) - erverve to kjennetegn ved ZLI rommet: kompetanse til å uttrykke shh, og evnen til å skille fra fremre plate nevrale celler. Som modellsystem, vil induksjon av en ZLI skjebne i neuroepithelial celler bli presentert åtte.

Disse protokollene tar sikte på å gi enkle, billige og effektive verktøy for utviklings biologer og andre forskere til å utforske grunnleggende mechanisms av viktige nervecelle atferd. Disse protokollene er svært allsidig og la etterforskningen av et stort spekter av ytre og indre nevrale bestemmelses signaler. Det tillater langsiktig in vivo analyse av nevrale avstamning engasjement, induktive interaksjoner og celle atferd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimenter i samsvar med nasjonale og europeiske regler om beskyttelse av dyr som brukes til vitenskapelige formål og med internasjonalt etablerte prinsipper for erstatning, reduksjon og raffinement.

1. Flat-montering av Xenopus laevis Tadpoles Anterior nevralrøret Etter Whole-mount In Situ Hybridisering

  1. Skaff X. laevis embryoer i henhold til standardprosedyrer 4 og alder dem før de når neurula scenen 26 år og eldre (i henhold til Nieuwkoop og Faber utviklings tabell 17.
  2. Fix X. laevis tadpoles ved å inkubere dem i en oppløsning av 4% paraformaldehyd (PFA). Rock og roter embryoene i en 2 ml hetteglass, 1 til 1,5 time ved RT for scene 26 til scene 38 embryoer, 2 timer ved RT for embryoer på senere stadier.
    FORSIKTIG: PFA er giftig ved kontakt og en mistenkt kreftfremkallende. Det bør bli manipulert under en hette.
    MERK: One X. laevis stamfisk ervanligvis løst i en 2 ml hetteglass, men et større hetteglass kan anvendes.
  3. Vask embryoene i den samme flasken ved hjelp av 1 x PBS med 0,1% Tween (PBT), 3 minutter ved romtemperatur, to ganger.
    MERK: Med mindre annet er angi PBS som benyttes er med eller uten kalsium og magnesium.
  4. Dehydrere embryoene i 100% metanol (MeOH) i minst 12 timer ved romtemperatur i den samme beholderen. Endre MeOH 100% minst to ganger under panseret med en plast mikropipette.
    MERK: MeOH svinger svakt gul som lipider oppløst i den. Forsiktig den MeOH er giftig ved innånding og bør være manipulert under en hette.
  5. Rehydrere embryoene ved hjelp av den samme ampulle gjennom en gradert serie av MeOH-bad: MeOH 75% i PBS, 50% MeOH i PBS, 25% MeOH i PBS, PBS to ganger, hvert bad 5-10 min ved RT. MeOH'et løsninger er endret under panseret med en plast mikropipette.
  6. Ved hjelp av en plastpipette, overføre embryo for å bli dissekert i en 60 mm petriskål fylt til toppen med PBT. Ved hjelp av to fine tang omsorgfullstendig fjerne øynene ved å sette inn en fin pinsett mellom øynene og neural rør, ved nivået for den optiske stilken. Løsne øynene fra nevralrøret. Nøye innføre pinsett under ektoderm liggende nevralrøret. Med forsiktighet, skrelle av ektoderm fra bak hodet og kast den.
  7. Utfør en dobbel eller enkel ISH hjelp digoxigenin-merket eller fluoresceinmerkede sondene som tidligere beskrevet 18,19.
  8. Etter ISH overføre embryoene i et nytt 60 mm petriskål fylt til toppen med PBT ved hjelp av en plastpipette.
  9. Bruke fin pinsett forsiktig løsne nevralrøret fra resten av embryoet. På dette trinn, separerer den fremre neural røret fra den bakre neural røret. Nøye løsne øvrige deler av ektoderm liggende nevralrøret, ryggstreng som er løst festet under nevralrøret, otic vesikler og øvrige deler av mesoderm. Sørg for at nevralrøret er blottet for eventuelle vedleggpå dette stadium.
    MERK: For å unngå skade på nevralrøret utføre alle nevralrøret / embryo med en plast overføringspipetten eller en mikropipette om nødvendig med et tips kutt i enden. Diameteren på spissenden justeres til størrelsen av neural røret.
  10. Overfør dissekert neural røret (se note trinn 1,9) i et 1,5 ml rør fylt med 50% glycerol fortynnes i PBS. Vent til nerve rørene har falt ned til bunnen av den glycerol-løsning, vanligvis O / N ved 4 ° C.
  11. Fjerne oppløsning av 50% glycerol / PBS ved hjelp av en mikropipette P1000 og tilsett i samme 1,5 ml rør en oppløsning av 90% glycerol / PBS ved hjelp av en mikropipette P1000. Vent til nerve rørene faller til bunnen av den 90% glycerol / PBS-løsning, vanligvis O / N ved 4 ° C.
    MERK: for langtidslagring, bruker 90% glycerol / PBS pluss antibiotika for å hindre bakterieutvikling.
  12. Overfør nerve rørene på en glassplate eller et objektglass med en plast overføring pipette.
  13. Dissekt nevrale rør langs rygg og ventral midlines bruker wolfram nåler. I løpet av dette trinnet neural rørene blir holdt i 90% glyserol / PBS.
  14. Montere de to sidene av det nevrale røret i 90% glyserol / PBS ved hjelp av forsterkningsringer som er dekket med et dekkglass.
  15. Fest Dekk med lakk og holde ved 4 ° C.

2. Animal Cap eksplantater Induksjon Bruke anionbytterharpiks Perler

  1. Overfør 100 ul av anionvekslerharpiks perler inn i en 2 ml rør ved hjelp av en mikropipette P1000. Vask kulene minst fem påfølgende ganger med sterilt destillert vann. La perlene for å sedimentere ved bunnen av røret, og erstatte sterilt destillert vann ved hjelp av en mikropipette P1000. Ikke berør perlene.
  2. La perlene suge O / N i en 2 ml rør fylt med sterilt destillert vann med bovin serum albumin (BSA) (10 mg / ml) ved 4 ° C.
  3. To timer før innsamling av ACs, stedet halvparten av perlene i en ny 1,5 mlrøret ved hjelp av en mikropipette P1000. Sett på sterilt destillert vann med 500 ul av medium inneholdende molekylet som skal testes for sin induktive potensial, eller er kjent for å indusere en spesifikk skjebne. Hold den andre halvparten av kulene, som de vil bli brukt som en negativ kontroll.
  4. Inkubering av kulene ved 4 ° C i minst 2 timer.
  5. Utføre alle etterfølgende trinnene under stereomikroskop og utføre alle AC overføring med en mikropipette.
  6. Overfør blastula eller veldig tidlig gastrula embryoer i PBS med kalsium og magnesium supplert med 0,2% BSA med en plast overføringspipetten.
    MERK: Embryoet utvikler ved 12 ° C rekkevidde blastula og gastrula stadier i 20 til 24 timer.
  7. Fjern fosteret vitelline membran ved hjelp av tang som tidligere beskrevet 20. Fest embryo med en tang. Klem vitelline membranen med siden av de andre tang. Holder membranen, sakte skrelle den av embryo. Utfør denne prosedyren på ventral (vegetal) siden av embryo. Ikke skad dyret siden av embryo.
  8. Isolere små ACs som tidligere beskrevet 21. Dyret pole er fosteret pigmentert del. Bruke fin pinsett kutte ut en liten firkant av vev ut av dyret pol. AC vev inneholder kun de ectodermal celler. Sørg for at vevet er av jevn tykkelse. Hvis ikke, fjerner du vekselstrøm fra analysen.
  9. Plasser hver AC i en Terasaki multibrønnplater i 0.5x Modifiserte Barth Saline (MBS) 4. Plasser AC inn i brønnen med den pigmenterte dyr siden ned i kontakt med den runde bunnen av brønnen.
    MERK: belegg pipetter med en 0,1% BSA-oppløsning forhindrer adhesjon av små biter av klebemiddel vev til plast.
  10. Plasser en perle på hver cap ved hjelp av en mikropipette P20. Du kan eventuelt bruke pinsett for å forsiktig plassere perle i sentrum av hetten.
    MERK: Når dynket i en betinget medium, er perlene farget i rosa. Velg de fleste colored perler.
  11. Inkuber ved romtemperatur (18 til 22 ° C) i 6 timer uten å flytte på Terasaki flere brønner plate. Perlen holder seg til AC på mindre enn to timer.
  12. Plasser Terasaki multiwell plate på toppen av papirer dynket i vann. Dekk plate med en plastbeholder.
    NB: Denne "fuktighetskammeret 'forhindrer for tidlig fordampning av brønnene.
  13. Kultur ACs i 0,5x MBS eller tre kvart NAM (se trinn 4.1) i fuktighetskammeret ved 15-20 ° C inntil søskenembryoer har nådd den korrekte fasen for å teste effekten av faktoren.
  14. Fest ACs for en time i nylaget 4% PFA. Dehydrere ACs i 100% MeOH som beskrevet tidligere (trinn 1.4).

3. Animal Cap Cell Dissosiasjon og reaggregering Før Pode i en Xenopus laevis Neurula

  1. Coat petriskåler (60 mm) eller 12 brønner plater med 3% agarose i sterilt vann eller i PBS uten kalsium og magnesium. Legg nok agarose å dekke bottom av petriskålen eller brønnen. Forvarme platene ved romtemperatur (18-22 ° C). Eventuelt, som er lagret på platene for par dager ved 4 ° C for å forhindre dehydrering.
  2. Forbered kalsium-fri Holtfreter s saltvann (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) og Holtfreter s saltvann (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) 5. MERK: løsningen av CaCl 2 kan ikke autoklaveres.
  3. Fyll agarose-belagt godt til toppen med kalsium-free Holtfreter er saltvann.
  4. Forbered blastula eller veldig tidlig gastrula embryoer å isolere sine ACs som beskrevet tidligere (trinn 2.5 til 2.7).
  5. Isolere i det minste 15 eller opp til 30, liten ACs 21. Bruke fin pinsett kutte ut en liten firkant av vev ut av dyret pol. AC vev inneholder kun ectodermal celler, og er derfor av jevn tykkelse. Hvis ikke, fjerner du vekselstrøm fra analysen.
    MERK: Dyret pole er Embryo er pigmentert del.
  6. Overfør ACs inn en agarose-belagt godt fylt til toppen med kalsium-free Holtfreter er saltvann. Plasser ACs med sin pigmentert siden vendt oppover.
    MERK: dissosiasjon prosessen starter raskt i kalsium-free Holtfreter er saltvann.
  7. Vent noen minutter for cellene å starte dissociating. Observere dette gjennom dekomponering av vev. Bruke fin pinsett, skille pigmentert lag fra resten av AC og kast dem med en mikropipette P20. Fullstendig celledissosiasjon prosessen indikerer separering av cellene fra hverandre.
    MERK: En eller to pigment lag kan stå innenfor den re-aggregert eksplantat å hjelpe visualisering under pode.
  8. Sentrere celler ved hjelp av sirkulære bevegelser av platen. Ved hjelp av en mikropipette P1000 nøye fjerne så mye medium som mulig. Vær forsiktig så du ikke berører cellene.
  9. Tilsett 1 ml Holtfreter s saltvann med kalsium til brønnen. Overfør dissosierte ACsi et 1,5 ml rør.
    MERK: 2 ml rør kan ikke brukes på grunn av deres rund bunn.
  10. Pellet cellene ved sentrifugering, 5 min ved en maksimal hastighet på 2000 rpm i en benk sentrifuge (500 xg). Fjern forsiktig supernatanten med en mikropipette P1000.
  11. Legg til de dissosierte cellene 20 ul Holtfreter er saltvann med kalsium (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,9 mM CaCl 2, 4,6 mm HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5.
  12. Hold dissosiert ACs, 3 til 6 timer ved romtemperatur (18-22 ° C).
    MERK: Dette er nødvendig tid for å få cellene til å re-aggregat. Den re-aggregering er synlig når cellene danner en liten ball på bunnen av røret.
  13. Løsne eksplantatet forsiktig fra bunnen av røret ved å tilsette 1 ml av 0,5x MBS eller av 1 ml 3/4 NAM (se trinn 4.1). Overfør eksplantatet i en FN-belagt plate med en plast overføringspipetten.
  14. Iscenesette explants ved hjelp av sine kontroll søsken. For langsiktige bruk kultur antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), ampicillin (50 ug / ml) og gentamycin (50 pg / ml).

4. Negl Animal Caps explants i Neural Plate av X. laevis Embryo

  1. Forbered 3/4 NAM (110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO3, 0,2 x PBS, 50 ug / ml gentamycin). Ikke holde i mer enn en uke for disseksjon og oppbevares ved 4 ° C. Eldre NAM kan brukes for fremstilling av agarose-overtrukket disseksjon retter (nedenfor).
  2. Coat petriskåler (60 mm) med 3% agarose i 3/4 NAM inn som små hull er gjort ved hjelp av enten en silikon mold, eller forsiden av en bordtennisracket.
    BEMERK: agarose dekker bunnen av petriskålen. Være plass slik at petriskål å fylle med 3/4 NAM. Alternativt lage disseksjon retter med ikke-tørking modelleire. Innenfor leire, klem embryoene noe i løpet av disseksjon prosedyren. Dig små hull iagarose bruker avrundede tang Denne "disseksjon parabolen" bidrar til å holde embryoene under disseksjon prosedyren.
  3. Samle disseksjon verktøy: plast overføring pipetter, en 'øyenbryn kniv' (laget med øyenbryn hår i parafin på tuppen av et glass Pasteur pipette) 22, to fine disseksjon tang, P1000 mikropipette og tips, en stereosmicroscope med forstørrelse 8-40X, en sterk lyskilde med optisk fiber guider. Hold alle dissecting verktøy ren; etter hvert forsøk, skylles to ganger med destillert vann, en gang med 100% etanol og lar det tørke. Oppbevares vekk fra støv og om nødvendig autoklav metall dissecting verktøy.
  4. La dissosiert og re-aggregert ACs (protokoll 3), og deres søsken X. laevis embryoer utvikler til de når scenen 13 (neurula) i henhold til Nieuwkoop og Faber utviklings tabell 17. For transplantasjon innenfor det neurale platen trinnet 13 til trinn 15 embryoer blir brukt.
  5. Utføre allefølgende trinnene under stereomikroskop.
  6. Ved hjelp av en plast overføring pipette, overføres embryoene i PBS med kalsium og magnesium supplert med 0,2% BSA. Fjern fosteret vitelline membran som tidligere beskrevet 20. Fest embryo med en tang. Klem vitelline membranen med siden av de andre tang. Holder membranen fast, sakte skrelle den av embryo.
    MERK: Gjør denne prosedyren på ventral (vegetal) siden av embryo. Ikke skad embryoene nevrale plate. Hvis embryoer har blitt skadet under vitelline membran fjerningstrinn, overføre embryoene inn en 60 mm petriskål inneholder 3/4 NAM med en plast overføringspipetten og vente 15 min, en tilstrekkelig tid for helbredelsesprosessen å skje.
  7. Fyll ut disseksjon rett til toppen med friske 3/4 NAM.
  8. Bruk en plast transfer pipette, overføre embryoene uten deres vitelline membranen inn i disseksjon parabolen. Plasser embryoene ryggsiden opp ibrønnene. Under overføringen ikke tillater fosteret å gå inn i kontakt med luft-væske-grensesnittet siden X. laevis blir lysert ved overflatespenning.
  9. Overfør AC eksplantering å bli podet inn i disseksjon plate med en plast transfer pipette eller en mikropipette P1000. Når pipetten er inne i væsken, la explants å sakte synke ned av tyngdekraften, eller push veldig forsiktig.
  10. Oppretthold embryoene med avrundede tang. Med øyenbryn kniv lage et snitt i det nevrale plate hvor du har tenkt å pode din eksplantering verk.
    MERK: På scenen 14 fremre bøying av nevrale plate kan brukes som et landemerke, markerer det diencephalon territorium (figur 4).
  11. Klipp ut en liten del av neuroepithelium, ved hjelp av avrundede pinsett og et øyenbryn knive. Klipp et lite stykke eksplantering med øyenbryn kniv.
    MERK: stykke eksplantat bør være omtrent samme størrelse og form som neuroepithelium ablated området. Plasser stykke eksplantering inn i neuroepithelium snitt bruker øyenbryn kniv og fin pinsett. Sørg for at eksplantatet legger raskt til embryoet.
  12. Alternativt kan plassere et stykke glass dekkglass på de podede embryo for å opprettholde implantatet på plass. For å gjøre dette, kuttet en fin glass dekkglass i svært små biter som bruker grove tang. Pass på at størrelsen er omtrent 1,5 mm 2. Fordype bitene i en petriskål som inneholder 3/4 NAM eller PBS bruker tang. Velg et stykke glass større enn embryo for å unngå å skade den. Embryoet blir litt flattrykt.
  13. Vent minst 30 minutter uten å flytte, eller bare flytte dissekere plate forsiktig. La fosteret komme i 30 minutter til 2 timer og fjern forsiktig dekk om nødvendig. Nøye pipette de podet embryoer i en ren tallerken fylt med 3/4 NAM, ved hjelp av plast overføringspipetten.
    MERK: Podet embryo tendens til å utvikle bakterier eller sopp forurensning. For langsiktig cruk bruke antibiotika: kanamycin (50 ug / ml), ampicillin (50 ug / ml) og gentamycin (50 pg / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

På grunnlag av morfologiske faktorer i forskjellige arter, embryologiske manipulasjoner, og uttrykket mønster av regulatoriske gener, har en begrepsmodell som neural platen er oppdelt i tverrgående og langsgående segmenter som definerer en utviklingsmessig gittergenererende forskjellige histogenic felt. I nevrale plate, er det primordia av forhjernen, midthjernen, hindbrain og ryggmarg alle allerede etablert langs antero-posterior (AP) akse under gastrulation (anmeldt i 23-25). Under neurulation, kan histogenic feltene bli oppdaget som romlig avgrensede domener av genuttrykk. Basert på uttrykk mønstre av regulatoriske gener, er forhjernen primordium delt inn i seks transversale segmenter som genererer distinkte histogenic felt kalt prosomeres (p). Hver prosomere er delt inn i en ventral (basal) og en rygg (alar) del (Anmeldt i 26,27). I amfibier, den prosomere 2(p2) gir opphav til epithalamus og thalamus og til dens arrangøren Z ona L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (oversikt i 28,29).

På figur 1 er vist en flatskjerm-montering av X. laevis og X. Tropic anterior nevrale rør på stadier 30, 32 og 35 etter WM-oppvask. WM-ISH ble utført i henhold til protokoll 1 bruker prober for transkripsjonsfaktorer fezf2 som markerer telencephalon og p3, barhl2 som markerer p2, kortikale hems og midthjernen, Iroquois-en (irx1) og Iroquois-3 (irx3) som henholdsvis mark hale p2 og alare p2 og for morphogen shh som markerer ZLI, basal forhjerne og midthjernen (figur 1E). En sammenlignende analyse av de forskjellige genutrykksmønster avslører at den fremre grense av barhl2 p2 uttrykk ligger an hale grensen for fezf2 uttrykk i p3 (figur 1A). Irx3 er co-uttrykkes med shh i fremtiden ZLI (figur 1B). Inne p2 irx1 uttrykk domenet er komplementær til at av shh (figur 1C) 8. Uttrykket mønster av barhl2 i X. tropicalis på trinnet 35 er vist i figur 1D. Et skjematisk diagram av uttrykket områder av disse genene i utviklingsamfibier forhjernen er gitt i figur 1E.

Bruke protokoll 2 evne anionebytterharpiksen perler dynket i Shh å indusere shh uttrykk ble undersøkt i ACs eksplantater. X. laevis embryoer ble injisert i de 4 dyre blastomeres på 4 og 8-celler scenen med mRNA som koder for fremre neuroepithelial indus noggin sammen med barhl2, oTX2, irx3 og GFP som en injeksjon tracer. Ekspresjon av anti-BMP faktor Noggin hemmer BMP veien og gir en neural identitet til AC-3 celler. Vi viser til AC uttrykke Noggin som Anteriorised Animal Cap (AAC). Blastocoel tak eksplantater ble fremstilt som beskrevet i protokoll 2. AAC ble dyrket i 48 timer ved 18 ° C i kontakt med en anionbytterharpiks vulst fuktet i et kondisjonert medium (CM) som inneholder, eller ikke, det utskilte N-terminale delen av den morphogen Sonic pinnsvin fra rotte (N-Shh). Ekspresjon av endogent shh ble analysert ved ISH (figur 2). Ekspresjon av Xenopus shh (Xshh) påvises i cellene i kontakt med vulsten dyppet i CM med N-Shh, men ikke i celler som er i kontakt med vulsten dyppet i CM uten N-Shh (figur 2B).

Ved å bruke fremgangsmåte 3 evnen til forskjellige celletyper for å skille fra en another undersøkt. X. laevis embryoer ble injisert i de 4 dyr blastomeres på 4 og 8-celler stadium med mRNA som koder for noggin med eller uten otx2, barhl2 og irx3, som angitt, ved hjelp ßGal eller GFP som tracere (figur 3A). Stage 8/9 ACs ble skilt og re-aggregert å generere explants består av blandede neuroepithelial celler som inneholder både ßGal- og GFP-uttrykker celler. De reaggregert eksplantater ble dyrket i 48 timer ved 18 ° C. ßGal aktivitet ble avslørt i rødt i henhold til 30 (figur 3A). Oppførselen av celler ble observert ved å følge deres lokalisasjon innenfor de re-aggregert eksplantater. I eksplantater hvor AACS celler blir blandet med AACS celler som uttrykker Otx2 (rød), gjør ßGal-uttrykker cellene ikke skille fra GFP-uttrykke celler begge typer celler intermingled fritt (Figur 3B, 3C). I kontrast, ieksplantater hvor Otx2-uttrykker celler (GFP) er blandet med Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) -expressing celler (ßGal), de ßGal-uttrykker celler (rød) danner sammenhengende flekker og ikke spre jevnt i re-aggregert eksplantat ( Figur 3D, 3E).

Ved hjelp av protokoll 4, ble oppførselen til programmerte AC-celler undersøkt in vivo. X. laevis, embryoene ble injisert i de 4 dyr blastomeres på 4 og 8-celletrinn med mRNA som koder for noggin med otx2 enten alene eller sammen med barhl2 og irx3. ßGal ble anvendt som tracer. Parallelt ble embryoer injisert på lignende måte med mRNA som koder for noggin og det utskilte N-terminale del av morphogen shh fra rotte (N-shh). På scenen 8/9, ble AC eksplantater dissosiert og umiddelbart re-aggregert å generere blandede explants sammensatt av neuroepithelial celler enten uttrykker N-Hysj og Otx2, eller uttrykke N-Hysj og Otx2, Barhl2 og Irx3 (BOI3). Små biter av blandede eksplantater ble podet inn i nevrale plate av X. laevis embryoer ved trinn 14. Den podede celler ble merket med ßGal farging (red). På scenen 35 uttrykk for endogene shh ble analysert ved ISH. Når podet inn i fremre nevrale plate av X. laevis embryoer, blandet explants sammensatt av BOI3 og N-Shh uttrykker celler utviklet to funksjoner som er spesifikke for ZLI celler: de podet cellene uttrykte Xshh og segregert fra fremre neuroepithelial celler (Figur 3C). I motsetning til dette, når de blandes eksplantater sammensatt av Otx2 - og N-Shh- uttrykkende celler blir podet i X. laevis nevrale plate, gjorde podet cellene ikke uttrykke shh og ikke isolere seg fra sine naboer (Figur 3B) 8.


Figur 1. Flat montert nevrale rør fra X. laevis og X. tropic embryoer hel-mount dobbel ISH (A - D). WM-ISH er utført ved hjelp fezf2, barhl2, irx1, irx3 og shh som sonder på (A - C) X. laevis embryoer ved trinn 30, 32, og 35 og (D) X. tropicalis embryo ved trinn 35 som angitt. Nevrale rør av representative embryoer blir dissekert og flat montert som beskrevet i protokollen 1. De dissekerte neurale rør er vist fra et sideriss, dorsal opp, fremre venstre. Markørene og stadier indikeres. Rostral og caudal grensene for p2 er merket med piler. (AC) Målestokk står for 0,5 mm. (D) De scale bar står for 0,1 mm. . (E) Skjematisk av forhjerne markører på st.30 barhl2 uttrykk domenet er angitt i klekket linjer; Områder i uttrykket er vist for fezf2 (rosa), shh (rød), irx3 (gul) og irx1 (grønn). p står for prosomere. Pinealkjertelen plassert på toppen av p2 vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Induksjon av shh uttrykk i programmerte eksplantater via kontakt med anionvekslerharpiks perler. Små ACs er forberedt fra embryoer injisert med mRNA som koder for noggin, barhl2, otx2, og irx3, med GFP som tracer. AAC står feller Anteriorised Animal Cap. De AAC eksplantater uttrykker Barhl2, Otx2 og Irx3 (AAC BOI3) blir dyrket i 48 timer i kontakt med en perle dynket i en betinget medium (CM) enten inneholder N-Shh, eller ikke, som angitt. Eksplantene analyseres ved ISH for ekspresjon av Xenopus (X) shh. Målestokk står for 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Analyse av celle segregering oppførsel i re-aggregert eksplantater. (A)   X. laevis embryoer injiseres med mRNA som koder for noggin, otx2, barhl2 og irx3 som angitt. ßGal og GFP blir brukt som tracer. På scenen 8/9 små ACs er forberedt , Dissosiert og re-aggregert å generere explants laget av GFP / ßGal blandede celletyper. Eksplantene dyrkes i 48 timer ved 18 ° C og ßGal aktivitet åpenbares (rød). (B - E) Representative eksplantater består av blandet celler som uttrykker proteiner som angitt vises. AAC står for Anteriorised Animal Cap. (B, C) ​​ACs celler som uttrykker Noggin og Otx2 (ßGal) spredt tilfeldig når det blandes med ACs celler uttrykker Noggin (GFP). (C) forstørret riss av (B). (D) AACS celler som uttrykker Barhl2, Otx2 og Irx3 (BOI3) (ßGal) omgruppert og segregert fra AACS celler som uttrykker Otx2 (GFP). (E) forstørret riss av (D). (B, D) Målestokk står for 0,5 mm. (C, E) Målestokk står for 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Programmert eksplantater stille ut sine utviklingstrekk når podet i nevrale plate av en scene 14 embryo (A) Experimental ordning. AAC er forberedt fra embryoer injisert med mRNA som angitt. I trinn 8/9 celler fra taket av blastocoel dissosiert og re-aggregert for å generere eksplantater av blandet celletyper som uttrykker ßGal (rød). Eksplantene dyrkes inntil søsken nådd stadiet 14. En liten del av blandet eksplantat (grønn rektangel) er satt inn i et innsnitt i den anteriore neurale plate. Opererte embryoer er vokst til scenen 35. opererte embryoer blir analysert av WM-ISH bruker X. laevis shh (Xshh) som probe. ßGal aktivitet er avslørt i rødt according til 30. (B, C) ​​De podet sider av scenen 35 representative nevrale rør er vist, side utsikt, rygg opp, fremre venstre. (B) podet med blandede AAC uttrykker Otx2 og N-Shh. (C) podet med blandede AAC uttrykker Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) og N-Shh. Podet celler er merket med en rød stjerne. Den rosa stjerne indikerer potensiell diencephalon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neural utvikling er orkestrert av et komplekst samspill mellom cellulære utviklingsprogrammene og signaler fra de omkringliggende vev (Anmeldt i 3,31,32). Her beskriver vi et sett med protokoller som kan brukes i X. laevis embryoer for å utforske ytre og indre faktorer som er involvert i nerve skjebne bestemmelse og neural morphogenesis in vitro og in vivo. Disse protokoller kan anvendes som sådan på X. Tropic embryoer, men X. Tropic embryoer er fire ganger mindre deretter X. laevis embryoer. Både tang og tungsten nåler som brukes må være finere. Når det er mulig, bruker X. laevis.

Presis visualisering av X. laevis og X. Tropic nevrale histogenic felt kan oppnås ved bruk av histologiske flat montering av dissekert nevrale rør fra WM-ISH. Denne teknikken ble utført med hell på X. laevis embryoer fra scenen 26 tiltrinnet 45 (figur 1) og på X. tropic embryoer fra scenen 30 til trinn 45 8,33. Eldre embryoer er lettere å dissekere deretter yngre embryoer. Denne teknikken er enkel å utføre. Det tillater analyse av genuttrykk mønstre, hver for seg eller sammen, på nevrale rør på ulike utviklingsstadier. Med denne protokollen er det lett å sammenligne den ene side av en neural rør med den andre. Dette er svært nyttig i Xenopus GOF og LOF eksperimenter. De defekter på den injiserte side av det nevrale røret kan direkte sammenlignes med vanlige utviklingshendelser observert på styresiden. Denne strategien har blitt brukt til å analysere GOF og LOF fenotyper i X. laevis embryoer 8,33. Et viktig skritt i denne protokollen er riktig fiksering av embryonale vev. En ufullstendig fiksering hindrer effektiv avløsning av ektoderm fra nevralrøret. Den pre-disseksjon av nevralrøret letter penetrering av i situ sonder. Men en gang isolert, er det lett å miste nevrale rør. Det er tilrådelig å holde en del av embryo under ISH prosedyre for å forhindre tap.

Embryoene som benyttes for alle disse forsøk må være robust og trenger å gro godt. Kast alle batch av usunn embryoer. For å dissekere ACs og pode-eksplantater mellom fasen 13 og fasen 15 er det mulig å dyrke X. laevis eksplanter og embryoer ved forskjellige temperaturer (fra 12-18 ° C og 18-20 ° C). Verdt å merke seg X. laevis embryonale celler inneholder nok plomme til å tillate at deres overlevelse i flere dager uten tillegg av noen ytre næringsstoff. Å ikke skade de embryonale vev, eventuell overføring prosedyre av embryo, AC, eller eksplantering må gjøres nøye. Det anbefales å bruke enten en plast overføringspipetten eller mikropipette om nødvendig med et tips kutt i enden. Diameteren på tupp-enden er tilpasset størrelsen av embryoet, eller størrelsen av eksplantatet, som skal overføres.Det er verdt å merke, belegg pipetter med en 0,1% BSA løsning hindrer vedheft av små biter av vev til plast.

AC-eksplantater kan programmeres via tvinges genekspresjon, eller gjennom eksponering overfor ytre faktorer i en tids- og plass kontrollert måte. Vi beskriver en teknikk som tillater lokal induksjon via direkte kontakt mellom en explant og en vulst. Om nødvendig perlene kan bli ytterligere fragmentert ved hjelp av pinsett. Sammenlignet med andre tidligere beskrevne strategier, tillater testing av lokal induksjon med rene faktorer, alene eller i kombinasjon, i en nøyaktig tidsvindu denne teknikken.

Ved hjelp av en tidligere beskrevet metode for celledissosiasjon og re-krets 34, er det mulig å undersøke celle motilitet kapasiteter, celle segregering atferd, og dannelse av lommegrenser i klemt og blandet vekselstrøms eksplantater 8. Cellen dissosiasjon Prosessen starter på mindre enn 15 min. Unngå shaking platen under dissosiasjon skritt for å hindre tap av celler. AC pigmenterte lagene ikke distansere godt. Det anbefales å fjerne dem under dissosiasjon trinnet. Et par av AC pigmentert lag er igjen i re-aggregert eksplantat. Det hjelper i å visualisere pode. Det forstyrrer ikke analyse på senere utviklingsstadier.

I dette manuskriptet en protokoll for å transplantere blandede explants inn en neural plate er detaljert. I Xenopus embryo, er det nevrale plate åpen mellom scene 13 og scene 15. Disse stadiene er derfor hensiktsmessig for transplantasjon i neuroepithelium. X. laevis vev adhesive egenskaper endres med tiden. Det er viktig å pode vekselstrøms explants inn i en vert ved en lignende utviklingsstadiet. På tidlige utviklingsstadier, X. laevis embryoer dyrket i 3/4 NAM reparasjon ekstremt rask. Hvis noen embryoer er blitt skadet under fjerning av vitelline membranen kan det være nyttig å vente 15 min,som er den nødvendige tid for helbredelsesprosessen å oppstå. Innsetting kan bli favorisert ved å sette et stykke glass dekk på podet verten vev, men det er ikke et krav. Kraften som genereres av helbredelsesprosessen kan ekstrudere de podede celler. Morfologi av verten embryoet blir bedre bevart når implantatet blir tvunget inn i den med ytre trykk, som med et dekkglass. For å vurdere hvor vellykket pode, kan et fluorescerende tracer injiseres i explants. Tilstedeværelsen av fluorescerende celler i den podede embryo kan visualiseres inntil det nevrale røret lukkes. Den største ulempen i AC-kultur og pode eksperimenter er frekvensen av bakterier eller sopp forurensning. Bruk rene eller sterile materielle og sterile løsninger så ofte som mulig for å unngå fatet forurensning på hvert trinn av protokollen. For langtidskultur av podede embryoer alltid bruke antibiotika og en temperatur på 15 ° C. Unngå langvarig kontakt med AC eksplantater eller embryoer med agarose. Vi Observed at det kan redusere forventet levealder for eksplantatet. Podingen teknikken er kraftig, men tidkrevende. Det er ikke tilrådelig å screene for skjebnen besluttsomhet signaler med det, men å skaffe nok informasjon på din vev av valget på forhånd.

Foruten sine tradisjonelle fordeler, de siste genetiske fremskritt i Xenopus åpnet veien for dette modellsystem for å utforske genet regulatoriske nettverk ved hjelp av storstilt genomisk analyse av dyp RNA sekvensering og Chromatide Immunutfelling-sekvensering (ChIP-seq) 5,35. Det er utmerket RNAseq og Chip-Seq henvisning datasett som dekker tidlig embryoutvikling. En av chip-seq analyse ulempene er behovet for å samle inn store mengder materiale. Programmering av AC-eksplantater tillater produksjon av store mengder av en spesifikk nervevev, og i det minste delvis bidrar til å overvinne denne teknisk grense.

Utviklingsprogrammene underliggende nevralrøret organogenesis er i stor grad bevart, spesielt i virveldyr. Opplysninger innhentet ved hjelp av amfibier hjelper på forståelsen av cellulære og molekylære prosesser som ligger til grunn virveldyr utvikling 25,32,36-38. Nylige fremskritt innen Utførte Pluripotent stamceller (iPSCs) har åpnet opp gatewayer for forskningen i regenerativ medisin og medisiner. iPSCs programmeres fra somatiske celler ved bruk av en kombinasjon av transkripsjonsfaktorer. Jakten programmering signaler for stamceller pågår. Analysene beskriver her tilveiebringe et middel for å generere neural-avledet celletyper in vitro, som kan brukes i medikament-screening. De gir også en billig og rask måte å teste for nevrale fate determinants som kan brukes for videre omprogrammering av iPSCs 39,40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde VWR  20909.290 Toxic
anion exchange resin beads Biorad 140- 1231
Bovine Serum Albumin  SIGMA A-7888 For culture of animal cappH 7.6
Gentamycine  GIBCO 15751-045  antibiotic
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906  for bead preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
  2. Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
  3. Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
  4. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  5. Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
  6. Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
  7. Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
  8. Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
  9. Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
  10. Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
  11. Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
  12. Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
  13. Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
  14. Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
  15. Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
  16. Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
  17. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
  18. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
  19. Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
  20. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
  21. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
  22. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
  23. Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
  24. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  25. Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
  26. Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
  27. Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
  28. Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
  29. Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
  30. Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
  31. Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
  32. Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
  33. Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
  34. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
  35. Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
  36. Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
  37. Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
  38. Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
  39. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
  40. Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).

Tags

Developmental Biology Developmental Biology, Embryo nevrale pode segregering rommet Sonic HedgeHog forhjerne stem IPSC
Stamcellelignende<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonale eksplantater å studere Tidlig Neural utviklingstrekk<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; I Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Durand, B. C. Stem cell-like… More

Durand, B. C. Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (108), e53474, doi:10.3791/53474 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter