Introduction
O sistema nervoso de vertebrados emerge da placa neural como uma camada homogénea de células neuroepiteliais. Compreender como os programas de desenvolvimento são induzidas, codificado e estabelecido durante regionalização da placa neural é, actualmente, um dos principais objetivos em biologia do desenvolvimento. Em comparação com outros sistemas, o embrião Xenopus experimentalmente receptivo é um modelo de escolha para analisar etapas iniciais de 1,2 desenvolvimento neural. É fácil de obter um grande número de embriões, e desenvolvimento externo dá acesso aos primeiros passos de neurulação 3. Muitas ferramentas estão disponíveis para manipular experimentalmente Xenopus laevis (X. laevis) o desenvolvimento embrionário. A micro-injecção de ARNm ou morpholinos (MO), incluindo OMs indutíveis, em conjunto com as ferramentas bioquímicas e farmacológicas, permite que o ganho de função (GOF) e perda de função (LOF) e alteração específica de vias de sinalização 4,5 controlada. O blastocoel ectoderme telhado, localizada em torno do pólo do animal de uma blástula, ou um gástrula embrião precoce, e referido como o "tampão animal '(AC), é uma fonte de células pluripotentes, que pode ser programado por manipulação da expressão do gene antes da explantes preparação. Neste manuscrito são protocolos detalhados para usar X. explantes laevis AC para testar in vitro e in vivo em mecanismos moleculares e processos celulares desenvolvimento neural subjacente.
Uma técnica é apresentada, que permite a observação fina de padrões de expressão de genes em um tubo de girino Xenopus neural, um passo preliminar na identificação de sinais de determinação de destino. Considerando que a observação dos tecidos lisos-montado é comumente utilizada no estudo de embriões de galinha 6, que não foi correctamente descrita em Xenopus. Manipulação da expressão do gene através da injeção de mRNA sintético ou MO para os blastômeros de 2 ou 4 embriões em estágio de célula permite a programação de ACexplantes 4. Por exemplo inibição da proteína morfogenética óssea (BMP) via pela expressão do anti-BMP fator Noggin, dá uma identidade neural de células Cl 3. O protocolo é detalhado para a realização de exposição local e controlada no tempo de explantes AC aos sinais extrínsecos através de contacto directo com uma esfera de resina de permuta aniónica. Finalmente uma técnica está descrito para testes do desenvolvimento dos progenitores neurais in vivo por transplantação de explantes preparados a partir de células mistas distintas programado dissociados e re-associadas.
O embrião rã é um poderoso modelo para estudar o desenvolvimento neural vertebrado cedo. Combinando a manipulação da expressão génica explantar culturas in vitro fornece informações importantes no estudo do neuroepitélio regionalização, proliferação, e morfogénese 7-12. A programação de explantes AC permitido o desenvolvimento de um coração funcional ex vivo 13,14. O usoexplante de enxerto 15 levou à identificação do comutador de transcrição mínima induzir o programa de diferenciação crista neural 16. O intrathalamica limitans Zona (ZLI) é um centro de sinalização que segrega sonic hedgehog (Shh) para controlar o crescimento e regionalização da parte frontal do cérebro caudal. Quando continuamente exposto a Shh, as células gliais coexpress� os genes do factor de três de transcrição - barh-like homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (OTX2) e iroquois-3 (irx3) - adquirir duas características do compartimento de ZLI: a competência para expressar shh, ea capacidade de segregar a partir de células placa neural anterior. Como um sistema modelo, a indução de um destino ZLI em células neuroepiteliais será apresentado 8.
Estes protocolos visam fornecer e ferramentas eficientes simples e baratos para os biólogos do desenvolvimento e outros pesquisadores a explorar o mec fundamentaishanisms de comportamentos de células neurais chave. Estes protocolos são muito versáteis e permitem a investigação de uma vasta gama de sinais neurais de determinação extrínsecos e intrínsecos. Ele permite a longo prazo na análise in vivo de compromisso linhagem neural, interações indutivas e comportamentos celulares.
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Protocol
Experimentos cumpram a regulamentação nacional e comunitária relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos e com os princípios internacionalmente consagrados de substituição, redução e aperfeiçoamento.
1. Plano-montagem de Xenopus laevis girinos Tubo Neural Anterior Depois de Todo-mount Hibridização In Situ
- Obter X. laevis embriões de acordo com os procedimentos padrão 4 e idade eles até que atinjam neurula fase 26 e mais velhos (de acordo com Nieuwkoop e Faber mesa desenvolvimental 17.
- Fix X. laevis girinos, incubando-as numa solução de paraformaldeído a 4% (PFA). Rocha e rodar os embriões em um frasco de vidro de 2 ml, de 1 a 1,5 horas à temperatura ambiente para a fase 26, a fase 38 embriões, 2 h à TA durante embriões em fases posteriores.
CUIDADO: PFA é tóxico por contato e um cancerígeno. Deve ser manipulada sob um capuz.
NOTA: Uma X. laevis ninhada égeralmente fixa em um frasco de vidro de 2 ml de um frasco de vidro, mas maior pode ser usado. - Lavar os embriões no mesmo frasco utilizando 1x PBS com 0,1% de Tween (PBT), 3 min à temperatura ambiente, duas vezes.
NOTA: A menos que de outra forma especificado o PBS é utilizada com ou sem cálcio e magnésio. - Desidratar os embriões em 100% de metanol (MeOH) durante pelo menos 12 horas à temperatura ambiente no mesmo frasco. Alterar a 100% de MeOH, pelo menos, duas vezes sob o capô utilizando uma micropipeta de plástico.
NOTA: O MeOH ficar ligeiramente amarelada como lipídios dissolvidos nela. Cuidado o MeOH é tóxico por inalação e deve ser manipulado sob um capuz. - Reidratar os embriões utilizando o mesmo frasco através de uma série gradual de banhos de MeOH: 75% de MeOH em PBS, 50% de MeOH em PBS, 25% de MeOH em PBS, PBS, duas vezes, a cada banho de 5-10 min à temperatura ambiente. As soluções de MeOH são alteradas sob o capô utilizando uma micropipeta de plástico.
- Usando uma pipeta de plástico, transferir o embrião para ser dissecado em uma placa de Petri 60 milímetros cheio até o topo com PBT. Usando dois pinça fina cuidadosremover completamente os olhos através da inserção de uma pinça fina entre os olhos e do tubo neural, ao nível da haste óptica. Retire os olhos do tubo neural. Introduzir cuidadosamente a pinça abaixo do ectoderma do tubo neural. Com cuidado, retire o ectoderma a partir de trás da cabeça e descartá-lo.
- Executar uma ISH dupla ou simples usando digoxigenina marcado ou sondas marcadas com fluoresceína como previamente descrito 18,19.
- Após a ISH transferir os embriões numa nova placa de Petri 60 mm cheia até ao topo com PBT utilizando uma pipeta de plástico.
- Usando fórceps finos cuidadosamente separar o tubo neural do resto do embrião. Nesta fase, o tubo neural anterior separa do tubo neural posterior. Retirar cuidadosamente restantes partes do ectoderma do tubo neural, o notocórdio que é frouxamente ligado abaixo do tubo neural, as vesículas óticas e partes restantes da mesoderme. Certifique-se de que o tubo neural é desprovido de quaisquer apêndicesnesse estágio.
NOTA: Para evitar danos no tubo neural executar todas as transferências de tubo / embrião neural com uma pipeta de plástico ou uma micropipeta, se necessário, com um corte de ponta no seu final. O diâmetro da extremidade da ponta é ajustado para o tamanho do tubo neural. - Transferir o tubo neural dissecados (ver nota passo 1.9) em um tubo de 1,5 ml cheio com 50% de glicerol em PBS diluídas. Aguardar até que os tubos neurais tenham caído para a parte inferior da solução de glicerol, geralmente O / N a 4 ° C.
- Remover a solução de glicerol a 50% / PBS utilizando uma micropipeta P1000 e adicionar no mesmo tubo 1,5 ml de uma solução 90% glicerol / PBS utilizando uma micropipeta P1000. Aguardar até que os tubos neurais cair para o fundo da solução de glicerol a 90% / PBS, geralmente O / N a 4 ° C.
NOTA: Para o armazenamento a longo prazo, utilizar 90% de glicerol / PBS mais antibióticos para impedir o desenvolvimento bacteriano. - Transferir os tubos neurais em uma placa de vidro, ou uma lâmina de microscópio com uma pipeta de transferência de plástico.
- Disseita dos tubos neurais ao longo da dorsal e ventral midlines utilizando agulhas de tungstênio. Durante este passo, os tubos neurais são mantidas em glicerol a 90% / PBS.
- Montar os dois lados do tubo neural em 90% de glicerol / PBS utilizando anéis de reforço cobertos com uma lamela de vidro.
- Corrigir as lamelas com verniz e manter a 4 ° C.
2. Cap animal explantes de indução usando esferas de resina de troca aniónica
- Transferir 100 ul de pérolas de resina de permuta aniónica para um tubo de 2 mL, utilizando uma micropipeta P1000. Lavar os grânulos, pelo menos, cinco vezes consecutivas com água destilada estéril. Permitir que as esferas sedimentem no fundo do tubo e substituir a água destilada estéril usando uma micropipeta P1000. Não toque as contas.
- Deixar os grânulos embeber O / N num tubo de 2 mL cheias com água destilada estéril com Albumina de Soro Bovino (BSA) (10 mg / ml) a 4 ° C.
- Duas horas antes de coletar o ACs, lugar metade das pérolas em um novo 1,5 mltubo utilizando uma micropipeta P1000. Substituir a água destilada estéril com 500 ul do meio que contém a molécula a ser testada quanto à sua potencial indutivo, ou que se sabe induzir um destino específico. Mantenha a outra metade das pérolas, à medida que vai ser utilizado como um controlo negativo.
- Incubar as pérolas a 4 ° C durante pelo menos 2 horas.
- Realizar todas as etapas subseqüentes sob o microscópio estereoscópico e executar todas as transferências AC com uma micropipeta.
- Transferir blástula ou gástrula embriões muito precoces em PBS com cálcio e magnésio complementada com 0,2% de BSA utilizando uma pipeta de transferência de plástico.
NOTA: Os embriões em desenvolvimento a 12 ° C blástula e gástrula alcance estágios em 20 a 24 horas. - Remover membrana vitelina do embrião usando uma pinça, como previamente descrito 20. Corrigir o embrião com um fórceps. Comprima a membrana vitelina, com o lado das outras fórceps. Segurando a membrana, lentamente retire-a do embrião. Execute este procedimento no ventral (vegetal) lado do embrião. Não danifique o lado animal do embrião.
- Isolar pequenas ACs como descrito anteriormente 21. O pólo animal é parte pigmentada do embrião. Usando uma pinça fina cortar um pequeno quadrado de tecido para fora do pólo animal. O tecido AC contém apenas as células ectodérmicas. Assegure-se que o tecido é de espessura uniforme. Se não, remover a AC a partir da análise.
- Coloque cada AC em um Terasaki placas com múltiplas cavidades em 0,5x modificação de Barth Saline (MBS) 4. Coloque o AC no poço com seu lado animal pigmentada para baixo, em contacto com o fundo redondo do poço.
NOTA: pipetas de revestimento com uma solução de BSA a 0,1% evita a adesão de pequenos pedaços de tecido adesivo para o plástico. - Coloque uma pérola em cada tampa usando uma micropipeta P20. Se necessário, utilizar uma pinça para colocar cuidadosamente o grânulo no centro da tampa.
NOTA: Quando embebido em um meio condicionado, as contas são coloridos em rosa. Selecione o maior número de cogrânulos Lored. - Incubar a temperatura ambiente (18 a 22 ° C) durante 6 horas sem mover a placa com múltiplas cavidades Terasaki. O talão de varas para o AC em menos de 2 horas.
- Colocar a placa com múltiplas cavidades Terasaki no topo de papéis embebido em água. Cobrir a placa com um recipiente de plástico.
NOTA: Este 'câmara de umidade' impede a evaporação prematura dos poços. - Cultura do ACs em 0.5x MBS ou 3/4 NAM (veja o passo 4.1) na câmara de humidade a 15-20 ° C até que os embriões irmãos atingiram o estágio correto para testar o efeito do seu fator.
- Fixar o ACs durante 1 hora em recém-preparados PFA 4%. Desidratar o ACS 100% de MeOH como descrito anteriormente (Passo 1.4).
3. Cap animal dissociação celular e reagregação Antes miocárdio em Xenopus laevis nêurula
- Revestimento pratos de Petri (60 mm) ou poços de placas de 12 com 3% de agarose em água estéril ou em PBS sem cálcio e magnésio. Adicionar agarose suficiente para cobrir a bottom da placa de Petri ou do poço. Pré-aquecer as placas a temperatura ambiente (18-22 ° C). Opcionalmente, as placas armazenadas para alguns dias a 4 ° C para evitar a desidratação.
- Prepare isento de cálcio salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, KCl 0,7 mM, HEPES 4,6, 0,1% de ASB (A-7888 Sigma, pH 7,6)) e solução salina de Holtfreter (NaCl 60 mM, KCl 0,7 mM, CaCl 0,9 mM, 2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA, pH 7,6) 5. NOTA: a solução de CaCl 2 não pode ser autoclavado.
- Encha o bem até o topo com solução salina isenta de cálcio de Holtfreter revestidas de agarose.
- Prepare blástula ou gástrula embriões muito precoces para isolar os seus ACs como descrito anteriormente (passos 2.5 a 2.7).
- Isolar pelo menos 15 ou até 30, 21 ACs pequena. Usando uma pinça fina cortar um pequeno quadrado de tecido para fora do pólo animal. O tecido AC contém apenas células ectodérmicas e é, portanto, de espessura uniforme. Se não, remover a AC a partir da análise.
NOTA: O pólo animal é o Embryparte pigmentada de o. - Transfira as ACs em uma agarose-revestido bem cheio até o topo com livre-Calcium salina de Holtfreter. Coloque o ACs com seu lado pigmentado virado para cima.
NOTA: O processo de dissociação começa rapidamente nos livre de cálcio salina de Holtfreter. - Aguarde alguns minutos para que as células começam dissociar. Observar este através da desagregação dos tecidos. Utilizando finos fórceps, separar a camada pigmentada do resto da CA e descartá-las com uma micropipeta P20. Processo de dissociação de células indica completa separação das células a partir de uma outra.
NOTA: Uma ou duas camadas pigmentadas podem ser deixados dentro do explante re-agregadas para ajudar a visualização durante a enxertia. - Centre as células utilizando movimentos circulares do prato. Usando uma micropipeta P1000 remova cuidadosamente tanto meio quanto possível. Tenha cuidado para não tocar nas células.
- Adicionar 1 ml de solução salina de Holtfreter com o cálcio para o poço. Transfira as ACs dissociadaspara um tubo de 1,5 ml.
NOTA: 2 ml tubos não pode ser utilizado devido ao seu fundo redondo. - Agregar as células por centrifugação, 5 min a uma velocidade máxima de 2.000 rpm numa centrífuga de bancada para (500 xg). Remover cuidadosamente o sobrenadante com uma micropipeta P1000.
- Adicionar às células dissociadas 20 ul de solução salina de Holtfreter com cálcio (60 mM NaCl, KCl 0,7 mM, CaCl2 0,9 mM, HEPES 4,6 mM, 0,1% de BSA (Sigma A-7888 pH 7,6) 5.
- Manter o ACs dissociado, 3 a 6 horas à temperatura ambiente (18-22 ° C).
NOTA: Este é tempo necessário para que as células re-agregado. A re-agregação é visível como as células formam uma pequena bola na parte inferior do tubo. - Separe o explante cuidadosamente a partir do fundo do tubo por adição de 1 ml de 0.5x ou MBS de 1 ml de 3/4 NAM (ver passo 4.1). Transferir o explante em uma placa não revestida usando uma pipeta de transferência de plástico.
- Encenar os explantes usando seus irmãos de controle. Para longo prazo antibióticos de uso cultura: kanamyCIN (50 ug / ml), ampicilina (50 ug / ml) e gentamicina (50 ug / mL).
4. Alongamento das Caps animal explantes na Placa Neural de X. laevis Embryo
- Prepare 3/4 NAM (NaCl 110 mM, KCl 2 mM, 1 mM de Ca (NO3) 2, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 ug / ml de gentamicina). Não mantenha por mais de uma semana para a dissecção e armazenar a 4 ° C. NAM mais antigas podem ser utilizados para a preparação de pratos revestidos de dissecação-agarose (abaixo).
- Pratos de petri Brasão (60 mm) com 3% de agarose em 3/4 NAM em que pequenos buracos foram feitos usando um molde de silicone, ou a tampa de uma raquete de tênis de mesa.
NOTA: A agarose cobre o fundo do prato de petri. Deixe algum espaço para que o prato de petri para preencher com 3/4 NAM. Alternativamente fazer pratos de dissecação com massa de modelar não-secagem. Dentro da argila, espremer os embriões ligeiramente durante o procedimento de dissecção. Cavar buracos pequenos noagarose utilizando fórceps arredondadas Esta 'prato de dissecação' ajuda a manter os embriões durante o procedimento de dissecção. - Coletar ferramentas de dissecação: pipetas de transferência de plástico, uma "faca de sobrancelha '(feito com o cabelo da sobrancelha embebidos em parafina na ponta de uma pipeta de Pasteur de vidro) 22, duas pinças de dissecação finas, P1000 micropipeta e dicas, um stereosmicroscope com ampliação 8-40X, uma fonte de luz brilhante com guias de fibra óptica. Mantenha todas as ferramentas de dissecação limpa; após cada experimento, lave-os com água destilada duas vezes, uma vez com 100% de etanol e deixe secar. Armazene longe de poeira e, se necessário autoclave as ferramentas de metal de dissecação.
- Deixe o re-agregadas ACs (protocolo 3), e seus irmãos dissociados e X. embriões laevis desenvolver até atingirem fase 13 (neurula) de acordo com Nieuwkoop e Faber mesa desenvolvimental 17. Para o transplante dentro do palco placa neural 13 para estágio 15 embriões são usados.
- Realizar todosetapas subseqüentes sob o microscópio estereoscópico.
- Usando uma pipeta de transferência de plástico, transferir os embriões em PBS com cálcio e magnésio complementada com 0,2% de BSA. Remover membrana vitelina do embrião como previamente descrito 20. Corrigir o embrião com um fórceps. Comprima a membrana vitelina, com o lado das outras fórceps. Segurando a membrana firmemente, lentamente retire-a do embrião.
NOTA: Faça este procedimento no (vegetal) lado ventral do embrião. Não danificar os embriões placa neural. Se os embriões foram danificados durante o passo de remoção da membrana vitelina, os embriões transferir numa placa de Petri 60 mm contendo 3/4 NAM usando uma pipeta de transferência de plástico e esperar 15 minutos, um tempo suficiente para que o processo de cura ocorra. - Preencha o prato dissecção até o topo com fresco 3/4 NAM.
- Usando uma pipeta de plástico, transferir os embriões sem a sua membrana vitelina no prato dissecção. Coloque os embriões lado dorsal para dentroos poços. Durante o processo de transferência não permitem o embrião para entrar em contacto com a interface ar-líquido desde X. laevis são lisadas pela tensão superficial.
- Transferir o explante CA para ser enxertado na placa de dissecação, utilizando uma pipeta de transferência de plástico ou uma micropipeta P1000. Uma vez que a pipeta está dentro do líquido, permitir que os explantes a afundar lentamente para baixo pela gravidade, ou empurrar muito suavemente.
- Manter os embriões com uma pinça arredondados. Com a faca sobrancelha fazer uma incisão na placa neural onde você pretende enxertar pedaço do seu explante.
NOTA: Na etapa 14 a flexão anterior da placa neural pode ser usado como um ponto de referência, ele marca o território diencephalon (Figura 4). - Corte um pequeno pedaço de neuroepithelium, usando uma pinça arredondadas e um knive sobrancelha. Corte um pequeno pedaço do explante com a faca sobrancelha.
NOTA: O pedaço de explante deve ser aproximadamente o mesmo tamanho e forma como neuroepithelium área de ablação. Coloque o pedaço de explante na incisão neuroepithelium usando a faca sobrancelha e uma pinça fina. Assegure-se que o explante atribui-se rapidamente para o embrião. - Alternativamente coloque um pedaço de lamela de vidro para o embrião enxertada para manter o enxerto no local. Para fazer isso, cortar uma lamela de vidro fino em pedaços muito pequenos usando uma pinça grosseiras. Assegure-se que o tamanho é de aproximadamente 1,5 mm2. Mergulhe as peças em uma placa de Petri contendo 3/4 NAM ou PBS usando uma pinça. Escolha um pedaço de vidro maior do que o embrião para evitar danificá-lo. O embrião vai ser um pouco achatado.
- Aguarde pelo menos 30 minutos sem se mover, ou só se movem a placa de dissecação suavemente. Deixe o embrião recuperar durante 30 min a 2 h e remover suavemente a lamela se necessário. Pipetar cuidadosamente os embriões enxertados em um prato limpo preenchido com 3/4 NAM, usando a pipeta de transferência de plástico.
NOTA: Transplantado embriões tendem a desenvolver bactérias ou contaminação fúngica. Para a longo prazo cultura utilizar antibióticos: canamicina (50 ug / ml), ampicilina (50 ug / ml) e gentamicina (50 ug / mL).
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Representative Results
Com base em considerações morfológicas em espécies diferentes, manipulações embriológicos, e o padrão de expressão de genes reguladores, um modelo conceptual que prende a placa neural é dividida em segmentos longitudinais e transversais que definem uma grade de desenvolvimento gerar campos histogênica distintas. Na placa neural, o primórdio do cérebro anterior, mesencéfalo, rombencéfalo e medula espinal são já estabelecida ao longo do eixo ântero-posterior (AP), durante a gastrulação (revisto em 23-25). Durante neurulação, os campos histogênica pode ser detectado como domínios espacialmente restritos de expressão do gene. Com base nos padrões de expressão de genes reguladores, o primórdio prosencéfalo é dividida em seis segmentos transversais que geram campos histogênica distintas chamadas prosomeres (P). Cada prosomere é dividido em um ventral (basal) e uma (alar) parte dorsal (revisto em 26,27). Em anfíbios, o prosomere 2(p2) dá origem ao epithalamus eo tálamo e ao seu organizador a Z ona L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (revisto em 28,29).
Na Figura 1 são apresentados a-montagem plana de X. laevis e X. tropicalis anterior tubos neurais em fases 30, 32 e 35 após WM-prato. WM-ISH foram realizadas de acordo com o protocolo 1, utilizando sondas para os fatores de transcrição fezf2 que marca o telencéfalo e P3, barhl2 que marca p2, as bainhas corticais e do mesencéfalo, iroquois-1 (irx1) e iroquois-3 (irx3) que, respectivamente, marca p2 caudal e p2 alar e para o shh morfogénio que marca o ZLI, o cérebro anterior basal e mesencéfalo (Figura 1E). Uma análise comparativa dos vários padrões de expressão genética revela que o limite anterior de barhl2 Expressão P2 confina com o limite de caudal de expressão fezf2 em P3 (Figura 1A). Irx3 é co-expressa com Shh no futuro ZLI (Figura 1B). Dentro P2 domínio expressão irx1 é complementar à de Shh (Figura 1C) 8. O padrão de expressão de barhl2 em X. tropicalis na fase 35 é mostrado na Figura 1D. Um diagrama esquemático dos territórios destes genes no cérebro anterior anfíbio desenvolvimento expressão é fornecido na Figura 1E.
Usando o protocolo 2 a capacidade de esferas de resina de troca aniónica embebidas em Shh para induzir a expressão shh foi investigada em explantes SCA. X. laevis foram injectados em embriões os blastómeros 4 animais nos 4 e 8 células fase com mRNAs que codificam para o noggin indutor neuroepitelial anterior, junto com barhl2, óTX2, irx3 e GFP como um marcador de injecção. A expressão do factor anti-BMP Noggin inibe a via de BMP e dá uma identidade neural para células Cl 3. Referimo-nos a AC expressar Noggin como Anteriorised Cap Animal (AAC). Blastocoel telhado explantes foram preparados como descrito no Protocolo 2. Os AAC foram cultivadas durante 48 h a 18 ° C, em contacto com uma esfera de resina de permuta aniónica embebido num meio condicionado (CM) contendo, ou não, a parte N-terminal segregada de o ouriço Sonic morfogénio de rato (N-Shh). A expressão de Shh endógena foi analisada por Ish (Figura 2). A expressão de Shh de Xenopus (Xshh) é detectada em células em contacto com o talão embebido em CM com N-Shh, mas não em células em contacto com o talão embebido em CM sem Shh-N (Figura 2B).
Usando o protocolo 3 a capacidade de diferentes tipos de células para segregar de um another foi investigada. X. embriões laevis foram injectados em 4 blastómeros os animais na posição 4 e 8 células fase com ARNm que codifica para o noggin com ou sem OTX2, barhl2 irx3 e, como indicado, utilizando ßGal ou GFP como marcadores (Figura 3A). Estágio 8/9 ACs foram dissociadas e re-agregados para gerar explantes compostos de células gliais mistas contendo tanto ßGal- e GFP células que expressam. Os explantes foram cultivados avaliação reagregada durante 48 h a 18 ° C. actividade ßGal foi revelado em vermelho de acordo com a 30 (Figura 3A). O comportamento das células foi observada pela seguinte a sua localização dentro dos explantes re-agregados. Em explantes onde AAC células são misturadas com células que expressam AAC OTX2 (vermelho), as células que expressam ßGal não segregar a partir de células expressando GFP-ambos os tipos de células de permeio livremente (Figura 3B, 3C). Em contraste, nasexplantes onde as células (GFP) OTX2 expressam são misturados com Barhl2, OTX2, Irx3 (BOI3) células -expressing (ßGal), as células que expressam ßGal (vermelho) formam manchas coesas e não espalhar uniformemente dentro do explante re-agregados ( Figura 3D, 3E).
Usando o Protocolo 4, o comportamento de células programadas AC foi investigada in vivo. X. laevis foram injectados em embriões os blastómeros 4 animais nos 4 e 8 células fases com mRNAs que codificam para noggin com OTX2 quer isoladamente ou em conjunto com barhl2 e irx3. ßGal foi utilizado como traçador. Em paralelo, os embriões foram injectados similarmente com ARNm que codifica para o noggin e secretado a parte N-terminal de Shh o morfogénio a partir de ratos (N-shh). Na fase 8/9, AC explantes foram dissociadas e imediatamente re-agregados para gerar explantes mistos, compostos por neuroepithelial células expressando quer N-Shh e OTX2, ou expressando N-Shh e OTX2, Barhl2 e Irx3 (BOI3). Pequenos pedaços de explantes mistos foram enxertados na placa neural de X. laevis embriões na fase 14. As células enxertadas foram marcados com coloração ßGal (vermelho). Na fase 35 a expressão de Shh endógena foi analisada por Ish. Quando enxertados na placa neural anterior do X. laevis embriões, explantes mistos, compostos de N-BOI3 e células que expressam Shh desenvolvido duas características específicas de células: as células Zli enxertadas Xshh expressa e segregada das células neuroepiteliais anterior (Figura 3C). Em contraste, quando os explantes misto composto de OTX2 - e N-Shh- que expressam células são enxertados na X. laevis placa neural, as células enxertadas não expressam Shh e não segregaram dos seus vizinhos (Figura 3B) 8.
Figura 1. tubos neurais Liso-montado de X. laevis e X. tropicalis embriões todo-mount duplo ISH (A - D). WM-ISH é realizada utilizando fezf2, barhl2, irx1, irx3 e shh como sondas sobre (A - C) X. laevis embriões em fases 30, 32, e 35 e (D) X. tropicalis embriões na fase 35, como indicado. Os tubos neurais de embriões representativos são dissecados e plana, como descrito no protocolo 1. Os tubos neurais dissecados são mostrados a partir de uma vista lateral, dorsal para cima, esquerda anterior. Os marcadores e fases estão indicadas. Os limites rostral e caudal de p2 são indicados com setas. A barra de escala (AC) representa 0,5 mm. (D) Os scale bar representa 0,1 mm. . (E) Esquema de marcadores do prosencéfalo em E-30 barhl2 domínio expressão é indicado em linhas tracejadas; Áreas de expressão são mostrados para fezf2 (rosa), shh (vermelho), irx3 (amarelo) e irx1 (verde). p significa prosomere. A glândula pineal localizada no topo de p2 é mostrado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A indução da expressão de Shh em explantes programadas através do contato com contas de resina de troca aniônica. Pequenas ACs são preparados a partir de embriões injetados com codificação de mRNA para noggin, barhl2, OTX2, e irx3, com GFP como marcador. AAC está fou Cap animal Anteriorised. Os explantes AAC expressam Barhl2, OTX2 e Irx3 (AAC BOI3) são cultivadas durante 48 horas em contacto com um grânulo embebido num meio condicionado (CM) contendo ambos os N-Shh, ou não, tal como indicado. Os explantes são analisados por Ish para a expressão de Xenopus (X) Shh. A barra de escala representa de 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise de comportamento segregação celular em explantes de re-agregados. (A) X. laevis embriões são injetados com codificação de mRNA para noggin, OTX2, barhl2 e irx3 como indicado. ßGal e Gfp são utilizados como traçador. Na etapa 8/9 pequenas ACs são preparados , Dissociados e re-agregados para gerar explantes feitas de Gfp / ßGal tipos de células mistas. Os explantes são cultivados durante 48 h a 18 ° C e a actividade é revelada ßGal (vermelho). (B - E) explantes representativos compostos de células que expressam proteínas mistas como indicado são mostrados. AAC significa Cap animal Anteriorised. (B, C) células que expressam ACs Noggin e OTX2 (ßGal), distribuídos aleatoriamente quando misturado com células ACs expressar Noggin (GFP). (C) vista ampliada de (B). Células (D) AACS expressam Barhl2, OTX2 e Irx3 (BOI3) (ßGal) se reagruparam e segregados a partir de células que expressam OTX2 AACS (GFP). (E) vista ampliada de (D). (B, D) A barra de escala representa 0,5 mm. (C, E) A barra de escala representa 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Programado explantes expor seus recursos de desenvolvimento quando enxertados na placa neural de um estágio embrionário 14 (A) esquema Experimental:. AACs estão preparados a partir de embriões injetados com mRNAs como indicado. Na fase 8/9 células do telhado do blastocele são dissociados e re-agregados para gerar explantes feitas de tipos de células que expressam ßGal mistos (vermelho). Os explantes são cultivados até que seus irmãos chegaram a fase 14. Um pequeno pedaço de explante misto (retângulo verde) é colocado em uma incisão dentro da placa neural anterior. Embriões operados são cultivados até o estágio 35. embriões operados são analisados por WM-ISH usando X. laevis shh (Xshh) como sonda. ßGal atividade é revelada em acc vermelhoording a 30. (B, C) Os lados enxertadas de estágio 35 tubos neurais representativos são mostrados, vista lateral, dorsal para cima, esquerda anterior. (B) enxertado com AACs mistos expressam OTX2 e N-Shh. (C) enxertado com AAC mistos que expressam Barhl2, OTX2, Irx3 (BOI3) e N-Shh. Células enxertadas são indicados com uma estrela vermelha. A estrela rosa indica o diencephalon potencial. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Desenvolvimento neural é orquestrado por uma complexa interação entre os programas de desenvolvimento celulares e sinais dos tecidos circundantes (revisto em 3,31,32). Descrevemos aqui um conjunto de protocolos que podem ser utilizados em X. laevis embriões para explorar extrínsecos e intrínsecos factores envolvidos na determinação do destino neural e morfogénese neuronal in vitro e in vivo. Estes protocolos podem ser utilizados como tal em X. embriões tropicalis, no entanto X. embriões tropicalis são quatro vezes menor que X. laevis embriões. Ambos os fórceps e as agulhas de tungstênio usados necessidade de ser mais fino. Quando possível, use X. laevis.
Visualização exacta de X. laevis e X. campos histogênica neurais tropicalis pode ser conseguida utilizando a montagem plana histológica de tubos neurais dissecados a partir de WM ISH. Esta técnica foi realizada com sucesso em X. laevis embriões de fase de 26 afase 45 (Figura 1) e em X. tropicalis embriões de estágio para estágio 30 45 8,33. Embriões mais velhos são mais fáceis de dissecar embriões em seguida, mais jovens. Esta técnica é fácil de executar. Ele permite a análise de padrões de expressão gênica, separadamente ou combinados, em tubos neurais em diferentes estágios de desenvolvimento. Com este protocolo, é fácil comparar um lado de um tubo neural com o outro. Isto é muito útil em experiências de Xenopus e GOF LOF. Os defeitos observados do lado injectado do tubo neural pode ser comparado directamente com eventos normais de desenvolvimento observados no lado de controlo. Esta estratégia tem sido utilizada para analisar GOF e LOF fenótipos em X. laevis embriões 8,33. Um passo importante neste protocolo é a fixação correta dos tecidos embrionários. Uma fixação incompleta impede o desprendimento eficiente da ectoderme do tubo neural. O pré-dissecção do tubo neural facilita a penetração de no sitsondas u. No entanto, uma vez isolado, é fácil perder os tubos neurais. É aconselhável manter parte do embrião durante o procedimento ISH para evitar qualquer perda.
Os embriões utilizados para todas essas experiências precisam ser robusta e precisa curar bem. Rejeitar qualquer lote de embriões saudáveis. A fim de dissecar ACs e explantes de enxerto entre o estágio 13 e 15 de fase é possível crescer X. laevis explantes de embriões e a várias temperaturas (a partir de 12-18 ° C e 18-20 ° C). X. Noteworthy laevis células embrionárias gema conter o suficiente para permitir a sua sobrevivência durante vários dias, sem adição de qualquer nutriente externa. Para não danificar os tecidos embrionários, qualquer procedimento de transferência de embrião, CA, ou o explante tem de ser feito com cuidado. É aconselhável usar uma pipeta de transferência de plástico ou micropipeta, se necessário, com um corte de ponta no seu final. O diâmetro da extremidade da ponta é ajustado para o tamanho do embrião, ou o tamanho de explante, a ser transferido.É digno de notar, pipetas de revestimento com uma solução de BSA a 0,1% evita a adesão de pequenos pedaços de tecido para o plástico.
Explantes de corrente alternada pode ser programado através de expressão do gene forçada, ou através da exposição a factores extrínsecos de uma maneira controlada tempo e espaço. Nós descrevemos uma técnica que permite a indução local através de contato direto entre um explante e um cordão. Se necessário, os grânulos podem ser mais fragmentados utilizando fórceps. Em comparação com outras estratégias anteriormente descritas, esta técnica permite o teste de indução local com factores puros, isolados ou em combinação, numa janela de tempo precisos.
Usando uma abordagem descrita previamente de dissociação de células e re-associação 34, é possível investigar a capacidade de motilidade celular, comportamentos de segregação de células, e a formação de limites de compartimento em ensanduichada e AC misturado explantes 8. O processo de dissociação de células começa em menos de 15 min. Evite shaking a placa durante o passo de dissociação para prevenir a perda de células. As camadas pigmentadas AC não se dissociam bem. Recomenda-se a removê-los durante a etapa de dissociação. Um par de camadas pigmentadas AC são deixados no explante re-agregados. Ele ajuda na visualização do enxerto. Não interfere com a análise em fases posteriores de desenvolvimento.
Neste manuscrito um protocolo para transplante explantes misturadas em uma placa neural é detalhado. Em embriões de Xenopus, a placa neural está aberta entre as 13 e estágio estágio 15. Estes estágios são, portanto, adequado para transplante dentro do neuroepitélio. X. laevis tecidos propriedades adesivas mudam com o tempo. É importante para enxertar explantes AC em um host em um estágio de desenvolvimento semelhante. No primeiros estágios de desenvolvimento, X. laevis embriões cultivados em 3/4 reparação NAM extremamente rápido. Se alguns embriões foram danificados durante a remoção da membrana vitelina que pode ser útil de esperar 15 minutos,que é o tempo necessário para o processo de cura ocorra. A inserção pode ser favorecida, colocando um pedaço de lamela de vidro para o tecido hospedeiro enxertado, mas não é um requisito. A força gerada pelo processo de cura pode extrudir as células enxertadas. Morfologia do embrião hospedeiro é melhor preservada quando o enxerto é forçado a isso com pressão externa, como com uma lamela. Para avaliar o sucesso do enxerto, um marcador fluorescente pode ser injectado nos explantes. A presença de células fluorescentes dentro do embrião enxertado pode ser visualizado até que fecha o tubo neural. A principal desvantagem em cultura e experiências de enxertia AC é a freqüência de bactérias ou contaminação fúngica. Use soluções de materiais e estéreis limpas ou estéreis o mais rápido possível para evitar a contaminação prato em cada etapa do protocolo. Para a cultura de longo prazo de embriões enxertados sempre utilizar antibióticos e uma temperatura de 15 ° C. Evite o contato de longo prazo de explantes CA ou embriões com agarose. Nós observoed que pode diminuir a expectativa de vida do explante. A técnica de enxertia é poderosa, mas demorado. Não é aconselhável para pesquisar sinais de determinação de destino com ele, mas para adquirir informações suficientes sobre o seu tecido de escolha de antemão.
Ao lado de suas vantagens tradicionais, os avanços genéticos recentes em Xenopus abriu o caminho para esta sistema modelo para explorar redes de regulação de genes utilizando análise genômica em larga escala por seqüenciamento RNA profunda e chromatide Immunoprecipitation-seqüenciamento (ChIP-seq) 5,35. Existem excelentes RNAseq e conjuntos de dados de referência Chip-Seq que abrangem o desenvolvimento embrionário precoce. Um dos inconvenientes de análise de chip SEQ é a necessidade de recolher grande quantidade de material. Programação de explantes AC permite a produção de uma grande quantidade de um tecido neural específico, e, pelo menos parcialmente, ajuda a superar este limite técnico.
Os programas de desenvolvimento do tubo neural subjacente órgãoogenesis são largamente conservada, especialmente em vertebrados. As informações obtidas usando anfíbios ajuda na compreensão dos processos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento dos vertebrados 25,32,36-38. Os recentes progressos no domínio das células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) abriu gateways para a pesquisa em medicina regenerativa e descoberta de drogas. iPSCs são programados a partir de células somáticas, utilizando uma combinação de factores de transcrição. A busca de pistas de programação para as células-tronco está em curso. Os ensaios descrevem aqui proporcionam um meio para gerar tipos de células derivadas de neurais in vitro que podem ser utilizados no rastreio de fármacos. Eles também fornecem uma maneira barata e rápida para testar determinantes destino neurais que podem ser usados para uma nova reprogramação dos iPSCs 39,40.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
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