Introduction
Det ryggradsdjur nervsystemet utträder från neurala plattan som ett homogent skikt av neuroepitelceller. Att förstå hur utvecklingsprogram induceras, kodas, och etablerades under regionalisering av neurala plattan är för närvarande ett viktigt mål i utvecklingsbiologi. Jämfört med andra system, är den experimentellt mottaglig Xenopus embryo en modell av val för att analysera tidiga stegen av neural utveckling 1,2. Det är lätt att få ett stort antal embryon, och extern utveckling ger tillgång till de allra första stegen i neurulation 3. Många verktyg är tillgängliga för att experimentellt manipulera Xenopus laevis (X laevis) embryonal utveckling. Mikroinjektion av mRNA eller morpholinos (MO), inklusive inducerbara MO, tillsammans med biokemiska och farmakologiska verktyg, möjliggör kontrollerat funktionsökning (GOF) och förlust av funktion (LOF) och specifik förändring av signalvägar 4,5. Blastocoel tak ektoderm, ligger runt djuret polen i en blastula eller en mycket tidig gastrula embryo, och kallas "Animal Cap" (AC), är en källa av pluripotenta celler som kan programmeras genom manipulation av genuttryck före Explantat beredning. I detta manuskript är detaljerade protokoll att använda X. laevis AC explants att testa in vitro och in vivo molekylära mekanismer och cellulära processer som ligger bakom neurala utveckling.
En teknik presenteras, vilket gör fina observation av genexpressionsmönster i en Xenopus grodyngel neuralrörsdefekter, ett första steg i fastställandet av ödet bestämnings ledtrådar. Medan observationen av platta monterade vävnader används vanligen i studien av kycklingembryon 6, har det inte blivit korrekt beskrivits i Xenopus. Manipulering av genuttryck genom att injicera syntetisk mRNA eller MO i blastomerer av 2 eller 4 cell skede embryon tillåter programmering av ACExplantat 4. Exempelvis hämning av benmorfogenetiskt protein (BMP) -vägen genom uttryck av anti-BMP-faktor Noggin, ger en neural identitet till AC-celler 3. Protokollet specificeras för utförande lokal och tidsstyrt exponering av växelströms explantat till extrinsiska ledtrådar via direkt kontakt med ett anjonbytarharts pärla. Äntligen en teknik beskrivs för att testa utvecklings egenskaper hos neurala stamceller in vivo genom transplantation av blandade explantat framställda från olika programmerade celler dissocierade och åter associerade.
Grodan embryo är en kraftfull modell för att studera tidiga ryggradsdjur neural utveckling. Kombinera manipulation av genuttryck till explantation in vitro kulturer ger viktig information i studiet av neuroepithelium regionalisering, spridning och morfogenes 7-12. Programmeringen av AC explants tillåtet utvecklingen av en fungerande hjärta ex vivo 13,14. Användningenav Explantation ympning 15 ledde till identifieringen av den minimala transkriptions omkopplaren inducerar neurallisten differentieringsprogram 16. Zona limitans intrathalamica (ZLI) är en signalering som utsöndrar sonic hedgehog (Shh) för att kontrollera tillväxten och regionaliseringen av den kaudala framhjärnan. När löpande utsatt för Shh, neuro celler samuttrycker de tre transkriptionsfaktorgener - barH liknande homeobox-2 (barhl2), orthodenticle-2 (otx2) och Iroquois-3 (irx3) - förvärvar två egenskaper hos ZLI facket: befogenhet att uttrycka shh, och förmågan att segregera från främre neurala plattceller. Som modellsystem, kommer induktion av en ZLI öde i neuro celler presenteras 8.
Dessa protokoll syftar till att ge enkla, billiga och effektiva verktyg för utvecklingsbiologer och andra forskare att utforska den grundläggande mechanisms av viktiga nervcells beteenden. Dessa protokoll är mycket mångsidig och tillåter undersökning av ett stort utbud av yttre och inre neurala bestämnings ledtrådar. Det tillåter långsiktigt in vivo analys av neurala härstamning engagemang, induktiva interaktioner och cell beteenden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experiment överensstämmer med nationell och europeisk lagstiftning om skydd av djur som används för vetenskapliga ändamål och med internationella principer för ersättning, begränsning och förfining.
1. Platt-montering av Xenopus laevis grodynglar Anterior Neural Tube Efter Whole-mount In Situ Hybridisering
- Erhåll X. laevis embryon enligt standardprocedurer 4 och ålder dem tills de når neurula etapp 26 år och äldre (enligt Nieuwkoop och Faber utvecklings tabell 17.
- Fix X. laevis grodyngel genom att inkubera dem i en lösning av 4% paraformaldehyd (PFA). Rock och rotera embryona i en 2 ml glasflaska, 1 till 1,5 timme vid RT för steg 26 till steg 38 embryon, 2 h vid RT för embryon vid senare skeden.
VARNING: PFA är giftigt vid kontakt och en misstänkt cancerframkallande. Det bör manipuleras i dragskåp.
OBS: One X. laevis yngel ärvanligtvis fixerad i en 2 ml glasampull men en större glasflaska kan användas. - Tvätta embryona i samma ampull med användning 1x PBS med 0,1% Tween (PBT), 3 min vid RT, två gånger.
OBS: Om inget annat anges PBS som används är med eller utan kalcium och magnesium. - Dehydratisera embryon i 100% metanol (MeOH) under minst 12 timmar vid rumstemperatur i samma ampull. Ändra MeOH 100% åtminstone två gånger under huven med hjälp av en plast mikropipett.
OBS: MeOH vänder svagt gul som lipider upplösta i den. Varning MeOH är giftig vid inandning och bör manipuleras i dragskåp. - Rehydrera embryona med samma flaskan genom en graderad serie av MeOH bad: MeOH 75% i PBS, MeOH 50% i PBS, MeOH 25% i PBS, PBS två gånger, varje bad 5-10 min vid rumstemperatur. MeOH lösningarna ändras under huven med hjälp av en plast mikropipett.
- Med hjälp av en plast pipett embryot att dissekeras i en 60 mm petriskål fylld till toppen med PBT. Med hjälp av två fin pincett vårdhelt ta bort ögonen genom att sätta en fin pincett mellan ögonen och neuralrörsdefekter, i nivå med den optiska stjälk. Drag av ögonen från neuralröret. Försiktigt införa pincetten under ektoderm liggande neuralröret. Med omsorg, lossna ektodermet börjar bakifrån huvudet och kasta den.
- Utför en dubbel eller enkel ISH använder digoxigeninmärkt eller fluoresceinmärkta prober som tidigare beskrivits 18,19.
- Efter ISH överföra embryon i en ny 60 mm petriskål fylld till toppen med PBT med hjälp av en plastpipett.
- Med fin pincett försiktigt loss neuralröret från resten av embryot. I detta skede separerar den främre neuralröret från den bakre neuralröret. Försiktigt loss återstående delarna av ektoderm liggande neuralröret, notokorden som löst är fäst nedanför neuralröret, de otiska vesiklarna och resterande delar av mesoderm. Se till att neuralröret saknar eventuella bilagori detta skede.
OBS: För att undvika skador på neuralrörsdefekter utföra alla neuralrörsdefekter / embryo med en plast överföringspipett eller mikropipett vid behov med en spets skär vid dess slut. Diametern hos spetsänden justeras till storleken på det neurala röret. - Överför den dissekerade neuralröret (se anmärkning steg 1,9) i ett 1,5 ml rör fyllt med 50% glycerol utspädd i PBS. Vänta tills de neurala rören har sjunkit till botten av glycerollösning, vanligtvis O / N vid 4 ° C.
- Avlägsna lösningen av 50% glycerol / PBS med användning av en mikropipett P1000 och tillsätt i samma 1,5 ml rör av en lösning av 90% glycerol / PBS med användning av en mikropipett P1000. Vänta tills de neurala rören faller till botten av 90% glycerol / PBS-lösning, vanligen O / N vid 4 ° C.
OBS: för långtidsförvaring, använder 90% glycerol / PBS plus antibiotika för att förhindra bakterie utveckling. - Överför de neurala rören på en glasplatta, eller ett mikroskopobjektglas med en plast överföringspipett.
- Dissekten neurala rören längs dorsala och ventrala midlines använder volfram nålar. Under detta steg de neurala rören hålls i 90% glycerol / PBS.
- Montera de två sidorna av det neurala röret i 90% glycerol / PBS med användning av förstärkningsringar täckta med ett täckglas.
- Fäst täck med lack och hålla vid 4 ° C.
2. Djur Cap explants Induktion Använda anjonbytarharts Pärlor
- Överför 100 pl anjonbyte hartspärlor i ett 2 ml rör med användning av en mikropipett P1000. Tvätta pärlorna minst fem på varandra följande gånger med sterilt destillerat vatten. Låt pärlorna sedimentera på botten av röret och ersätta det sterilt destillerat vatten med användning av en mikropipett P1000. Rör inte pärlorna.
- Låt pärlorna blöt O / N i en 2 ml rör fylls med sterilt destillerat vatten med bovint serumalbumin (BSA) (10 mg / ml) vid 4 ° C.
- Två timmar innan uppsamling av ACS, platsen hälften av pärlorna till en ny 1,5 mlröret med hjälp av en mikropipett P1000. Byt ut sterilt destillerat vatten med 500 ul av mediet innehållande den molekyl som skall testas med avseende på sin induktiva potential eller känd för att inducera en specifik öde. Håll den andra hälften av pärlorna, eftersom de kommer att användas som en negativ kontroll.
- Inkubera pärlorna vid 4 ° C under minst 2 timmar.
- Utför alla efterföljande steg i stereomikroskop och utföra alla AC överföring med en mikropipett.
- Överför blastula eller mycket tidiga gastrula embryon i PBS med kalcium och magnesium kompletteras med 0,2% BSA använder en plast överföringspipett.
OBS: Embryon utvecklas i 12 ° C räckvidd blastula och gastrula stadier 20-24 timmar. - Avlägsna embryots vitellinmembranet med pincett som tidigare beskrivits 20. Fäst embryo med en pincett. Nyp vitellinmembranet med den sida av de andra pincett. Håll membranet, långsamt dra bort embryot. Utför den här proceduren på ventral (vegetabilisk) sidan av embryot. Skada inte djuret sidan av embryot.
- Isolera små ACs som tidigare beskrivits 21. Djuret polen är embryots pigmenterade del. Använda fin pincett skära ut en liten fyrkant av vävnad från djur stolpen. AC vävnaden innehåller endast ektodermala cellerna. Se till att vävnaden är av likformig tjocklek. Om inte, ta bort AC från analysen.
- Placera varje AC i en Terasaki flerbrunnsplattor i 0,5x Modifierade Barths saltlösning (MBS) 4. Placera AC i brunnen med dess pigmenterad djursidan nedåt, i kontakt med den runda botten av brunnen.
OBS: beläggningspipetter med en 0,1% BSA-lösning förhindrar vidhäftningen av små bitar av adhesiv vävnad till plasten. - Placera en pärla på varje lock med hjälp av en mikropipett P20. Vid behov använder pincett för att försiktigt placera pärlan i mitten av locket.
ANMÄRKNING: När indränkt i ett konditionerat medium, pärlorna färgade i rosa. Välj flest colored pärlor. - Inkubera vid RT (18-22 ° C) under 6 h utan att röra Terasaki flerkällsplatta. Pärlan fastnar på AC på mindre än två timmar.
- Placera Terasaki flerkällsplatta ovanpå papper indränkt i vatten. Täck plattan med en plastbehållare.
OBS: Denna "fuktkammare" hindrar tidig avdunstning av brunnarna. - Kultur ACs i 0,5x MBS eller 3/4 NAM (se steg 4.1) i fuktkammare vid 15-20 ° C tills syskon embryona har uppnått rätt scenen för att testa effekten av din faktor.
- Fäst ACs under 1 timme i nygjord 4% PFA. Dehydratisera ACs i 100% MeOH som tidigare beskrivits (steg 1,4).
3. Djur Cap Cell Dissociation och återaggregering Innan Ympning i en Xenopus laevis Neurula
- Coat petriskålar (60 mm) eller 12 brunnar plattor med 3% agaros i sterilt vatten eller i PBS utan kalcium och magnesium. Tillsätt tillräckligt agaros för att täcka bottom av petriskålen eller brunnen. Förhands värma plattorna vid RT (18-22 ° C). Eventuellt lagras plattorna under några dagar vid 4 ° C för att förhindra uttorkning.
- Förbered Kalciumfria Holtfreter s salin (60 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6)) och Holtfreter s saltlösning (60 mM NaCI, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA pH 7,6) 5. OBS: lösningen av CaCl2 kan inte autoklaveras.
- Fyll agarosen belagda väl till toppen med kalcium fritt Holtfreter s saltlösning.
- Förbered blastula eller mycket tidiga gastrula embryon att isolera deras ACs såsom tidigare beskrivits (steg 2,5 till 2,7).
- Isolera minst 15 eller upp till 30, små ACs 21. Använda fin pincett skära ut en liten fyrkant av vävnad från djur stolpen. AC vävnaden innehåller endast ektodermala celler och är därför av likformig tjocklek. Om inte, ta bort AC från analysen.
OBS: Djuret polen är embryo s pigmenterade del. - Överför ACs i en agaros belagd väl fylld till toppen med kalcium fritt Holtfreter s saltlösning. Placera ACs med sin pigmenterad sidan uppåt.
OBS! Dissociation processen startar snabbt i kalciumfritt Holtfreter s saltlösning. - Vänta några minuter för celler att börja dissociera. Observera detta genom disaggregation av vävnaderna. Med fin pincett, separera pigmenterade skiktet från resten av AC och kasta dem med en mikropipett P20. Komplett cell dissociation process indikerar separation av celler från en annan.
OBS: En eller två pigmenterade skikt kan lämnas inom åter aggregerade explantat för att hjälpa visualisering under ympning. - Centrera cellerna med användning av cirkulära rörelser hos plattan. Med hjälp av en mikropipett P1000 försiktigt bort så mycket medel som möjligt. Var noga med att inte röra cellerna.
- Tillsätt 1 ml Holtfreter s saltlösning med kalcium till brunnen. Överför de dissocierade ACSin i ett 1,5 ml rör.
OBS: 2 ml rör kan inte användas på grund av deras rund botten. - Pellets cellerna genom centrifugering, 5 min med en maximal hastighet på 2000 varv per minut under en bänk centrifug (500 xg). Ta försiktigt supernatanten med en mikropipett P1000.
- Lägg till de dissocierade cellerna 20 pl Holtfreter s saltlösning med kalcium (60 mM NaCI, 0,7 mM KCI, 0,9 mM CaCl2, 4,6 mM HEPES, 0,1% BSA (A-7888 Sigma pH 7,6) 5.
- Håll dissocierade ACS, tre till 6 timmar vid rumstemperatur (18-22 ° C).
OBS: Detta är nödvändig tid för cellerna att åter aggregat. Åter aggregering syns som cellerna bildar en liten boll på botten av röret. - Lösgör explantatet försiktigt från botten av röret genom att tillsätta 1 ml av 0,5 x MBS eller med 1 ml 3/4 NAM (se steg 4,1). Överför explantatet i en FN-belagda plattan med hjälp av en plast överföringspipett.
- Stage explantaten med sina kontroll syskon. För långsiktiga antibiotika kultur användning: kanamycin (50 | ig / ml), ampicillin (50 | ig / ml) och gentamycin (50 | ig / ml).
4. Nagel skalltak explants i Neural Tallrik X. laevis Embryo
- Förbered 3/4 NAM (110 mM NaCI, 2 mM KCI, 1 mM Ca (NO3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCOs 3, 0,2x PBS, 50 | ig / ml gentamycin). Håller inte för mer än en vecka för dissekering och förvara vid 4 ° C. Äldre NAM kan användas för framställning av agaros belagda dissektion rätter (nedan).
- Coat petriskålar (60 mm) med 3% agaros i 3/4 NAM i vilka små hål har gjorts med hjälp av antingen en silikonform eller omslaget till ett bord tennisracket.
OBS: Agarosen täcker botten av petriskålen. Lämna lite utrymme så att den petriskål att fylla med 3/4 NAM. Alternativt gör dissektion rätter med icke-uttorkande modellera. Inom leran, pressa embryon något under dissekering förfarandet. Gräva små hål iagaros med hjälp av rundade pincett Denna "dissektion maträtt" hjälper till att hålla embryon under dissekering förfarandet. - Samla dissektion verktyg: plast överföringspipetter, en "ögonbryn kniv" (gjord med ögonbryn hår inbäddade i paraffin på spetsen av en glas pasteurpipett) 22, två fina dissektion pincett, P1000 mikropipett och tips, en stereosmicroscope med förstoring 8-40X, en stark ljuskälla med optiska fiberlinjer. Håll alla dissekera verktyg rena; efter varje experiment, skölj dem två gånger med destillerat vatten, en gång med 100% etanol och låt torka. Förvaras åtskilt från damm och vid behov autoklav metall dissekera verktyg.
- Låt skiljas och åter aggregerade ACS (protokoll 3), och deras syskon X. laevis embryon utvecklas tills de når stadium 13 (neurula) enligt Nieuwkoop och Faber utvecklings tabell 17. För transplantation inom neurala plattan scenen 13 till steg 15 embryon används.
- Utföra allaefterföljande steg under stereomikroskop.
- Med hjälp av en plast överföringspipett, överföra embryon till PBS med kalcium och magnesium kompletteras med 0,2% BSA. Avlägsna embryots vitellinmembranet som tidigare beskrivits 20. Fäst embryo med en pincett. Nyp vitellinmembranet med den sida av de andra pincett. Håll membranet ordentligt, dra långsamt bort embryot.
OBS: Gör denna procedur på den ventrala (vegetabilisk) sidan av embryot. Skada inte embryona neural plattan. Om embryon har skadats under vitellinmembranet avlägsnande steg, överföra embryon till en 60 mm petriskål med 3/4 NAM med en plast överföringspipett och vänta 15 minuter, en tillräcklig tid för läkningsprocessen att inträffa. - Fyll i dissektion skålen till toppen med färska 3/4 NAM.
- Med hjälp av en plast överföringspipett, överföra embryon utan deras vitellinmembranet i dissektion skålen. Placera embryona ryggsidan upp ibrunnarna. Under överföringen inte tillåter embryot att komma i kontakt med luft-vätske-gränssnittet sedan X. laevis lyseras genom ytspänning.
- Överför AC explantatet att ympas in dissektion plattan med hjälp av en plast överföringspipett eller en mikropipett P1000. När pipetten är inne i vätskan, låt explantaten sakta sjunka ner av gravitationen, eller tryck mycket försiktigt.
- Behåll embryon med rundade pincett. Med ögonbrynet kniv göra ett snitt i neurala plattan där du tänker att ympa din explantation pjäs.
OBS: I steg 14 den främre böjningen av neurala plattan kan användas som ett landmärke, markerar den diencephalon område (fig 4). - Klipp ut en liten bit av neuroepithelium, med hjälp av rundade pincett och ett ögonbryn knive. Skär en liten bit av Explantation med ögonbrynet kniv.
OBS! Bit explant bör vara ungefär samma storlek och form som neuroepithelium avlägsnade området. Placera bit explantatet i neuroepithelium snitt med hjälp av ögonbryn kniv och fin pincett. Se till att explantatet fäster snabbt embryot. - Alternativt placera en glasbit täckglas på den ympade embryot att bibehålla transplantatet på plats. För att göra detta, skär ett fint glas täck i mycket små bitar med hjälp av grova pincett. Se till att storleken är ca 1,5 mm 2. Sänk bitarna i en petriskål med 3/4 NAM eller PBS med hjälp av pincett. Välj en glasbit större än embryot att undvika att skada den. Embryot blir lite tillplattad.
- Vänta minst 30 minuter utan att flytta, eller bara flytta dissekera plattan försiktigt. Låt embryot återhämta sig under 30 minuter till 2 timmar och försiktigt bort täck om det behövs. Försiktigt pipett de ympade embryon till en ren skål fylld med 3/4 NAM, med hjälp av plast överföringspipetten.
OBS: Ympad embryon tenderar att utveckla bakterier eller kontaminering svampar. För långsiktig culture använda antibiotika: kanamycin (50 | ig / ml), ampicillin (50 | ig / ml) och gentamycin (50 | ig / ml).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baserat på morfologiska överväganden i olika arter, embryologiska manipulationer och uttrycksmönstret av reglerande gener, har en konceptuell modell som neurala plattan är uppdelad i tvärgående och längsgående segment som definierar en utvecklings rutnät genere distinkta histogenic fält. I neurala plattan, är primordia av framhjärnan, mitthjärnan, bakhjäman och ryggmärg alla redan etablerade längs antero-posterior (AP) axel under gastrulation (ses över 23-25). Under neurulation kan histogenic fält att upptäckas som rums begränsade domäner av genuttryck. Baserat på expressionsmönster för reglerande gener, är framhjärnan primordium indelad i sex tvärgående segmenten som genererar distinkta histogenic fält kallas prosomeres (p). Varje prosomere är uppdelad i en ventral (basal) och en dorsal (alar) del (översikt i 26,27). I amfibier, den prosomere 2(p2) ger upphov till epithalamus och thalamus och dess organisatör Z ona L imitans I ntrathalamica (ZLI) 8 (ses över 28,29).
På figur 1 visas den fasta monteringen av X. laevis och X. tropic främre neurala rören vid stegen 30, 32 och 35 efter WM-DISH. WM-ISH utfördes enligt protokoll 1 med användning av sonderna för transkriptionsfaktorer fezf2 som markerar telencephalon och p3, barhl2 som markerar p2, kortikala fållar och mellanhjärnan, iroquois-1 (irx1) och iroquois-3 (irx3) som respektive märke stjärtfenan p2 och Alar p2 och morfogenen shh som markerar ZLI, den basala framhjärnan och mitthjärnan (Figur 1E). En jämförande analys av de olika genexpressionsmönster visar att den främre gränsen av barhl2 p2 uttryck anligger mot den kaudala gränsen av fezf2 expression i p3 (figur 1 A). Irx3 samuttrycks med shh i framtiden ZLI (Figur 1B). Inuti p2 irx1 expressionsdomänen är komplementär till den hos shh (Figur 1C) 8. Uttrycksmönstret för barhl2 i X. tropic på scen 35 visas i figur 1D. Ett schematiskt diagram av uttrycks territorier dessa gener i utvecklings amfibie framhjärnan tillhandahålls i figur 1E.
Använda protokoll 2 förmåga anjonbytarharts pärlor indränkt i Shh att inducera shh uttryckning undersöktes i Acs explantat. X. laevis embryon injicerades i de 4 djur blastomerer vid 4 och 8-celler skede med mRNA som kodar för den främre neuroepiteliala induceraren noggin tillsammans med barhl2, oTX2, irx3 och gfp som en injektion spårämne. Expressionen av den anti-BMP-faktor Noggin inhiberar BMP-vägen och ger en neural identitet till AC-celler 3. Vi hänvisar till AC uttrycker Noggin som Anteriorised Animal Cap (AAC). Blastocoel tak explantat framställdes såsom beskrivs i protokoll 2. AACS odlades under 48 h vid 18 ° C i kontakt med ett anjonbytarharts pärla indränkt i ett konditionerat medium (CM) innehållande, eller inte, den utsöndrade N-terminala delen av morfogenen sonic hedgehog från råtta (N-Shh). Uttrycket av endogena shh analyserades genom ISH (figur 2). Expression av Xenopus shh (Xshh) detekteras i celler i kontakt med vulsten indränkt i CM med N-Shh men inte i celler i kontakt med vulsten indränkt i CM utan N-Shh (Figur 2B).
Med hjälp av protokoll 3 förmågan hos olika celltyper att segregera från en another undersöktes. X. laevis embryon injicerades i de 4 djur blastomerer vid 4 och 8-celler skede med mRNA som kodar för noggin med eller utan otx2, barhl2 och irx3, såsom indikeras, med användning av ßGal eller GFP som spårämnen (Figur 3A). Stage 8/9 ACs dissocierades och åter aggregeras att generera explants består av blandade neuro celler som innehåller både ßGal- och GFP-uttryckande celler. De reaggregated explantaten odlades under 48 h vid 18 ° C. ßGal aktivitet avslöjades i rött enligt 30 (figur 3A). Beteendet hos celler observerades genom att följa deras lokalisering inom de åter aggregerade explantat. I explantat där AACS-celler blandas med AACS celler som uttrycker Otx2 (röd), gör ßGal-uttryckande celler inte segregerar från GFP-uttryckande celler båda typerna av celler samsas fritt (Figur 3B, 3C). Däremot iexplants där Otx2-uttryckande celler (GFP) blandas med Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) uttryckande celler (ßGal), de ßGal-uttryckande celler (röd) bildar sammanhängande fläckar och inte jämnt fördelade inom åter aggregerade explantat ( Fig 3D, 3E).
Med hjälp av protokoll nr 4, var beteendet hos programmerade AC-celler undersöktes in vivo. X. laevis embryon injicerades i 4 djur blastomerer på 4 och 8-cells steg med mRNA som kodar för noggin med otx2 antingen ensam eller tillsammans med barhl2 och irx3. ßGal användes som spårämne. Parallellt har embryon på liknande sätt injicerades med mRNA som kodar för noggin och den utsöndrade N-terminala delen av morfogenen shh från råtta (N-shh). I steg 8/9 var AC explantat dissocierades och omedelbart åter aggregeras för att skapa blandade explantat består av neuroepithelial celler antingen uttrycker N-Shh och Otx2, eller uttrycker N-Shh och Otx2, Barhl2 och Irx3 (BOI3). Små bitar av de blandade explantat transplanterades in i den neurala tallrik X. laevis embryon vid steg 14. De ympade cellerna märkta med ßGal färgning (röd). Vid steg 35 uttrycket av endogena shh analyserades genom ISH. När inympade i den främre neurala tallrik X. laevis embryon, blandade explantat bestående av BOI3 och N-Shh uttryckande celler utvecklat två funktioner som är specifika för ZLI celler: de transplanterade cellerna uttryckte Xshh och åtskilda från främre neuroepiteliala celler (Figur 3C). När däremot blandade explantat sammansatta av Otx2 - och N-Shh- uttryckande celler ympas i X. laevis neurala plattan, gjorde transplanterade cellerna inte uttrycka shh och inte segregerar från sina grannar (Figur 3B) 8.
Figur 1. Flat monterade neurala rör från X. laevis och X. tropic embryon hela montera dubbel ISH (A - D). WM-ISH utförs med hjälp av fezf2, barhl2, irx1, irx3 och shh som prober på (A - C) X. laevis embryon vid steg 30, 32, och 35 och (D) X. tropic embryo i steg 35 såsom visas. De neurala rör av representativa embryon dissekeras och platta monterad som beskrivs i protokoll 1. De dissekerade neurala rören visas från sidan, rygg upp, främre vänster. Markörerna och stadier anges. Rostralt och caudal gränser p2 är angivna med pilar. (AC) Skalan bar står för 0,5 mm. (D) Scale bar står för 0,1 mm. . (E) Schematisk bild av framhjärnan markörer vid st.30 barhl2 uttryck domän visas i streckade linjer; Områden uttryck visas för fezf2 (rosa), shh (röd), irx3 (gul) och irx1 (grön). p står för prosomere. Tallkottkörteln ligger på toppen av p2 visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Induktion av shh uttryck i programmerade explantat via kontakt med anjonbytarharts pärlor. Små ACs framställs från embryon som injicerats med mRNA som kodar för noggin, barhl2, otx2 och irx3, med GFP som spårämne. AAC står feller Anteriorised Animal Cap. AAC explantat som uttrycker Barhl2, Otx2 och Irx3 (AAC BOI3) odlas under 48 h i kontakt med en vulst indränkt i ett konditionerat medium (CM) antingen innehållande N-Shh eller inte, såsom anges. Explantaten analyseras genom ISH för uttrycket av Xenopus (X) shh. Skalstrecket står för 0,5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Analys av cell segregation beteende åter aggregerade explantat. (A) X. laevis embryon injiceras med mRNA som kodar för noggin, otx2, barhl2 och irx3 som anges. ßGal och GFP används som spårämne. I steg 8/9 små ACs framställs , Skiljas och åter aggregeras att generera explants gjorda av GFP / ßGal blandade celltyper. Explantaten odlas under 48 h vid 18 ° C och ßGal aktivitet avslöjas (röd). (B - E) Representativa explantat består av blandade celler som uttrycker proteiner som anges visas. AAC står för Anteriorised Animal Cap. (B, C) ACS celler som uttrycker Noggin och Otx2 (ßGal) sprids slumpmässigt när det blandas med akut kranskärlssjukdom celler som uttrycker Noggin (GFP). (C) Förstorad bild av (B). (D) AACS celler som uttrycker Barhl2, Otx2 och Irx3 (BOI3) (ßGal) omgrupperade och åtskilda från AACS celler som uttrycker Otx2 (GFP). (E) Förstorad bild av (D). (B, D) Skalan bar står för 0,5 mm. (C, E) Skalstrecket betecknar 0,2 mm.g "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Programmerad explantat ut sina utvecklingsfunktioner när ympas inom neurala plattan i ett steg 14 embryo (A) försöksverksamhet. AACS framställs från embryon som injicerats med mRNA som anges. I steg 8/9 celler från taket på blastocoel dissocieras och åter aggregeras att generera explants tillverkade av blandade celltyper som uttrycker ßGal (röd). Explantaten odlas tills deras syskon nådde stadiet 14. En liten bit av blandad explantation (grön rektangel) sätts i ett snitt i den främre neurala plattan. Drivna embryon odlas tills scenen 35. drivs embryon analyseras av WM-ISH hjälp av X. laevis shh (Xshh) som prob. ßGal aktivitet avslöjas i rött according till 30. (B, C) De ympade sidorna i steg 35 representativa neurala rör visas, från sidan, rygg upp, främre vänster. (B) ympat med blandade AACS uttrycker Otx2 och N-Shh. (C) ympad med blandade AACS uttrycker Barhl2, Otx2, Irx3 (BOI3) och N-Shh. Transplanterade cellerna är markerade med en röd stjärna. Den rosa stjärnan indikerar den blivande diencephalon. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neural utveckling iscensatt av ett komplext samspel mellan cellulära utvecklingsprogram och signaler från de omgivande vävnaderna (Omdömet på 3,31,32). Här beskriver vi en uppsättning protokoll som kan användas i X. laevis embryon att utforska yttre och inre faktorer som neurala öde beslutsamhet och neurala morfogenes in vitro och in vivo. Dessa protokoll kan användas som sådan på X. tropic embryon emellertid X. tropic embryon är fyra gånger mindre sedan X. laevis embryon. Både pincett och volfram nålar som används måste vara finare. När det är möjligt, använd X. laevis.
Exakt visualisering av X. laevis och X. tropic neurala histogenic fält kan åstadkommas med hjälp av den histologiska platta monteringen av dissekerade neurala rör från WM ISH. Denna teknik utfördes framgångsrikt på X. laevis embryon från steg 26 tilletapp 45 (Figur 1) och på X. tropic embryon från steg 30 till steg 45 8,33. Äldre embryon är lättare att dissekera sedan yngre embryon. Denna teknik är lätt att utföra. Det medger analys av genexpressionsmönster, separat eller i kombination, på neurala rör vid olika utvecklingsstadier. Med detta protokoll är det lätt att jämföra en sida av ett neuralt rör med den andra. Detta är mycket användbart i Xenopus GOF och LOF experiment. Defekt som observerats på den injicerade sidan av neuralröret direkt kan jämföras med normala utvecklings händelser som observerades på kontrollsidan. Denna strategi har använts för att analysera GOF och LOF fenotyper i X. laevis embryon 8,33. Ett viktigt steg i detta protokoll är korrekt fixering av de embryonala vävnaderna. En ofullständig fixering förhindrar effektivt lösgörande av ektodermet från neuralrörsdefekter. För-dissektion av neuralröret underlättar penetrationen av i situ prober. Men en gång isolerade, är det lätt att förlora neurala rören. Det är lämpligt att behålla en del av embryot under ISH förfarandet att förhindra varje förlust.
De embryon som används för alla dessa experiment måste vara robust och behöver för att läka bra. Släng alla partier av ohälsosamma embryon. För att dissekera ACs och transplantat explantat mellan scen 13 och etapp 15 är det möjligt att odla X. laevis explantat och embryon vid olika temperaturer (från 12 till 18 ° C och 18-20 ° C). Anmärkningsvärd X. laevis embryonala celler innehåller tillräckligt äggula att låta deras överlevnad i flera dagar utan tillsats av någon extern näringsämne. För att inte skada embryonala vävnader, all överföring förfarande embryo, AC, eller explantat måste göras noggrant. Det är lämpligt att använda antingen en plast överföringspipett eller mikropipett vid behov med en spets skär vid dess slut. Diametern hos spetsänden justeras till storleken av embryot, eller storleken på explantatet, som ska överföras.Det är värt att notera, beläggningspipetter med en 0,1% BSA-lösning förhindrar vidhäftningen av små bitar av vävnad till plasten.
AC explants kan programmeras genom tvångs genuttryck, eller genom exponering för yttre faktorer i en tids- och utrymmes kontrollerat sätt. Vi beskriver en teknik som tillåter lokal induktion via direktkontakt mellan en Explantation och en pärla. Vid behov pärlorna kan fragmenteras ytterligare med hjälp av pincett. Jämfört med andra tidigare beskrivna strategier, tillåter denna teknik testning av lokal induktion med rena faktorer, ensamma eller i kombination, i en exakt tid.
Med användning av en tidigare beskriven metod för cell dissociation och återassociation 34, är det möjligt att undersöka cellmotilitet kapacitet, cellseparations beteenden och bildandet av områdesgränser i inklämt och blandades AC-explantat 8. Cell dissociation processen startar på mindre än 15 minuter. Undvik shaking plattan under dissociationssteget för att förhindra förlusten av celler. AC pigmenterade skikten inte dissociera väl. Det rekommenderas att ta bort dem under dissociation steget. Ett par AC pigmenterade skikt finns kvar i åter aggregerade explantat. Det hjälper till att visualisera transplantat. Den stör inte analys vid senare utvecklingsstadier.
I detta manuskript ett protokoll att transplantera blandade explants i en neural plattan är detaljerad. I Xenopus embryon, är den neurala plattan öppet mellan scen 13 och etapp 15. Dessa steg är därför lämpligt för transplantation inom neuroepithelium. X. laevis vävnader vidhäftningsegenskaper förändras med tiden. Det är viktigt att ympa AC explants i en värd på en liknande utvecklingsstadium. Vid tidiga utvecklingsstadier, X. laevis embryon odlas i 3/4 NAM reparation extremt snabbt. Om vissa embryon har skadats under avlägsnande av vitellinmembranet kan det vara användbart att vänta 15 min,vilket är den tid som behövs för läkningsprocessen att inträffa. Infogning kan gynnas genom att sätta en bit glas täckglas på den ympade värdvävnaden, men det är inte ett krav. Den kraft som genereras av läkningsprocessen kan extrudera de ympade cellerna. Morfologi av värden embryot är bättre bevaras när transplantatet pressas in i den med yttre tryck, som med ett täckglas. För att bedöma framgången av transplantatet, kan en fluorescerande spårämne injiceras i explantaten. Närvaron av fluorescenta celler i den ympade embryot kan visualiseras tills neuralröret stängs. Den stora nackdelen i AC kultur och ympning experiment är frekvensen av bakterier eller kontaminering svampar. Använd rena eller sterila material och sterila lösningar så ofta som möjligt för att undvika kontaminering skålen vid varje steg i protokollet. För långtidsodling av ympade embryon alltid använda antibiotika och en temperatur på 15 ° C. Undvik långvarig kontakt med AC explantat eller embryon med agaros. Vi Observed att det kan minska den förväntade livslängden för Explantation. Ympningen tekniken är kraftfull, men tidskrävande. Det är inte lämpligt att screena för ödet bestämnings ledtrådar med det, men att få tillräckligt med information om din vävnad val i förväg.
Förutom de traditionella fördelar, de senaste genetiska framstegen inom Xenopus öppnade vägen för detta modellsystem för att utforska genreglerande nätverk med storskalig genomisk analys av djup RNA-sekvensering och Chromatide Immunoprecipitation-sekvensering (chip-punkter) 5,35. Det finns utmärkta RNAseq och Chip-Seq referensdatamängder som omfattar tidig embryonal utveckling. En av ChIP-punkter analys nackdelarna är behovet av att samla stor mängd material. Programmering av AC explantat medger framställning av en stor mängd av en specifik nervvävnad, och åtminstone delvis, hjälper till att övervinna denna tekniska gränsen.
De utvecklingsprogram underliggande neuralrörsdefekter organogenesis är till stor del bevarade, speciellt i vertebrater. Information som erhållits med hjälp av groddjur hjälper förståelsen av cellulära och molekylära processer som ligger bakom ryggradsdjur utveckling 25,32,36-38. Den senaste tidens framsteg inom området för inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har öppnat gateways för forskning inom regenerativ medicin och läkemedelsutveckling. iPSCs programmeras från somatiska celler med användning av en kombination av transkriptionsfaktorer. Sökandet programmering ledtrådar för stamceller pågår. Analyserna beskrivs här ger ett medelvärde för att generera neural-härledda celltyper in vitro som kan användas i läkemedelsscreening. De ger också ett billigt och snabbt sätt att testa för neurala öde bestämningsfaktorer som kan användas för ytterligare omprogrammering av iPSCs 39,40.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde | VWR | 20909.290 | Toxic |
| anion exchange resin beads | Biorad | 140- 1231 | |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A-7888 | For culture of animal cappH 7.6 |
| Gentamycine | GIBCO | 15751-045 | antibiotic |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A7906 | for bead preparation |
References
- Nieuwkoop, P. D. IIB, Pattern formation in the developing central nervous system (CNS) of the amphibians and birds (English). Proceedings of the Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen. 94, 121-127 (1991).
- Nieuwkoop, P. D. The neural induction process; its morphogenetic aspects. Int J Dev Biol. 43, 615-623 (1999).
- Harland, R. Neural induction. Curr Opin Genet Dev. 10, 357-362 (2000).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Hoppler, S., Vize, P. D. Xenopus protocols : post-genomic approaches. Hoppler, S., Vize, P. D. , Humana Press; Springer. New York. (2012).
- Franklin Hughes, W., La Velle, A. The effects of early tectal lesions on development in the retinal gonglion cell layer of chick embryos. J Comp Neurol. 163, 265-283 (1975).
- Theveneau, E., Mayor, R. Beads on the run: beads as alternative tools for chemotaxis assays. Methods Mol Biol. 769, 449-460 (2011).
- Juraver-Geslin, H. A., Gomez-Skarmeta, J. L., Durand, B. C. The conserved barH-like homeobox-2 gene barhl2 acts downstream of orthodentricle-2 and together with iroquois-3 in establishment of the caudal forebrain signaling center induced by Sonic Hedgehog. Dev Biol. 396, 107-120 (2014).
- Green, J. B., New, H. V., Smith, J. C. Responses of embryonic Xenopus cells to activin and FGF are separated by multiple dose thresholds and correspond to distinct axes of the mesoderm. Cell. 71, 731-739 (1992).
- Wallingford, J. B., Ewald, A. J., Harland, R. M., Fraser, S. E. Calcium signaling during convergent extension in Xenopus. Curr Biol. 11, 652-661 (2001).
- Kiecker, C., Niehrs, C. A morphogen gradient of Wnt/beta-catenin signalling regulates anteroposterior neural patterning in Xenopus. DEVELOPMENT. 128, 4189-4201 (2001).
- Wilson, P. A., Hemmati-Brivanlou, A. Induction of epidermis and inhibition of neural fate by Bmp-4. Nature. 376, 331-333 (1995).
- Afouda, B. A., Hoppler, S. Xenopus explants as an experimental model system for studying heart development. Trends in cardiovascular medicine. 19, 220-226 (2009).
- Afouda, B. A. Stem-cell-like embryonic explants to study cardiac development. Methods Mol Biol. 917, 515-523 (2012).
- Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2014).
- Milet, C., Maczkowiak, F., Roche, D. D., Monsoro-Burq, A. H. Pax3 and Zic1 drive induction and differentiation of multipotent, migratory, and functional neural crest in Xenopus embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 5528-5533 (2013).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods Cell Biol. 36, 685-695 (1991).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Removing the Vitelline Membrane from Xenopus laevis Embryos. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Animal Cap Isolation from Xenopus laevis. CSH protocols. , (2007).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH protocols. , (2007).
- Wilson, S. W., Houart, C. Review: Early Steps in the Development of the Forebrain. Developmental Cell. 6, 167-181 (2004).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Heasman, J. Patterning the early Xenopus embryo. Development. 133, 1205-1217 (2006).
- Rubenstein, J. L., Martinez, S., Shimamura, K., Puelles, L. The embryonic vertebrate forebrain: the prosomeric model. Science. 266, 578-580 (1994).
- Puelles, L., Rubenstein, J. L. R. Forebrain gene expression domains and the evolving prosomeric model. Trends in Neurosciences. 26, 469-476 (2003).
- Martinez-Ferre, A., Martinez, S. Molecular regionalization of the diencephalon. Frontiers In Neuroscience. 6, 73-73 (2012).
- Scholpp, S., Lumsden, A. Review: Building a bridal chamber: development of the thalamus. Trends in Neurosciences. 33, 373-380 (2010).
- Coffman, C., Harris, W., Kintner, C. Xotch, the Xenopus homolog of Drosophila notch. Science. 249, 1438-1441 (1990).
- Pera, E. M., Acosta, H., Gouignard, N., Climent, M., Arregi, I. Active signals, gradient formation and regional specificity in neural induction. Exp Cell Res. 321, 25-31 (2014).
- Stern, C. D. Neural induction: old problem, new findings, yet more questions. Development. 132, 2007-2021 (2005).
- Juraver-Geslin, H. A., Ausseil, J. J., Wassef, M., Durand, B. C. Barhl2 limits growth of the diencephalic primordium through Caspase3 inhibition of beta-catenin activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 2288-2293 (2011).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Dissociation and Reaggregation of Xenopus laevis Animal Caps. CSH protocols. , (2007).
- Harland, R. M., Grainger, R. M. Xenopus research: metamorphosed by genetics and genomics. Trends Genet. 27, 507-515 (2011).
- Beccari, L., Marco-Ferreres, R., Bovolenta, P. The logic of gene regulatory networks in early vertebrate forebrain patterning. Mech Dev. 130, 95-111 (2013).
- Pani, A. M., et al. Ancient deuterostome origins of vertebrate brain signalling centres. Nature. 483, 289-294 (2012).
- Holland, L. Z., et al. Evolution of bilaterian central nervous systems: a single origin? Evodevo. 4, 27 (2013).
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Disease models & mechanisms. 6, 1057-1065 (2013).
- Sasai, Y., Ogushi, M., Nagase, T., Ando, S. Bridging the gap from frog research to human therapy: a tale of neural differentiation in Xenopus animal caps and human pluripotent cells. Development, growth & differentiation. 50, s47-s55 (2008).
