Abstract
하이드로 겔은 생체 -like 3 차원 조직 구조를 제공하는 미세 유동 또는 미세 가공 기술을 이용하여 미세 규모로 패터닝 될 수있다. 얻어진 하이드로 겔 3D 기반 셀룰러 구조는 진보 된 생물학적 연구, 약물 학적 분석 및 장기 이식 애플리케이션 동물 실험의 대안으로 도입되었다. 하이드로 겔 계 입자와 섬유가 쉽게 제조 될 수 있지만, 조직 재건으로 조작하는 것이 곤란하다. 이 동영상에서는 셀룰러 미세 제어와 매크로 스케일 3 차원 세포 배양 시스템을 형성하기 위해 그들의 조립체와 함께, 미세 패턴 알지네이트 하이드로 겔 시트의 제조 방법을 설명한다. 200 μm의, 정밀한 미세 패턴으로 - 칼슘 겔 화제의 안개 상을 사용하여, 하이드로 겔 얇은 시트 용이 100의 범위의 두께로 생성된다. 세포를 하이드로 겔 시트 형상의 안내 배양 할 수있다독립 구조로 서있는 상태. 또한, 하이드로 겔 시트가 용이 단부 컷 팁 마이크로 피펫을 사용하여 조작 될 수 있고, 패터닝 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)을 사용하여 프레임을 적층하여 다층 구조로 조립 될 수있다. 손쉬운 프로세스를 사용하여 제조 할 수있다 이러한 모듈 형 하이드로 겔 시트, 마이크로 및 거시 및 조직 재건의 기능 연구를 포함하여 체외 약물 분석 및 생물학적 연구의 응용 가능성을 가지고있다.
Introduction
하이드로 겔은 특히 생체 재료 유망하고, 기초 생물학, 약리학 적 분석 및 의학에 중요한 것으로 예상된다. 한 하이드로 겔 기반 셀룰러 구조의 Biofabrication 동물 실험의 사용을 줄이기 위해 제안되었다, 2,3- 4, 이식 가능한 조직을 대체 및 개량 세포 기반 분석법. 5,6- 수분을 함유 한 (하이드로) 점탄성 재료 (겔)은 다수의 셀이 캡슐화되어 3D 세포 미세 환경을 제어하기 골격 구조로 유지 될 수 있도록. 미세 유동 또는 미세 가공 기술의지도와 함께, 하이드로 겔 구조의 형상을 정확하게 셀룰러 스케일에서 제어 할 수있다. 날짜, 입자를 포함하는 하이드로 젤의 모양의 다양한, 7-9 섬유, 10-12과 시트, 13-15은 상향식 (bottom-up) 아프로에 건물 단위로 사용되어왔다매크로 규모의 다세포 구조의 제조에 아파.
하이드로 겔 기반 입자와 섬유 모두 미세 유체 장치를 사용하여 유체 컨트롤, 마이크로 스케일 셀룰러 환경과 같은 애플리케이션에 쉽고 빠르게 제작되었습니다. 그러나, 설계 조직의 기본 단위로, 그것은 다시 정렬하고 매크로 규모의 구조로 자신의 볼륨을 확대. 16 미크론 크기의 기본 모듈을 생산하는 것보다 그것은 매크로 스케일 구조를 달성하기 어렵다 복잡 할 것입니다. 하이드로 겔 - 기반 구조의 시트형 유닛 간단한 조립 공정을 통해 지지체의 부피를 증가 시키는데 사용될 수있다. 간접으로, 하이드로 겔 시트의 적층은 체적의 증가뿐만 아니라, 3 차원 공간에서의 기하 확장을 제공 할뿐만 아니라.
다중 꼬임으로 그들의 조립체와 함께 15 - 우리는 이전에, 미세 패턴 (13) 하이드로 겔 시트를 제조하는 방법을보고했다겹으로 셀룰러 아키텍처. 이 기술은 다층 구조의 적층 공정을 통해 복잡한 미세 가공 및 세포 구조의 모듈 식 설계를 할 수 있습니다. 적층되는 마이크로 패턴 모듈러 하이드로 겔 시트의 제작을 통하여, 제어 된 매크로 스케일 미세 세포와 3D 세포 배양 시스템을 실현할 수있다. 이 비디오 프로토콜은 인간 간 암종 세포주 (HepG2)에 기반 모듈러 하이드로 겔 시트를 구성하는 데 사용될 수있다 간단하지만 강력한 제조 방법을 설명한다. 우리는 본원에서 이러한 간단한 패터닝 모듈 하이드로 겔 시트의 조작, 다층 구조로 그 조립을 증명한다.
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Protocol
미세 패턴 금형 및 히드로 겔 1. 준비
- PDMS 몰드 주조 표준 두 단계의 포토 리소그래피 기술에 15,17 통해 실리콘 웨이퍼의 표면에 포토 레지스트 SU-8을 사용하여 목적하는 마이크로 규모의 패턴을 생성한다. 도시 된 예에서는 간 소엽 형 메시 패턴 (도 1)를 사용한다.
- 1의 비율로 PDMS와 경화제 용액을 체중 : 5 (즉, PDMS 12.5 g과 경화제 2.5 g).
- 철저 용액 15g을 혼합, 진공 챔버 내에서 기포를 탈기하고 고르게 포일 캐스팅 접시 내에 실리콘 웨이퍼의 표면에 미세 패턴이 혼합 용액을 확산.
- PDMS를 치료하는 평평한 표면에 90 분 동안 65 ℃로 가열 판에 실리콘 웨이퍼를 놓습니다.
- 주조 요리와 실리콘 웨이퍼로부터 경화 된 PDMS를 제거합니다.
- PDMS의 가장자리를 잘라 100 mm 직경의 페트리 접시에 배치미세 패턴면을 위로.
- 차 살균을 위해 70 % 에탄올 및 증류수를 사용하여 배양 접시에 마이크로 패턴 경화 된 PDMS를 씻으십시오. 그 후, 65 ° C의 오븐에서 10 분 동안 완전히 건조한다.
- 도포 액 (/ V W) 3 %를 생성 녹이고 100 ml의 증류수에 분말 비이 온성 계면 활성제의 O / N 3g을 혼합한다.
- 플라즈마 세정기에 미세 패턴 PDMS 몰드를 놓고 1 분 (85 W, 0.73 밀리바) 수성 액체의 첨가를 용이하게하기 위해, 친수성 표면을 생성하기 위해 그 청소. 이어서, 실험실 코트 로커를 이용하여 적어도 3 시간 (오로 / N) 100 ㎖ 용 활성제 용액의 표면 PDMS.
- PDMS 금형에서 계면 활성제 용액을 씻고 10 분 동안 65 ℃의 오븐에서 완전히 건조. 그 후, 30 분 동안 자외선 (UV) 방사선을 조사함으로써 각 미세 패턴 금형 살균.
2. 하이드로 겔 전구체 세포 현탁액을 준비
- 에1 % (w / v)의 전구체를 생성 알긴산, 하이드로 겔 전구체를 준비하는 인산염 완충 식염수 (PBS) 10ml에 알긴산 나트륨 분말 0.1 g을 용해. 완전히 분말을 용해, 부화 및 / O N 그들을 섞는다.
- 1 mL의 주사기에 연결된 0.22 μm의 필터를 통해 용액을 필터.
- 배양 10 % 우 태아 혈청 및 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 70 %까지 종래의 조직 배양 접시에 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 인 HepG2 세포 - 5 % CO 2의 가습 인큐베이터 내에서 80 % 합류 37 ℃에서 .
- 한번 PBS를 사용하여 세포를 세척 한 다음 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 인큐베이터 내에서 4 분 동안 0.05 % 트립신 EDTA 1 ㎖를 첨가하여 그들을를 Trypsinize. 원심 상등액의 제거 다음 1 ㎖의 PBS를 사용하여 3 분 재현 탁하고 250 XG에서 배양 접시에서 세포를 수확.
- 자동화 된 세포를 사용하여 PBS에 분산 된 단일 세포의 수를 세계수기.
- 3 분간 PBS를 제거하고, 250 XG에서 원심 분리에 이어 1 % 1ml를 추가 (/ w를 V) 나머지 세포 펠렛에 알긴산 나트륨 용액을 피펫 팅하여 부드럽게 섞어. 10 7 세포 / ml - 세포의 최종 시딩 밀도는 5 × 106이어야한다. 37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 셀 / 하이드로 겔 현탁액을 배양한다.
3.로드 및 셀 / 히드로 겔 현탁액의 크로스 연결
- 염화칼슘 1.47 g는 가교 시약을 제조 DDH 2 O 100ml에 용해 탈수 (즉, 100 mM의 CaCl2를 · 2H 2 O의 DDH 2 O).
- 70 % 에탄올을 사용하는 초음파 트랜스 듀서와 가습기의 내부를 씻어 및 가교 시약 200 ㎖로 채 웁니다. 가습기, 110mm 폭 300mm 길이 170mm 깊이 (즉, 110mm X 300mm X 170mm (폭 x 높이 x 깊이)).
- 미세 패턴 PDMS를 배치플라즈마 클리너 금형 및 친수성 표면을 만드는 데 85 승에서 1 분을 청소합니다.
- 꾸준히 금형의 미세 패턴의 가장자리에 잘 혼합 된 세포 / 하이드로 겔 현탁액의 7.2 μl를로드합니다. 도시 된 예에서는 간 소엽 형 메시 패턴 (도 1)를 사용한다. 현탁액의 부피는 지형의 패턴에 의존한다.
- 셀 / 하이드로 겔 현탁액의 겔화를 달성하기 위해 가습기를 켜고 가습기가 가교 시약의 안개를 생성되었는지 확인합니다. 5cm의 범위 내 PDMS 몰드의 표면 지형을 덮고 5 분간 하이드로 겔 전구체에 가교 시약을 분무.
거리 이상과 미만 5cm 각각 불완전하고 불균일 한 겔화가 발생할 수 : 있습니다. 가습기는 5 분에서 가교 시약의 안개 20 ㎖를 생산하는 250 ㎖ / hr의 분사 속도를 가지고 있는지 확인하십시오. - 가교 공정에 따라, 가습기를 끄고 PDMS 모 채우기PBS로 LDS.
단일 모듈 형 하이드로 겔 시트 4. 처리
- 200 μL 피펫 팁을 사용하여 하이드로 겔 시트 주위 PBS 부드럽게 피펫 팅을 통해 미세 패턴 금형으로부터 각 경화 하이드로 겔 시트를 분리.
- 최종 절단 1,000 μL 피펫 팁 단부를 이용하여 각각의 부동 하이드로 겔 시트를 픽업. 각 간 소엽 형상 메쉬 하이드로 겔 시트는 8mm X 8.7 mm의 치수를 가지며, 100 일 - 200 μm의 두께.
- 5의 하이드로 겔은 주 이상 12 웰 플레이트에서 단위 요소로 구성하여 부유하게 생체 외에서 세포를 12 웰 플레이트에 DMEM 1 ㎖로 하이드로 겔 시트의 단일 층을 이동시켜, 문화 %의 CO 2는 37 ° C에서 인큐베이터를 가습. 매일 배지를 교환하십시오.
5. 조립 다층 히드로 겔 시트
- 반복 18mm X 18mm X 4mm의 크기로 PDMS 프레임을 생산하는 1.5 1.1 단계 (폭 x하부면에 170 μm의 높은 기둥 구조를 포함 H의 X의 D), 및. 단계 1.2에서와 동일한 비율로, PDMS와 경화제의 혼합물의 42g을 사용한다. PDMS 프레임이 X 9mm X 2mm 8mm의 크기와 내부 프레임을 생성하는 실리콘 웨이퍼에 특수 폴리 카보네이트 금형 배치 (폭 x 높이 x 깊이).
- 121 ° C에서 15 분간의 오토 클레이브에 증류수 핀셋 잠긴 PDMS 프레임 및 180 μm의 세공 나일론 여과지 살균.
- 60 mm 직경의 페트리 접시 (5cm의 직경) 나일론 여과지의 분기 상 멸균 PDMS 프레임을 배치했다.
- 최종 절단 1,000 μL 피펫 팁을 사용하여 PDMS 프레임의 내부로 모듈화 하이드로 겔 시트를 옮긴다. 어셈블리에 사용되는 하이드로 겔 시트가 제작되었다 후 적어도 하루 동안 배양한다.
- 빈 200 μL 피펫 팁을 사용하여 PDMS 프레임마다 모듈화 하이드로 겔 시트의 에지를 정렬.
- 6 층 - 반복 (4)의 적층을 형성하는 모듈 형 하이드로 겔 시트를 사용하고 5.4 5.5 단계.
- PDMS 프레임의 하단 기둥 구조를 통해 유출하여 배양 배지를 제거한다. 이어서 알지네이트 용액 2 μL 추가 (/ w 2 % V) 다층 구조체의 코너.
- 다른 사람들과의 각각의 층의 가장자리를 연결하는 다층 구조체 상에 30 초 동안 가교 결합 시약의 안개 스프레이. (250 ㎖ / hr의 속도로 분무) 가교 시약 미스트 2 ㎖을 사용한다.
- 400 μL DMEM으로 가볍게 다층 구조를 씻어 핀셋을 사용하여 PDMS 프레임을 제거합니다.
- 부드럽게 DMEM 4 ㎖를 첨가 한 후 리프터 셀 닦아 여과지에서 다층 구조를 분리.
- 전송 다층 하이드로 겔과 같은 구성의 3 mL의 DMEM 여과지, 문화 플로팅 방식으로 시험 관내에서 세포를 사용하여, 함유 6- 웰 플레이트로 구성37 ℃에서 5 % CO 2 인큐베이터에서 가습 주 이상 6 웰 플레이트에서 다중 스케일 셀룰러 지지체. 매일 배지를 교환하십시오.
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Representative Results
우리는 제조 및 세포 하이드로 겔 시트를 자립의 조작을 설명했다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 우리는 미세 패턴 PDMS 몰드를 제작하고, 세포 - 함유 하이드로 겔은 친수성이 금형의 표면 상에 로딩 된 가교 결합 된 겔 화제의 에어로졸 분무를 생성하도록 가습기를 사용. 금형에서 방출 후, 인 HepG2 세포는 다양한 패턴 (그림 2)와 하이드로 겔 시트 자립에서 배양 하였다. 따라서, 얇은 하이드로 겔 시트는 3 차원 배양 환경을 제공. 또한, 모듈 형 하이드로 겔 시트는 최종 절단 끝 마이크로 피펫을 사용하여 시트를 적층하고, 3D 매크로 스케일의 세포 배양 물 (도 3) 사용 PDMS 프레임을 이용하여 조립 될 수있다.
그림 1. 흐름 차RT 히드로 겔 시트 및 다층 히드로 겔 시트의 제조를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다양한 하이드로 겔 시트에도 2 버팀 3D 세포 배양. 마이크로 규모 알긴산 겔의 정확한 패터닝을 활성화 가교 시약을 분무 제조 방법. 또한, 제조 된 하이드로 겔 시트를 금형에서 수확 될 수 있고, 프리 스탠딩 상태에서 용이하게 조작. 인 HepG2 세포 패터닝 평면 하이드로 겔 시트 (A)에서 배양하고, 육각 기둥 (B), 메시 (C), 간 소엽 형상 메쉬 (D), 구멍의 배열 (E), 및 multipl와 하이드로 겔 시트전자 microcomb 같은 마이크로 섬유 (F). 다음과 스케일 바는 다음과 같습니다. 500 μm의 (A, D, F), 100 ㎛ (B, C) 및 2mm (E)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 어셈블리 매크로 스케일 셀룰러 구축해위한 미세 패턴 히드로 겔 시트. 하이드로 겔 시트의 다양한 형태의 녹색 형광 및 NIH3T3 세포 염색 인 HepG2 세포를 함유하는 다섯 하이드로 겔 시트 조립체를 포함하여, 정렬과 층별 적층을 통해 조립 될 수있다 빨간색 형광 (A)로 염색. 확장 파이프 라인 구조 (B)를 가진 미세 패턴 하이드로 겔 시트 조립체는 높은 세포 생존 그쪽을 구비없음 7 일 후 비 패턴 하이드로 겔 시트 (C)의. 생존율 칼 세인 AM (녹색으로 도시 생균) 및에 티듐 호모 다이머 -1 (적색으로 표시 사균)와 인 HepG2 세포를 염색하여 평가 하였다. 스케일 바 :. 500 μm의 (A)와 200 μm의 (B, C) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 모듈 식 하이드로 겔 시트를 제조하고, 3 차원 세포 지지체를 형성하도록 조립하는 간단한 방법을 제공한다.
단시간에 분명한 패턴 알긴산 구조를 구축하기 위해서는 주형으로부터 복잡한 미세 패턴을 유지할뿐만 아니라, 세포 생존 및 대사를 유지하도록 충분한 강성 구조를 만들 수 가교 프로세스를 식별한다. 우리는 안개 형태의 가습기를 이용하여 가교 시약을 분무, 졸 - 겔 전이를 포함하여, 가교 공정을 개발 하였다. 영양소 및 대사 산물의 높은 투자율을 갖는 확산 - (200 내지 100㎛),이 가교 처리하지 않고, 미세 스케일 패턴을 한정 확산 깊이와 구성 얇은 하이드로 겔의 형태로 생성 할 수 없습니다. 60 분, 18 - - 20 가교 TI 또한, 30을 요구 기존 확산 기반 방법에 비해(- 5 분 3) 나 상대적으로 짧았다.
게다가, 그것은 또한 단지 액체 매질 기계적 안정 얇은 하이드로 겔 시트를 조작하기 어려웠다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 얇은 하이드로 겔 구조가 간단하고 안정적으로 처리하고 다른 배양 조건 사이 transferal 대한 최종 절단 종래의 팁을 사용하여 조작했다. 생성 및 조작 기술을 이용하여, 우리는 조직 형 구조물을위한 지지체로서 응용 가능성으로, 약물 분석법에서 잠재적 애플리케이션을위한 플로팅 방식으로 단층 시트뿐만 아니라 적층 다층 구조까지도 제공 할 수있다.
다층 셀룰러 아키텍처는 모듈 형 단층 하이드로 겔 시트를 (도 3A)를 적층하여 생성 될 수있다. 각각의 모듈 형 하이드로 겔 시트는 세포 유형 상이한 포함 할 수 있으며, 다른 배양 조건에 노출 될 수있다. 이러한 다층 구조물은 선택적 ASSEM 될 수도출혈. 총 깊이가 제한된 확산 깊이 (그림 3C)를 초과하는 경우에는, 단순히 적층 하이드로 겔 시트 조립 구조 내에서 세포 괴사가 발생할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 다중 층 하이드로 겔 시트가 조립 될 때 이러한 간 소엽 형 메쉬 등의 마이크로 메시 패턴을 정렬 할 필요가있을 것이다. 하이드로 겔 시트의 테두리가 적층 된 하이드로 겔 시트를 정렬하도록 그러므로 우리는 동일한 내부 패턴 PDMS 프레임을 필요로한다. 따라서, 조립 메쉬 하이드로 겔 시트의 정렬 홀 어레이 미세 패턴은 향상된 세포 생존율 (도 3B)에 대한보다 효율적인 영양소 수송을 용이하게 확장 파이프 라인 구조를 형성하기 위해 사용될 수있다.
이 기술의 한 가지 제한은 알긴산 겔에서 세포 - 기질 상호 작용의 부재이다. 알긴산은 생체 -like 세포 - 매트릭스 상호 작용에 대한 세포 부착 리간드를 제공 할 수 없다 (21) 그러나, 오프 수행세포 - 세포 상호 작용 3D 세포 캡슐화 발판으로 기계 및 기하학적 효과 어. 세포 일차 세포 및 줄기, 알지네이트가 RGD 함유 펩티드, 21 또는 콜라겐 또는 젤라틴과 조합으로 다음의 변형을 사용할 수있다. (14, 18)의 또 다른 제한은, 그 셀 매립 하이드로 겔 시트가 아래 낮은 세포 밀도로 제조되면 구조의 가장자리 부가 알지네이트를 이용하여 고정되어 있기 때문에 5 × 106 세포 / ml이 다층 구조체의 구조는 하이드로 겔 시트 사이의 약한 부착을 초래할 수있다. 그러나, 층은 PDMS 프레임 하에서 배수 구조를 통해 단일 지지체로서 컴팩트하게 적층 될 수있다. 또한, 하이드로 겔 시트의 셀 밀도는 더 높은 표면뿐만 아니라,도 3a에 도시 된 바와 같이 층들 사이의 부착하는 데 유용한 하루 배양 후 층 내에서 증식 할 수있다.
하이드로 겔 시트 FABRICA여기에 기재된 기 및 조작 기술은 셀룰러 기술 및 분석법을 포함하여 인공 장기 애플리케이션 생체 -like 미세을 제공하는 시험 관내 배양 시스템과 같은 조직 세포의 모델에 적응 될 수있다. 이 기술은 세포 기반 분석법 약물 및 다른 3D 기하학적 마이크로 셀룰러 및 다양한 세포 유형 또는 하이드로 겔을 포함 macroenvironments 필요할 생물학적 연구에 적용 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
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