Abstract
Hydrogeler kan mönstrade på mikroskala med hjälp av mikroflödes eller micropatterning teknik för att ge en in vivo-liknande tredimensionell (3D) vävnad geometri. De resulterande 3D-hydrogel-baserade cellulära konstruktioner har införts som ett alternativ till djurförsök för avancerade biologiska studier, farmakologiska analyser och organtransplantationer applikationer. Fastän hydrogel-baserade partiklar och fibrer kan lätt tillverkas, är det svårt att manipulera dem för vävnadsrekonstruktion. I den här videon beskriver vi en tillverkningsmetod för micropatterned alginat hydrogel ark, tillsammans med sin församling för att bilda en makroskala 3D cellodlingssystem med en kontrollerad cellulär mikromiljö. Med användning av en dimform av kalcium gelningsmedel, är tunna hydrogelpartiklar ark enkelt genereras med en tjocklek i området av 100 till 200 ^ m, och med precisa micropatterns. Celler kan därefter odlas med den geometriska ledning av hydrogelpartiklarna arken ifristående förhållanden. Dessutom kan hydrogel arken lätt manipuleras med hjälp av en mikropipett med en ände skuren spets, och kan monteras i flerskiktsstrukturer genom att stapla dem med en mönstrad polydimetylsiloxan (PDMS) ram. Dessa modulära hydrogel ark, som kan tillverkas med hjälp av en enkel process, har potentiella tillämpningar av in vitro läkemedelsanalyser och biologiska studier, inklusive funktionella studier av mikro- och makro och vävnadsrekonstruktion.
Introduction
Hydrogeler är särskilt lovande biomaterial, och förväntas vara viktiga i grundläggande biologi, farmakologiska analyser och medicin. 1 Biofabrication av hydrogel-baserade cellulära konstruktioner har föreslagits för att minska användningen av djurförsök, 2,3 ersätta transplanterbara vävnader, 4 och förbättra cellbaserade analyser. 5,6 Vatteninnehållande (kolväten) viskoelastiska material (geler) tillåta ett stort antal celler som skall inkapslas och hölls i en byggnadsställning struktur för att styra 3D cellulära mikromiljön. I kombination med ledning av mikroflödes eller micropatterning teknik, kan geometrin av hydrogel konstruktioner styras exakt på cellulär nivå. Hittills har en mängd olika former av hydrogeler, inbegripet partiklar, 7 - 9 fibrer, 10 - 12 och ark, 13 - 15 har använts som byggnadsenheter i nedifrån och upp lämpvärk till tillverkning av makroskale flercelliga arkitekturer.
Båda hydrogel-partiklar och fibrer har varit lätt och snabbt framställt för applikationer som mikroskala cellulära miljöer, med fluid kontroller med hjälp av mikroflödessystem enheter. Eftersom de grundläggande enheterna i tekniska vävnader, skulle det vara komplicerat att ordna dem och för att förstora sin volym som makro skala konstruktioner. 16 Det är svårare att uppnå makro skalas konstruktioner än att producera mikronstorlek basmoduler. Arkliknande enheter av hydrogel-baserade konstruktioner kan användas för att öka volymen av byggnadsställningar via en enkel monteringsprocess. Följdriktigt, staplade lager av hydrogel ark ger inte bara en volymökning men också en geometrisk förlängning i en 3D-rymd.
Vi har tidigare rapporterat en metod för tillverkning av micropatterned hydrogel blad, 13-15 tillsammans med sin församling i multi-layställda cellulära arkitekturer. Tekniken möjliggör komplexa micropatterning och modulär design av cellulära konstruktioner via en stapling processen med flerskiktsstrukturer. Genom tillverkning av staplade modul hydrogel ark, som Micropatterned, kan en 3D cellodlingssystem med en kontrollerad makroskala cellulära mikro realiseras. Denna video protokoll beskriver ett enkelt men kraftfullt tillverkningsmetod som kan användas för att konstruera modulära hydrogel ark, baserat på den mänskliga levercancer cellinje (HepG2). Vi visar här enkel manipulering av dessa mönstrade modulära hydrogel blad och deras montering i en flerskiktsstruktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Micropatterned Formar och Hydrogeler
- Ge de önskade mikroskalmönster med användning av SU-8 fotoresist på ytan av en kiselskiva via en vanlig två-steg fotolitografisk teknik 15,17 för gjutning PDMS formar. Det visade exemplet använder en lever lob-liknande nätmönster (Figur 1).
- Väg upp PDMS och en härdarlösning med ett förhållande av 1: 5 (dvs 12,5 g PDMS och 2,5 g av härdare).
- Blanda 15 g av lösningen noggrant, degas bubblorna i en vakuumkammare, och sedan sprida den blandade lösningen på en micropatterned yta hos kiselskivan jämnt inom en folie gjutskål.
- Placera kiselskivan på en 65 ° C uppvärmd platta under 90 min på en plan yta för att bota PDMS.
- Ta bort de härdade PDMS från gjutskål och kiselskiva.
- Skär kanterna av PDMS och placera den på en 100-mm diameter petriskål medden micropatterned sidan upp.
- Tvätta Micropatterned härdade PDMS på petriskålen med användning 70% etanol och destillerat vatten för primär sterilisering. Sedan, torka dem fullständigt under 10 minuter i en ugn vid 65 ° C.
- Lös upp och blanda O / N 3 g av en pulverformig nonjoniskt ytaktivt medel i 100 ml destillerat vatten, vilket skapar en 3% (vikt / volym) beläggningslösning.
- Placera micropatterned PDMS formarna i en plasma renare och rengöra dem under 1 minut (85 W, 0,73 mbar) för att skapa en hydrofil yta, för att underlätta tillsatsen av vattenhaltiga vätskor. Därefter belägga ytan av PDMS med 100 ml ytaktiv lösning under minst 3 h (ORO / N) med användning av en laboratorie rocker.
- Tvätta den ytaktiva lösningen från PDMS formarna och torka dem fullständigt i en ugn vid 65 ° C under 10 minuter. Sedan, sterilisera varje micropatterned mögel genom exponering för ultraviolett (UV) strålning över 30 minuter.
2. Förbered cellsuspensionen i en hydrogel prekursor
- Tillförbereda hydrogel prekursor, lös upp 0,1 g natriumalginat pulver i 10 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), vilket skapar en 1% (vikt / volym) alginat prekursor. För att lösa upp pulvret helt inkubera och blanda dem O / N.
- Filtrera lösningen genom ett 0,22 pm filter ansluten till en 1 ml spruta.
- Odla HepG2-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin-streptomycin i en konventionell vävnadsodlingsplatta tills 70% - 80% sammanflytning i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C .
- Tvätta cellerna en gång med användning av PBS och sedan trypsinize dem genom att tillsätta 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA under 4 min i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C. Centrifugera cellerna skördats från odlingsskålen vid 250 xg under 3 min och återsuspendera med användning 1 ml PBS följande avlägsnande av supernatanten.
- Räkna antalet enskilda fördelade celler i PBS genom att använda en automatiserad celldisk.
- Efter centrifugering vid 250 x g under 3 min och PBS-avlägsnande, tillsätt 1 ml av 1% (vikt / volym) natriumalginat lösning på den återstående cellpelleten och blanda dem försiktigt med pipettering. Den slutliga såddtäthet av cellerna bör vara 5 x 10 6 - 10 7 celler / ml. Inkubera cell / hydrogel suspension i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
3. Lastning och Tvärbindning av Cell / hydrogel Suspension
- Lös 1,47 g kalciumklorid dehydratisera i 100 ml DDH 2 O för att framställa ett tvärbindningsreagens (det vill säga, 100 mM CaCl2 • 2 H2O i DDH 2 O).
- Skölj ur insidan av en luftfuktare med ultraljudsomvandlare med hjälp av 70% etanol och fyll den med 200 ml tvärbindningsreagenset. Fuktaren är 110 mm bred, 300 mm lång och 170 mm djup (dvs 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x D)).
- Placera micropatterned PDMSformar i en plasma renare och rengöra dem för en min vid 85 W för att skapa en hydrofil yta.
- Stadigt ladda 7,2 | il av det välblandade cell / hydrogel-suspension vid kanten av micropattern i formen. Det visade exemplet använder en lever lob-liknande nätmönster (Figur 1). Volymen av suspensionen beror på den topografiska mönstret.
- För att uppnå gelning av cellen / hydrogelen suspension, slå på befuktaren och kontrollera att luftfuktaren alstrar en dimma av det tvärbindande reagens. Spraya tvärbindningsreagenset på hydrogelen prekursor för 5 minuter, som täcker den topografiska ytan av PDMS formarna inom ett område av 5 cm.
Obs: Avstånd längre och kortare än 5 cm kan orsaka ofullständig och ojämn gelning, respektive. Säkerställ att luftfuktaren har en spruthastighet av 250 ml / h, vilket ger 20 ml dimma av det tvärbindande reagens i 5 min. - Efter tvärbindningen process, stänga av luftfuktare och fylla PDMS moLDS med PBS.
4. Hantering av Single Modular hydrogel Sheets
- Lossa varje härdad hydrogelarket från micropatterned formarna via pipettering PBS försiktigt runt hydrogelarket med hjälp av en 200 mikroliter pipettspets.
- Plocka upp varje flytande hydrogel ark med hjälp av en end-cut 1000 mikroliter pipettspets slut. Varje lever lobule liknande nät hydrogelarket har dimensionerna 8 mm x 8,7 mm, och vara 100-200 um tjock.
- Överför ett enda skikt av hydrogelarket i 1 ml DMEM i en 12-brunnars platta, och odla cellerna in vitro i ett flytande sätt med användning hydrogelen konstruera som en enhetskomponent i 12-brunnar över en vecka i en 5 % CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C. Byt odlingsmediet varannan dag.
5. Montering av flerskiktade Hydrogel Sheets
- Upprepa steg 1,1 till 1,5 för att framställa en PDMS ram med dimensionerna 18 mm x 18 mm x 4 mm (B xH x D), och som innehåller strukturer 170-um-hög pelare på den nedre ytan. Använd 42 g av blandningen av PDMS och härdare, med samma förhållande som i steg 1.2. Placera en specialiserad polykarbonat mögel på kiselskivan för PDMS ramen för att skapa en inre ram med dimensionerna 8 mm x 9 mm x 2 mm (B x H x D).
- Sterilisera PDMS ramen och 180 | im porer nylonfilterpapper nedsänkt i destillerat vatten och pincett i en autoklav under 15 minuter vid 121 ° C.
- Placera den steriliserade PDMS ramen på kvart av en bit av nylon-filterpapper (med en diameter av 5 cm) i en 60-mm petridiameter skål.
- Överför en modulär hydrogelarket in i det inre av PDMS ramen med användning av en ände-cut 1000 mikroliter pipettspets. De hydrogel blad som används för montering bör odlas under minst en dag efter det att de tillverkades.
- Rikta in kanten på varje modul hydrogelarket med PDMS ram med användning av en tom 200 mikroliter pipettspets.
- Upprepa steg 5,4 och 5,5 med användning av modulära hydrogelpartiklar ark för att bilda en stapel av 4 - 6 lager.
- Avlägsna odlingsmediet genom att flöda ut genom de strukturer pelaren vid botten av PDMS ramen. Sedan till 2 | il av alginatlösning (2% vikt / volym) vid ett hörn av den flerskiktiga konstruktionen.
- Spraya en dimma av den tvärbindningsreagens för 30 sek på flerskiktskonstruktion för att fästa kanterna på varje skikt med de hos ett annat. Använd 2 ml dimma av tvärbindningsreagens (vid en spruthastighet av 250 ml / h).
- Skölj flerskiktskonstruktion försiktigt med 400 pl DMEM och avlägsna PDMS ramen med pincett.
- Frigör flerskiktiga konstruktionen från filterpapperet genom att försiktigt torka med en cell lyftare efter tillsats av 4 ml DMEM.
- Överför flera lager konstruktet till en 6-brunnars platta innehållande 3 ml DMEM med användning av filterpapper, och odla cellerna in vitro i ett flytande sätt, med hydrogelen-konstruktion enligten multi-skala cellulär byggnadsställning i 6-brunnar över en vecka i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C. Byt odlingsmediet varannan dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har beskrivit tillverkning och manipulation av fristående cellulära hydrogel ark. Såsom visas i fig 1, fabricerade vi micropatterned PDMS formar, och cellinnehållande hydrogelen laddades på den hydrofila ytan av dessa formar och tvärbunden med användning av en luftfuktare för att generera en aerosoliserad dimma av gelningsmedel. Efter utsläpp från formarna, HepG2-celler odlades i fristående hydrogel ark med olika mönster (Figur 2). Således, de tunna hydrogel lakan tillhandahålls en 3D odlingsmiljö. Vidare kan modul hydrogelpartiklar ark monteras genom skiktning arken med användning av en mikropipett med en ände skuren spets, och med användning av en PDMS ram, vilket möjliggör 3D makroskala cellkultur (figur 3).
Figur 1. Flödes Chart Visar Tillverkningen av en hydrogelarket och Multi-lager Hydrogel Sheets. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fristående 3D Cell Culture i olika Hydrogel Sheets. Tillverkningsmetoden för sprutning tvärbindningsreagenset aktiverat exakt mönstring av alginat hydrogel på mikroskala. Dessutom kunde tillverkade hydrogel arken skördas från formen och manipuleras lätt i fristående förhållanden. HepG2-celler mönstrades och odlades i en platt hydrogelarket (A), hydrogelpartiklar ark med sexkantiga pelare (B), mask (C), lever lob-liknande nät (D), en grupp av hål (E), och Multiple microcomb liknande mikrofibrer (F). Skal barer är följande:. 500 m (A, D, F), 100 m (B, C), och 2 mm (E) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Montering av Micropatterned hydrogel Bladen för makro skala Cellular konstruktioner. Olika typer av hydrogelarket kan monteras via skikt-för-skikt stapling med inriktning, bland annat montering av fem hydrogel ark innehållande HepG2-celler färgades med grön fluorescens och NIH3T3-celler färgades med röd fluorescens (A). En sammansättning av micropatterned hydrogel ark med utökad pipeline (B) gav högre cellviabiliteten than som icke-mönstrade hydrogel ark (C) efter 7 dagar. Viabiliteten bedömdes genom färgning HepG2-celler med kalcein-AM (levande celler visas som grön) och etidium homodimer-1 (döda celler visas som röd). Skala barer:. 500 pm (A) och 200 m (B, C) Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll ger en enkel metod för tillverkning av modul hydrogel ark, och sammanföra dem att bilda 3D cellulära ställningar.
För att konstruera tydliga mönstrade alginat strukturer på kort tid, bör vi identifierar en tvärbindningsprocess som kan skapa tillräckligt rigida strukturer för att bibehålla de komplexa micropatterns från formen, samt upprätthålla cellviabiliteten och metabolism. Vi har utvecklat en tvärbindningsprocess, innefattande ett sol-gel-övergång, för att spruta ett tvärbindningsreagens under användning av en luftfuktare i form av en dimma. Utan denna tvärbindningsprocess kan de mikroskalmönster inte genereras i form av en tunn hydrogel konstrukt med den begränsade diffusiv djup (100 - 200 ^ m), som har hög diffusiv permeabilitet för metaboliter och näringsämnen. Vidare jämfört med existerande diffusions-baserade metoder, som kräver 30 - 60 minuter, 18 - 20 tvärbindnings timig var relativt kort (3-5 minuter).
Dessutom var det också svårt att manipulera de tunna hydrogelpartiklar ark, som var mekaniskt stabil endast i ett flytande medium. Såsom visas i fig 1, har den tunna hydrogelstrukturen enkelt och stabilt hanteras och manipuleras med användning av en ände-cut konventionell topp för överförande mellan olika odlingsbetingelser. Använda generation och manipulationstekniker, kan vi erbjuda inte bara ett enda skiktsark i ett flytande sätt för potentiella tillämpningar inom läkemedelsanalyser, men även staplade strukturer i flera lager, med potentiella tillämpningar som ställningar för vävnadsliknande konstruktioner.
Flerskiktiga cellulära arkitekturer kan genereras genom att stapla de modulära enkla lager hydrogel ark (figur 3A). Varje modul hydrogelarket kan innehålla olika celltyper, och kan utsättas för olika odlingsbetingelser. Dessa flerskikts konstruktioner kan sedan selektivt Assemblödde. Dock kan bara stapla hydrogel ark leda till cellnekros inuti den monterade konstruktionen när det totala djupet överskrider den begränsade diffusiv djup (figur 3C). För att lösa detta problem, skulle det vara nödvändigt att anpassa Micro mönster, såsom lever lobule liknande maskor, när flerskikts hydrogel ark monteras. Vi kräver därför en PDMS ram med samma inre mönster som gränsen till hydrogelarket att anpassa staplade hydrogel arken. Sålunda skulle inriktade hål-array micropatterns i det monterade mask hydrogelpartiklar ark användas för att bilda expanderade rörledningskonstruktioner, vilket underlättar mer effektiv transport av näringsämnen för förbättrad cellviabilitet (figur 3B).
En begränsning med denna teknik är avsaknaden av cell-matris interaktioner i alginat hydrogelen. Alginat kan inte ge cellvidhäftningsligander för in vivo-liknande cell-matrix interaktioner, 21 men gör det aver mekaniska och geometriska effekter som en 3D-cell-inkapslande byggnadsställning med cell-cell-interaktioner. För primära celler och stamceller kunde alginat användas efter modifiering med RGD-innehållande peptider, 21 eller i kombination med kollagen eller gelatin. 14,18 En annan begränsning är att när de cell inbäddade hydrogelpartiklar ark tillverkas med låg celldensitet nedan 5 x 10 6 celler / ml, byggande av flerskiktsstruktur kan orsaka svaga fästen mellan hydrogel blad eftersom endast kanten av strukturen fixeras med hjälp av ytterligare alginat. Emellertid kan skikten staplas kompakt som en enda byggnadsställning genom dränering strukturen under PDMS ramen. Dessutom skulle högre densitet av celler i hydrogelen arken proliferera på ytan såväl som inuti skiktet efter en dag kultur, vilket skulle hjälpa bilagor mellan skikten, såsom visas i fig 3A.
Hydrogelarket fabricaning och manipulation teknik som beskrivs här kan anpassas till de in vitro odlingssystem och vävnadsliknande cellulära modeller för att ge en in vivo-liknande mikro för applikationer, inklusive cellulära analyser och ingenjörskonstgjorda organ. Denna teknik kan tillämpas på cellbaserade droganalyser och biologiska studier som kräver geometriskt olika 3D cellulär mikro- och macroenvironments som innehåller olika celler eller hydrogel typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
- Hoffman, A. S. Hydrogels for biomedical applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).
- Lan, S., Starly, B. Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities. Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
- Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays. Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).
- Xu, Y., et al. A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions. Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).
- Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel. Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).
- Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks. Biomicrofluidics. 5 (3), 034117 (2011).
- Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules. Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).
- Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).
- Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures. 12 (1), 14-18 (2011).
- Lee, W., et al. Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction. Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).
- Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters. Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).
- Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip. Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).
- Choi, S., Park, J. K. Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels. Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).
- Lee, B. R., et al. In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids. Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).
- Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. A microfluidic biomaterial. J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).
- Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. Microfluidic scaffolds for tissue engineering. Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
