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Biology

विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र और enChIP द्वारा एसोसिएटेड अणु की पहचान का अलगाव

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53478
Automatic Translation
1, 1
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

Introduction

हित के विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों के साथ जुड़े अणुओं की पहचान ऐसे प्रतिलेखन और epigenetic विनियमन के रूप में जीनोमिक कार्यों के विनियमन के तंत्र को समझने के लिए आवश्यक है। कई तकनीकों विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों 1-7 के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए विकसित किया गया है, क्योंकि वे ऐसी सीमित आवेदन (जैसे, केवल दोहराता के साथ उच्च प्रतिलिपि संख्या लोकी या लोकी के लिए) और के रूप में उनके आंतरिक समस्याओं के इस स्तर पर व्यापक रूप से इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं बहुत अधिक समय और प्रयास की आवश्यकता है।

आसानी से विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों की जैव रासायनिक विश्लेषण प्रदर्शन करने के क्रम में, हम 14-17 दो ठिकाना विशिष्ट chromatin immunoprecipitation (चिप) प्रौद्योगिकी, अर्थात् इन्सर्शनल चिप (iChIP) 8-13 और इंजीनियर डीएनए बाध्यकारी अणु की मध्यस्थता चिप (enChIP) विकसित किया है । IChIP में, ब्याज की एक ठिकाना ऐसे लेक्स के रूप में एक exogenous डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की डालने मान्यता दृश्यों द्वारा चिह्नित किया जाता हैए ठिकाना तो टैग किया डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन का उपयोग आत्मीयता शुद्धि से अलग है। EnChIP में, इस तरह जस्ता उंगली प्रोटीन, प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह (ताल) प्रोटीन के रूप में डीएनए बाध्यकारी अणुओं, इंजीनियर, और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) परिसरों, चित्रा (1) ब्याज की एक ठिकाना टैग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। बाद में, जीनोमिक क्षेत्र गईं डीएनए बाध्यकारी अणुओं की आत्मीयता शुद्धि से अलग है।

IChIP खत्म enChIP के लाभ में से एक एक exogenous डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की मान्यता दृश्यों की प्रविष्टि के लिए आवश्यक नहीं है कि है। Cas9 (dCas9) के एक catalytically निष्क्रिय रूप से मिलकर CRISPR परिसरों और एक गाइड आरएनए (gRNA) का उपयोग लोकी को निशाना ताल और जस्ता उंगली प्रोटीन का उपयोग iChIP या enChIP द्वारा इन क्षेत्रों के लक्षित कर की तुलना में ज्यादा आसान है। यहाँ, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आरएनए अनुक्रमण के साथ संयुक्त enChIP के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन (आरएनए seq) ठिकाना संघों की पहचान करने के लिएटेड प्रोटीन और आरएनए, क्रमशः।

Protocol

लक्ष्य लोकस को स्वीकार इंजीनियर डीएनए बाध्यकारी अणु की 1. डिजाइन

  1. CRISPR परिसरों का उपयोग कर enChIP के लिए, पहले 18 के रूप में वर्णित ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र में उम्मीदवार gRNA लक्ष्य दृश्यों की पहचान करने के लिए CRISPRdirect वेब उपकरण (http://crispr.dbcls.jp) का उपयोग करें। इस वेब उपकरण फार्म की 23 बीपी जीनोमिक साइटों रिटर्न 5'-एन 20 NGG -3 'लक्ष्य क्षेत्र के भीतर।
  2. U6 प्रमोटर अनुक्रम और में 5'-एन 20 के अनुक्रम व्यावसायिक सेवाओं का उपयोग 5'-एन 20 NGG -3 'सहित एक gBlock synthesize 19,20 (चित्र 2 देखें)। प्रयोजनों subcloning के लिए, gBlock के बाहर उचित प्रतिबंध एंजाइम साइटों में शामिल हैं।
  3. पहले 16 में वर्णित के रूप में एक उचित वेक्टर में gBlock डालें। GBlocks के लिए कई रेट्रोवायरल वैक्टर (सामग्री देखें) उपलब्ध हैं।
  4. ताल प्रोटीन का उपयोग enChIP के लिए, Targ पहचानने ताल प्रोटीन डिजाइनएट लोकी। व्यावसायिक सेवाओं का उपयोग ताल प्रोटीन एन्कोडिंग plasmids उत्पन्न करता है। पहले 15 में वर्णित के रूप में इस तरह के 3 × ध्वज के रूप में एक या एक से अधिक टैग के साथ जुड़े हुए ताल प्रोटीन युक्त अभिव्यक्ति वैक्टर उत्पन्न करता है।

EnChIP विश्लेषण के लिए कोशिकाओं की 2. स्थापना

  1. 3 × झंडा dCas9 और gRNA (CRISPR आधारित प्रक्रिया) या एक्सप्रेस 3 पहले 14-17 के रूप में वर्णित × झंडा-ताल कोशिकाओं में (ताल प्रोटीन आधारित प्रक्रिया) विश्लेषण किया जाना है।
    1. अभिकर्मक क्षमता अधिक है, तो क्षणिक अभिकर्मक का प्रयोग करें। 3 × झंडा dCas9 और सीएमवी प्रमोटर युक्त एक अभिव्यक्ति वेक्टर (सामग्री देखें) उपलब्ध है।
    2. क्षणिक अभिकर्मक क्षमता कम है, तो पारंपरिक तरीकों का उपयोग कर स्थिर transformants की स्थापना पर विचार करें। GBlock के लिए ऊपर उल्लिखित रेट्रोवायरल वैक्टर के अलावा, 3 × झंडा dCas9 की रेट्रोवायरल वैक्टर (सामग्री देखें) उपलब्ध हैं।
    2. 14-17 वर्णित के रूप में एक विरोधी झंडा एंटीबॉडी (अब) का उपयोग कर immunoblot विश्लेषण द्वारा कोशिकाओं में 3xFLAG-dCas9 या 3xFLAG-ताल प्रोटीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें।
    नोट: ये टैग प्रोटीन की अभिव्यक्ति भी विरोधी झंडा FITC और बाद में एक FACS विश्लेषण के साथ intracellular धुंधला द्वारा की पुष्टि की जा सकती है। इंट्रासेल्युलर धुंधला के लिए एक प्रोटोकॉल हमारे मुखपृष्ठ (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html) से डाउनलोड किया जा सकता है।
  2. मानक आरटी पीसीआर तकनीक द्वारा gRNA की अभिव्यक्ति की पुष्टि करें।
  3. ब्याज की जीनोमिक क्षेत्र के साथ बातचीत प्रोटीन की मात्रात्मक पहचान के लिए, सेल संस्कृति (SILAC) enChIP (enChIP-SILAC) के साथ संयुक्त विश्लेषण में अमीनो एसिड से एक स्थिर आइसोटोप लेबलिंग के उपयोग पर विचार करें।
    नोट: SILAC विश्लेषण के लिए मीडिया वाणिज्यिक विक्रेताओं से खरीदा जा सकता है। SILAC विशिष्ट बातचीत का पता लगाने में शक्तिशाली है।
    1. SILAC भारी माध्यम में संस्कृति कोशिकाओं। कोशिकाओं cultu तैयारएक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में SILAC प्रकाश माध्यम में लाल। (भारी या प्रकाश) प्रत्येक SILAC माध्यम के लिए कम से कम 5 × 10 7 कोशिकाओं का प्रयोग करें। कुशल लेबलिंग के लिए, दोनों एल Lysine-2HCl, 13 सी 6 और एल Arginine एचसीएल, SILAC भारी मीडिया में 13 सी 6, 15 एन 4 जोड़ें। नोट: कम से कम पाँच कोशिका विभाजन लेबल प्रोटीन के लिए जरूरी हैं।
      1. उदाहरण के लिए, स्थिरतापूर्वक लाइसिन 2HCl प्लस एल Arginine एचसीएल (लाइट मध्यम) के साथ SILAC के लिए DMEM मीडिया और dialyzed भ्रूण गोजातीय सीरम में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में 3xFLAG-dCas9 और एक gRNA व्यक्त संस्कृति मानव fibrosarcoma HT1080 कोशिकाओं या 13 सी 6 एल Lysine-2HCl प्लस 13 सी 6 से 15 एन 4 एल Arginine एचसीएल (भारी मध्यम) 16 (सामग्री देखें)। मध्यम की 500 मिलीलीटर में प्रकाश या भारी एल Lysine-2HCl और एल Arginine एचसीएल के 50 मिलीग्राम जोड़ें।
      2. कोशिकाओं घातीय growt बनाए रखने के लिए इतना है कि Trypsinize और replate कोशिकाओं वे मिला हुआ बनने से पहलेज।

संक्रामक के साथ कोशिकाओं के 3. Crosslinking

  1. निलंबन संस्कृति में कोशिकाओं, स्थानांतरण 2 × 10 7 3xFLAG-ताल प्रोटीन या 3xFLAG-dCas9 प्लस gRNA व्यक्त कोशिकाओं और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में नियमित रूप से संस्कृति के माध्यम से 30 मिलीलीटर में निलंबित लिए। अधिक कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं, आनुपातिक अभिकर्मकों की मात्रा और मात्रा में वृद्धि हुई है। SILAC प्रयोगों के लिए, भारी मध्यम या हल्के से मध्यम (5 10 x 7 कोशिकाओं प्रत्येक) में संवर्धित कोशिकाओं का मिश्रण है और 2 10 x 7 कोशिकाओं से युक्त 5 ट्यूबों में 1 एक्स 10 8 कोशिकाओं की कुल विभाजित।
  2. सेल निलंबन (अंतिम एकाग्रता 1%) के 30 मिलीलीटर के लिए 37% formaldehyde के 810 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, सीधे संस्कृति के माध्यम से 30 मिलीलीटर के लिए 37% formaldehyde के 810 μl जोड़कर संस्कृति बर्तन में कोशिकाओं को ठीक।
  3. 1.25 एम ग्लाइसिन समाधान (अंतिम एकाग्रता 127 मिमी) के 3.1 मिलीलीटर जोड़कर तिर्यक बंद करो, और10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  4. Centrifugation (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × छ) से कोशिकाओं को इकट्ठा। ध्यान से सतह पर तैरनेवाला सहित फॉर्मेल्डीहाइड त्यागने और एक उचित अपशिष्ट बोतल में स्टोर।
    1. पक्षपाती कोशिकाओं के लिए, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक सेल खुरचनी और फसल के साथ कोशिकाओं को अलग, और इस चरण में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को इकट्ठा।
    2. SILAC प्रयोगों के लिए, भारी मध्यम या हल्के से मध्यम (5 10 x 7 सेल प्रत्येक) में सभ्य अलग कोशिकाओं मिश्रण 2 10 x 7 कोशिकाओं से युक्त 5 ट्यूबों में 1 एक्स 10 8 कोशिकाओं की कुल विभाजित है, और इस में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को इकट्ठा कदम है।
  5. ट्यूब प्रति दो बार पीबीएस के 30 मिलीलीटर के साथ सेल गोली धो लें। ध्यान formaldehyde सहित सतह पर तैरनेवाला त्यागें और रासायनिक सुरक्षा के दिशा निर्देशों के अनुसार फॉर्मेल्डीहाइड अपशिष्ट bottle.Handle एक उचित अपशिष्ट में यह दुकान। तय कोशिकाओं जमे हुए हैं और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

Chromatin की 4. तैयारी (2 एक्स 10 प्रति7 कोशिकाओं)

  1. सेल बफर के 10 मिलीलीटर (10 मिमी Tris (पीएच 8.0), 1 मिमी EDTA, 0.5% IGEPAL सीए -630, और 1 × प्रोटीज अवरोधकों) में तय की कोशिकाओं को निरस्त करने और 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  2. नमूना अपकेंद्रित्र (8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 830 × छ) और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. परमाणु lysis बफर के 10 मिलीलीटर में गोली निलंबित (10 मिमी Tris (पीएच 8.0), 1 मिमी EDTA, 0.5 एम NaCl, 1% ट्राइटन X-100, 0.5% सोडियम deoxycholate, 0.5% lauroylsarcosine, और 1x प्रोटीज अवरोधकों)। 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं और हर 2-3 मिनट भंवर।
  4. (830 × नमूना अपकेंद्रित्र 8 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ग्राम) और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  5. पीबीएस के 10 मिलीलीटर में गोली धो लें। गोली (क्रोमेटिन अंश) तरल नाइट्रोजन में तत्काल ठंड के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

Chromatin की 5. sonication (2 एक्स 10 7 कोशिकाओं के अनुसार)

  1. के 800 μl में क्रोमेटिन अंश निलंबितसंशोधित lysis बफर 3 (10 मिमी Tris (पीएच 8.0), 1 मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl, 0.1% सोडियम deoxycholate, 0.1% एसडीएस, और 1x प्रोटीज अवरोधकों) और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण।
  2. उत्पादन: (सामग्री देखें) एक sonicator का उपयोग क्रोमेटिन और निम्न स्थितियों Sonicate 3; कर्तव्य: 100% (निरंतर); और समय: मुक्त। 10 सेकंड के लिए sonication के 10-18 चक्र प्रदर्शन और 20 सेकंड के लिए बर्फ पर ठंडा। , अत्यधिक ताप से बचने 2 मिनट हर 5-6 चक्र के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं। झाग से बचने के लिए, 0.5 सेमी ट्यूब के नीचे से ऊपर sonication जांच की नोक की स्थिति में रहते हैं।
  3. अपकेंद्रित्र पर नमूना (10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 × छ) और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। sonicated क्रोमेटिन तरल नाइट्रोजन में तत्काल ठंड के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।

Chromatin विखंडन के 6. मूल्यांकन

  1. आसुत जल का 85 μl के साथ खंडित क्रोमेटिन के 10 μl मिलाएं।
  2. 4 μl जोड़ेंऔर 5 एम NaCl के 65 डिग्री सीओ / एन पर सेते हैं।
  3. 10 मिलीग्राम / एमएल RNase एक की 1 μl जोड़ें और 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. 0.5 एम EDTA (8.0 पीएच), 1 एम Tris (पीएच 6.8) के 4 μl, और 20 मिलीग्राम की 1 μl / एमएल Proteinase कश्मीर के 2 μl जोड़ें, और फिर 1.5 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. ऐसे SYBR ग्रीन के रूप में धुंधला हो जाना रंगों को शामिल नहीं करता है कि एक 1% agarose जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा नमूना के लिए अलग-अलग 10 μl।
  6. खंडित क्रोमेटिन की लंबाई के वितरण का मूल्यांकन करने के लिए जेल दाग। 0.5-2 KBP (0.2-4 KBP की रेंज) के एक औसत लंबाई उत्पन्न स्थिति है कि सिफारिश कर रहे हैं।
  7. फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा या एक डीएनए निष्कर्षण किट (सामग्री देखें) का उपयोग करके शेष नमूनों से डीएनए शुद्ध। शुद्ध डीएनए enChIP विश्लेषण की पैदावार (8.11 देखें) अनुमान लगाने के लिए इनपुट डीएनए के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

एंटीबॉडी के साथ Dynabeads संयुग्मित 7. तैयारी (2 एक्स 10 7 कोशिकाओं के अनुसार)

  1. पूर्वदो 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों, सामान्य माउस आईजीजी का उपयोग करते हुए पूर्व समाशोधन के लिए एक और विरोधी झंडा एबी के साथ ऊष्मायन के लिए अन्य तराशना। प्रत्येक ट्यूब प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की 150 μl (सामग्री देखें) जोड़ें।
  2. एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूबों प्लेस और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. पीबीएस 0.01% बीच 20 (पीबीएस टी) युक्त के 1 मिलीलीटर में मोती निलंबित। एक चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूबों प्लेस और 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें, और फिर कदम दोहराएँ।
  4. 0.1% BSA युक्त पीबीएस टी के 1 मिलीलीटर में मोती निलंबित।
  5. सामान्य माउस आईजीजी या विरोधी झंडा Ab के 15 माइक्रोग्राम जोड़ें और 4 डिग्री सीओ / एन पर बारी बारी से।
  6. तो, संक्षेप में स्पिन एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूबों की जगह और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. पीबीएस टी के 1 मिलीलीटर में मोती निलंबित। नमूना कई बार पलटना और नीचे संक्षेप में स्पिन। तो pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें, एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूबों प्लेस और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। धो दोहराएँपीबीएस टी (तीन धोने कदम की कुल) के साथ दो बार।

8. chromatin immunoprecipitation (2 10 x 7 कोशिकाओं के अनुसार)

  1. मात्रा के पांचवें 5% ट्राइटन X-100 (1% ट्राइटन X-100 के अंतिम एकाग्रता) युक्त संशोधित lysis बफर 3 (लगभग 200 μl) के साथ 5.3 में तैयार खंडित क्रोमेटिन) (लगभग 800 μl) मिलाएं।
  2. सामान्य माउस आईजीजी के साथ संयुग्मित प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोती तैयार किया गया, जिसमें ट्यूब को क्रोमेटिन समाधान जोड़ें। 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाएँ।
  3. एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  4. विरोधी झंडा एबी के साथ संयुग्मित प्रोटीन जी संयुग्मित चुंबकीय मोती तैयार किया गया, जिसमें ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण। 4 डिग्री सीओ / एन पर घुमाएँ।
  5. एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. कम नमक बफर (20 मिमी Tris (8.0 पीएच), 2 मिमी EDTA, 150 मिमी NaCl, 1% त्रि के 1 मिलीलीटर में मोती निलंबितटन एक्स 100, 0.1% एसडीएस, और 1x प्रोटीज अवरोधकों) और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बारी बारी से। एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। Pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धोने कदम दोहराएँ।
  7. दो बार उच्च नमक बफर (20 मिमी Tris (8.0 पीएच), 2 मिमी EDTA, 500 मिमी NaCl, 1% ट्राइटन X-100, 0.1% एसडीएस, और 1x प्रोटीज अवरोधकों) के साथ मोती धो लें।
  8. दो बार LiCl बफर (10 मिमी Tris (पीएच 8.0), 1 मिमी EDTA, 250 मिमी LiCl, 0.5% IGEPAL सीए -630, 0.5% सोडियम deoxycholate, और 1x प्रोटीज अवरोधकों) के साथ मोती धो लें।
  9. एक बार टीबीएस IGEPAL सीए -630 (50 मिमी Tris (7.5 पीएच), 150 मिमी NaCl, 0.1% IGEPAL सीए -630, और 1x प्रोटीज अवरोधकों) के साथ मोती धो लें।
  10. क्षालन बफर के 200 μl में मोती निलंबित (50 मिमी Tris (7.5 पीएच), 150 मिमी NaCl, 0.1% IGEPAL सीए -630, 1x प्रोटीज निरोधक, और 500 माइक्रोग्राम / एमएल 3 × झंडा पेप्टाइड) और के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते बीस मिनट। एक चुंबक स्टैंड पर ट्यूब प्लेस और 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण और elut दोहरानेआयन कदम है।
  11. फिनोल के क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण द्वारा या एक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके eluate के डीएनए छोटे से हिस्से से (उदाहरण के लिए, 5%) शुद्ध (सामग्री देखें)। शुद्ध डीएनए विशिष्ट प्राइमर enChIP पहले 14,16 वर्णित के रूप में कदम 6.7 में तैयार इनपुट डीएनए के साथ तुलना करके विश्लेषण के पैदावार का अनुमान लगाने के सेट के साथ पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

9. एसडीएस पृष्ठ, धुंधला, और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण

  1. 1 2-propanol मिलीलीटर, 3M सोडियम एसीटेट (पीएच 5.2) के 50 μl, और 20 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइकोजन के 5 μl साथ eluate (400 μl) मिलाएं। -20 डिग्री सीओ / एन पर क्रोमेटिन वेग।
  2. नमूना अपकेंद्रित्र (30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 × छ) और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। (10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 16,000 × छ) 70% इथेनॉल और सेंट्रीफ्यूज फिर से 1 मिलीलीटर के साथ गोली कुल्ला। Pipetting द्वारा पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  3. 2x नमूना बफर (125 मिमी Tris (पीएच 6.8), 10% 2-मर्क के 40 μl में गोली निलंबितaptoethanol, 4% एसडीएस, 10% सुक्रोज, और 0.004% bromophenol नीला)। 5 मिनट के लिए भंवर पूरी तरह से गोली भंग, और फिर प्रोटीन denature और तिर्यक रिवर्स करने के लिए 30 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  4. डाई अच्छी तरह से नीचे 1 सेमी तक पहुँचता एसडीएस पृष्ठ के लिए, जेल पर नमूने के 40 μl चलाते हैं। नोट: हम आमतौर पर 4-20% ढाल जैल का उपयोग करें, लेकिन अन्य% जैल का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. Coomassie खूब ब्लू या चांदी के दाग के साथ जेल दाग।
  6. पांच टुकड़े (2 मिमी ऊंचाई) में जेल काट लें।
  7. पहले 13-16 वर्णित के रूप में जेल पाचन और बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण में प्रदर्शन करते हैं।
  8. 5 10 x 7 कोशिकाओं प्रत्येक (1 एक्स 10 8 कोशिकाओं की कुल) के साथ SILAC प्रयोगों के लिए, 2x नमूना बफर के 40 μl में प्रारंभिक पांच ट्यूब (यह पैमाने पर करने के लिए आवश्यक नहीं है) से गोली निलंबित।

शाही सेना और आरएनए Seq विश्लेषण के 10 शुद्धीकरण

  1. EnChIP के बाद शाही सेना शुद्ध करने के लिए, RNase अवरोध की 5 यू / मिलीलीटर जोड़ने (एसईबफर समाधान के लिए सभी के लिए ई सामग्री), संशोधित lysis बफर 3 और क्षालन बफर, सिवाय जो RNase अवरोध की 40 यू / एमएल जोड़ने के लिए।
  2. 5 एम NaCl के 16 μl के साथ eluate (400 μl) मिश्रण और 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  3. नमूने के लिए एसिड guanidinium फिनोल आधारित अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर (सामग्री देखें) जोड़ें। उसके बाद 15 सेकंड के लिए भंवर और 5-15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 12,000 × छ और आरटी पर 15 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र।
  4. एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और पी-bromoanisole के 5 μl जोड़ें। उसके बाद 15 सेकंड के लिए भंवर और 3-5 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। 12,000 × छ और आरटी पर 10 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र।
  5. एक नया 2 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला (लगभग 1 मिलीलीटर) स्थानांतरण और 2-propanol के 1 मिलीलीटर जोड़ें। ट्यूब पलटना और 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। (सामग्री देखें) एक शाही सेना शुद्धि किट में एक स्तंभ पर मिश्रण कर लेता है। 12,000 × पर 1 मिनट के लिए स्तंभ अपकेंद्रित्र जी और आर टी।
  6. धुलाईएक शाही सेना शुद्धि किट में शाही सेना धो बफर के 400 μl (सामग्री देखें) के साथ स्तंभ।
  7. DNase मैं (1 यू / μl), 10 × DNase मैं प्रतिक्रिया बफर के 8 μl, DNase / RNase मुक्त पानी के 3 μl, और आरएनए धो बफर के 64 μl में 5 μl के DNase मैं कॉकटेल के 80 μl जोड़ें (मिश्रण स्तंभ के लिए एक शाही सेना शुद्धि किट (सामग्री देखें))। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं और फिर 12,000 × छ और आरटी पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र।
  8. दो बार एक शाही सेना शुद्धि किट में शाही सेना prewash बफर के 400 μl (सामग्री देखें) के साथ स्तंभ धो लें।
  9. DNase / RNase मुक्त पानी की 50 μl के साथ शाही सेना Elute। eluted आरएनए आरएनए अनुक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Representative Results

कुल मिलाकर, लक्ष्य जीनोमिक क्षेत्रों में से 1-30%। EnChIP का उपयोग कर शुद्ध 3 enChIP की पैदावार दिखा प्रतिनिधि डेटा शामिल चित्रा किया जा सकता टेलोमेयर और इंटरफेरॉन (IFN) विनियामक कारक -1 (आईआरएफ -1) जीन के प्रमोटर को निशाना विश्लेषण करती है। ठेठ परिणाम, 1 टेबल सूचियों के उदाहरण के रूप enChIP-SILAC, टेबल द्वारा की पहचान एक IFNγ विशेष तरीके में आईआरएफ-1 प्रमोटर के साथ जुड़े प्रोटीन 2 सूचियों मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयुक्त enChIP द्वारा की पहचान टेलोमेर बाध्यकारी प्रोटीन (enChIP एमएस) और 3 टेबल सूचियों enChIP-शाही सेना Seq द्वारा की पहचान टेलोमेयर के साथ जुड़े आरएनए।

आकृति 1
EnChIP 1. अवलोकन चित्रा। enChIP का उपयोग कर CRISPR (ए, बी) और ताल (सी, डी, ई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
GBlock चित्रा 2. अनुक्रम। U6 प्रमोटर (काले रंग में), जी न्यूक्लियोटाइड खefore गाइड अनुक्रम (नीले रंग में), गाइड अनुक्रम (लाल रंग में) (gRNA स्पेसर), (हरे रंग में) पाड़ अनुक्रम, और (नारंगी में) टर्मिनेटर अनुक्रम दिखाए जाते हैं।

चित्र तीन
प्रतिनिधि enChIP का विश्लेषण करती है 3. पैदावार चित्रा। लक्ष्य आईआरएफ -1 ठिकाना और गैर लक्ष्य Sox2 ठिकाना लिए (ए) का प्रतिशत आदानों। लक्ष्य टेलोमेयर और गैर लक्ष्य γ-उपग्रहों के लिए (बी) का प्रतिशत आदानों। आंकड़े अनुकूल है और पिछले प्रकाशनों 15,16 से संशोधित किया गया है।

श्रेणियाँ प्रोटीन
प्रतिलिपि DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homolog, PURβ,
सक्रिय शाही सेना पोलीमरेज़ द्वितीय ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक P15,
BTF3, Myb बाध्यकारीप्रोटीन 1A
हिस्टोन deacetylation,
corepressor घटकों 		RBBP4, PA2G4, TBL3
एसटीट्रांसफेरासी प्रोटीन arginine एन मिथाइल 1
डीएनए topoisomerase डीएनए topoisomerase 2α
Histones हिस्टोन H2A.Z, हिस्टोन H3.2

तालिका 1:। EnChIP-SILAC द्वारा की पहचान एक IFNγ विशेष तरीके में मानव आईआरएफ-1 प्रमोटर क्षेत्र के साथ जुड़े प्रोटीन के उदाहरण तालिका में पिछले एक प्रकाशन 16 से अनुकूलित किया गया है।

श्रेणियाँ प्रोटीन
स्तनधारी टेलोमेर बंधनकारी प्रोटीन पीएमएल, जन प्रतिनिधि कानून, CDK1, PARP1, PCBP1
टेलोमेर-द्विखमीर में nding प्रोटीन
या अन्य जीवों 		IMP4
साथ बातचीत प्रोटीन टेलोमेर बाध्यकारी
प्रोटीन [जुड़े टेलोमेर बाध्यकारी प्रोटीन] 		डीएनए पोलीमरेज़ α (POLA1) [Cdc13p],
ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1],
exportin -5 [TERT], GNL3L [TRF1],
exportin -1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Heterochromatin के लिए स्थानीयकृत प्रोटीन BEND3
प्रोटीन epigenetic के निशान के विनियमन KDM5C
जिसका म्यूटेशन टेलोमेर कार्य प्रभावित प्रोटीन डीएनए पोलीमरेज़ α (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
ग्लूटामेट सिस्टीन ligase, glutaredoxin, SMRC1

तालिका 2:। EnChIP एमएस द्वारा की पहचान माउस टेलोमेयर के साथ जुड़े प्रोटीन के उदाहरण तालिका adapte कर दिया गया हैपिछले एक प्रकाशन 15 से घ।

श्रेणियाँ आरएनए
टेलोमिरेज घटकों Terc, Rmrp
Telomeric आरएनए Terras
scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
एच / एसीए snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
सी / डी snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA Neat1

तालिका 3:। EnChIP-शाही सेना Seq तालिका में पिछले एक प्रकाशन 17 से अनुकूलित किया गया है द्वारा की पहचान माउस टेलोमेयर के साथ जुड़े RNAs के उदाहरण हैं।

Acknowledgments

इस काम ताकेदा विज्ञान फाउंडेशन (टीएफ) द्वारा समर्थित किया गया था; असाही ग्लास फाउंडेशन; Uehara मेमोरियल फाउंडेशन (एचएफ); Kurata मेमोरियल हिताची विज्ञान और प्रौद्योगिकी फाउंडेशन (टीएफ और एचएफ); सहायता अनुदान में युवा वैज्ञानिकों के लिए (बी) (# 25,830,131), अनुदान सहायता में साइंटिफिक रिसर्च (सी) (# 15K06895) (टीएफ) के लिए; और एक अनुदान सहायता में अभिनव क्षेत्रों 'ट्रांसक्रिप्शन साइकिल' पर वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए (# 25118512 & # 15H01354), अनुदान सहायता में साइंटिफिक रिसर्च (बी) (# 15H04329) के लिए, अनुदान सहायता में खोजपूर्ण अनुसंधान के लिए ( # 26650059) और जापान के शिक्षा मंत्रालय, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी से 'जीनोम समर्थन' (# 221S0002) (एचएफ)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gBlock synthesis service Life Technologies Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service IDT (Integrated DNA Technologies) gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo Addgene 51128
pSIR-GFP Addgene 51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene 51135
pSIR-hCD2 Addgene 51143
TAL synthesis service Life Technologies GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 Addgene 47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro Addgene 51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG Addgene 51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 Addgene 51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo Addgene 51260
anti-FLAG M2 Ab Sigma-Aldrich F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2 Sigma-Aldrich F4049
DMEM medium for SILAC Life Technologies 89985 Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC Life Technologies 89986
L-Lysine-2HCl for SILAC Life Technologies 89987 For Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC Life Technologies 89989 For Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Life Technologies 89988 For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Life Technologies 89990 For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free Roche Diagnostics 4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201 Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator Zymo Research D5205
Dynabeads-Protein G Life Technologies DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2611
Isogen II Nippon Gene 311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050
LTQ Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC Advance, Michrom Bioresources A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler CTC Analytics A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 107 चिप क्रोमेटिन immunoprecipitation ठिकाना विशिष्ट चिप enChIP इंजीनियर डीएनए बाध्यकारी अणु की मध्यस्थता चिप क्रोमेटिन एपिजेनेटिक्स जीनोम समारोह
विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्र और enChIP द्वारा एसोसिएटेड अणु की पहचान का अलगाव
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Fujita, T., Fujii, H. Isolation of… More

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).

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