Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53478
Automatic Translation
1, 1
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

Introduction

مطلوب تحديد الجزيئات المرتبطة مناطق الجينوم محددة من الفائدة لفهم آليات تنظيم وظائف الجينوم مثل النسخ وتنظيم جينية. على الرغم من أن وضعت العديد من التقنيات لتحليل الكيمياء الحيوية من مناطق الجينوم محددة 1-7، لا يتم استخدامها على نطاق واسع في هذه المرحلة بسبب المشاكل الجوهرية من قبيل التطبيق المحدود (على سبيل المثال، فقط من أجل عالية نسخ مواضع عدد أو مواضع حيث تتكرر) و الكثير من الوقت والجهود المطلوبة.

من أجل إجراء تحليل كيميائي حيوي من مناطق الجينوم معينة بسهولة، وضعنا اثنين من موضع معين لونين مناعي (رقاقة) التكنولوجيات، وهي إقحامي رقاقة (iChIP) 13/08 وهندستها بوساطة جزيء رقاقة الحمض النووي ملزم (enChIP) 14-17 . في iChIP، ووضع علامة على موضع الاهتمام عن طريق إدراج تسلسل الاعتراف بروتين ملزمة الحمض النووي الخارجية مثل ليكسثم يتم عزل A. موضع كتبها تنقية تقارب باستخدام بروتين ملزمة DNA الموسومة. في enChIP وهندستها جزيئات الحمض النووي ملزم، مثل البروتينات والزنك الاصبع، النسخ الشبيهة المنشط (TAL) البروتينات، وتتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) المجمعات، وتستخدم لوضع علامة على موضع الاهتمام (الشكل 1). وفي وقت لاحق، تم عزل المنطقة الجينومية التي كتبها تنقية تقارب من جزيئات الحمض النووي ملزم المعلمة.

واحدة من مزايا enChIP على iChIP هو أن إدراج تسلسل الاعتراف بروتين ملزمة الحمض النووي الخارجية ليست ضرورية. استهداف مواضع باستخدام المجمعات كريسبر يتكون من شكل غير نشط حفاز من Cas9 (dCas9) ودليل الحمض النووي الريبي (gRNA) هو أسهل بكثير من استهداف هذه المناطق من قبل iChIP أو enChIP باستخدام TAL والزنك والبروتينات الإصبع. هنا، نحن تصف بروتوكول خطوة بخطوة لenChIP جنبا إلى جنب مع مطياف الكتلة وRNA تسلسل (RNA تسلسل) لتحديد مكان-لجمعياتالبروتينات تيد والرنا، على التوالي.

Protocol

1. تصميم المهندسة جزيئات الحمض النووي ملزم إدراكا موضع الهدف

  1. لenChIP باستخدام المجمعات كريسبر، استخدم أداة على شبكة الإنترنت CRISPRdirect (http://crispr.dbcls.jp) لتحديد تسلسل المرشح gRNA المستهدفة في المنطقة الجينومية من الفائدة كما هو موضح سابقا (18). هذه الأداة الويب ترجع 23 سنة مضت المواقع الجينومية من النموذج 5'-N 20 NGG-3 "في المنطقة المستهدفة.
  2. توليف gBlock بما في ذلك U6 تسلسل المروج وتسلسل 5'-N 20 في 5'-N 20 NGG-3 "استخدام خدمات تجارية (انظر الشكل 2) 19،20. لأغراض subcloning، وتشمل مواقع انزيم تقييد المناسبة خارج gBlock.
  3. إدراج gBlock إلى ناقلات المناسب كما هو موضح سابقا (16). هي عدة ناقلات فيروسات لgBlocks المتاحة (انظر المواد).
  4. لenChIP باستخدام بروتينات TAL، تصميم البروتينات TAL الاعتراف TARGوآخرون مواضع. توليد البلازميدات ترميز البروتينات TAL باستخدام الخدمات التجارية. توليد ناقلات التعبير التي تحتوي على البروتينات TAL تنصهر مع واحد أو أكثر العلامات مثل 3 × FLAG كما هو موضح سابقا (15).

إنشاء 2. خلايا لتحليل enChIP

  1. التعبير عن 3 × FLAG-dCas9 وgRNA (الإجراء القائم على كريسبر) أو 3 × FLAG التل (TAL الداخلي القائم على البروتين) في الخلايا لتحليلها كما هو موضح سابقا 14-17.
    1. استخدام ترنسفكأيشن عابرة اذا كانت كفاءة ترنسفكأيشن عالية. متجه التعبير التي تحتوي على 3 × FLAG-dCas9 والمروج CMV يتوفر (انظر المواد).
    2. النظر في إنشاء transformants مستقرة استخدام الأساليب التقليدية إذا كفاءة ترنسفكأيشن عابرة منخفضة. بالإضافة إلى ناقلات فيروسات المذكورة أعلاه لgBlock، هي ناقلات فيروسات من 3 × FLAG-dCas9 المتاحة (انظر المواد).
    2. 14-17.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تأكيد التعبير عن هذه البروتينات تصفها تلطيخ الخلايا مع anti-FLAG-FITC وتحليل FACS لاحق. بروتوكول لتلطيخ الخلايا يمكن تحميلها من موقعنا (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
  2. تأكيد تعبير عن gRNA عن طريق معيار تقنية RT-PCR.
  3. لتحديد كمية البروتينات التفاعل مع المنطقة الجينومية من الاهتمام، والنظر في استخدام العلامات النظائر المستقرة التي كتبها الأحماض الأمينية في الثقافة الخلية (SILAC) تحليل جنبا إلى جنب مع enChIP (enChIP-SILAC).
    ملاحظة: وسائل الإعلام لتحليل SILAC يمكن شراؤها من البائعين التجارية. SILAC هو قوي في الكشف عن التفاعلات محددة.
    1. خلايا الثقافة في SILAC المتوسطة الثقيلة. إعداد الخلايا cultuأحمر في ضوء SILAC المتوسطة كوسيلة لمراقبة سلبية. استخدام 5 × 10 7 خلايا على الاقل لكل المتوسطة SILAC (الثقيلة أو الخفيفة). لوضع العلامات كفاءة، إضافة كل L-ليسين-2HCl، 13 C 6 و L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك، 13 C 6، 15 N 4 في وسائل الإعلام SILAC الثقيلة. ملاحظة: لا يقل عن خمسة انقسامات الخلية ضرورية للبروتينات التسمية.
      1. على سبيل المثال، ثقافة خلايا ليفية HT1080 الإنسان التعبير عن ثابت 3xFLAG-dCas9 وgRNA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في وسائل الاعلام DMEM لSILAC ومدال مصل بقري جنيني مع يسين-2HCl بالإضافة إلى L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك (فاتح متوسط) أو 13 C 6 L-ليسين-2HCl بالإضافة إلى 13 C 6 15 N 4 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك (المتوسطة الثقيلة) (انظر المواد) 16. إضافة 50 ملغ من ضوء أو الثقيلة L-ليسين-2HCl وL-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك في 500 مل من المتوسط.
      2. خلايا يعرض للتريبسين وreplate قبل أن تصبح متموجة بحيث تحافظ على خلايا growt الأسيح.

3. يشابك من الخلايا مع الفورمالديهايد

  1. للخلايا في الثقافة تعليق، ونقل 2 × 10 7 الخلايا معربا عن البروتينات 3xFLAG التل أو 3xFLAG-dCas9 بالإضافة إلى gRNA وتعليق في 30 مل من مستنبت منتظمة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. عندما تستخدم المزيد من الخلايا، وزيادة كميات وكميات من الكواشف نسبيا. للتجارب SILAC، مزيج من الخلايا المستزرعة في المتوسط ​​الثقيلة أو المتوسطة الخفيفة (5 × 10 7 خلايا لكل منهما) وتقسيم مجموعه 1 × 10 8 خلايا إلى 5 أنابيب تحتوي على 2 × 10 7 الخلايا.
  2. إضافة 810 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى 30 مل من تعليق خلية (تركيز النهائي 1٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. لخلايا ملتصقة، إصلاح الخلايا مباشرة في أطباق الثقافة من خلال إضافة 810 ميكرولتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى 30 مل من مستنبت.
  3. وقف يشابك بإضافة 3.1 مل من 1،25 M الجلايسين الحل (تركيز النهائي 127 ملم)، وفي احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
  4. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي (300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية). تجاهل بعناية طاف بما في ذلك الفورمالديهايد وتخزينه في زجاجة النفايات المناسبة.
    1. لخلايا ملتصقة، فصل الخلايا مع مكشطة الخلية والحصاد في أنبوب 50 مل، وجمع الخلايا كما هو موضح في هذه الخطوة.
    2. للتجارب SILAC، مزج خلايا منفصلة مثقف في المتوسط ​​الثقيلة أو المتوسطة الخفيفة (5 × 10 7 خلية لكل منهما)، تقسيم مجموعه 1 × 10 8 خلايا إلى 5 أنابيب تحتوي على 2 × 10 7 خلايا، وجمع الخلايا كما هو موضح في هذه خطوة.
  5. غسل الخلية بيليه مع 30 مل من برنامج تلفزيوني مرتين في أنبوب. تجاهل بعناية طاف بما في ذلك الفورمالديهايد وتخزينها في النفايات المناسبة bottle.Handle النفايات الفورمالديهايد وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية. الخلايا الثابتة يمكن تجميد وتخزين في -80 ° C.

4. إعداد لونين (في 2 × 107 الخلايا)

  1. تعليق الخلايا الثابتة في 10 مل من العازلة تحلل الخلية (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 0.5٪ IGEPAL CA-630، و 1 × مثبطات الأنزيم البروتيني)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
  2. الطرد المركزي العينة (830 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق) وتجاهل طاف بعناية.
  3. تعليق بيليه في 10 مل من تحلل العازلة النووي (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، و 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، و 0.5٪ lauroylsarcosine، ومثبطات الأنزيم البروتيني 1X). احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة ودوامة كل 2-3 دقيقة.
  4. الطرد المركزي العينة (830 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 8 دقائق) وتجاهل طاف بعناية.
  5. يغسل بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني. بيليه (لونين جزء) يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية بعد تجميد فوري في النيتروجين السائل.

5. صوتنة من لونين (في 2 × 10 7 خلايا)

  1. تعليق جزء لونين في 800 ميكرولتر منتعديل العازلة تحلل 3 (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني) ونقل في أنبوب 1.5 مل.
  2. يصوتن لونين باستخدام sonicator (انظر المواد) والشروط التالية: الإخراج: 3؛ واجب: 100٪ (مستمر)؛ والوقت: مجانا. أداء 10-18 دورات صوتنة لمدة 10 ثانية والتبريد على الجليد لمدة 20 ثانية. لتجنب الإفراط في التدفئة، واحتضان العينات على الجليد لمدة 2 دقيقة كل 5-6 دورات. لتجنب رغوة، والحفاظ على موقف غيض من التحقيق صوتنة 0.5 سم فوق الجزء السفلي من الأنبوب.
  3. أجهزة الطرد المركزي في العينة (16000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة) ونقل طاف في أنبوب 1.5 مل. يمكن تخزينها لونين sonicated في -80 درجة مئوية بعد تجميد فوري في النيتروجين السائل.

6. تقييم لونين تجزئة

  1. مزيج 10 ميكرولتر من لونين مجزأة مع 85 ميكرولتر من الماء المقطر.
  2. إضافة 4 ميكرولترمن 5 M كلوريد الصوديوم واحتضان عند 65 درجة CO / N.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ريبونوكلياز ألف واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  4. إضافة 2 ميكرولتر من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة)، 4 ميكرولتر من 1 M تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، و 1 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروتين كاف، ثم احتضان عند 45 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  5. منفصلة 10 ميكرولتر من العينة الكهربائي في هلام الاغاروز 1٪ لا يحتوي على تلطيخ الأصباغ مثل SYBR الأخضر.
  6. وصمة عار الجل لتقييم توزيع أطوال لونين مجزأة. ينصح الظروف التي تولد متوسط ​​طول 0.5-2 KBP (مجموعة من 0،2-4 KBP).
  7. تنقية الحمض النووي من العينات المتبقية عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم أو باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر المواد). الحمض النووي المنقى يمكن استخدام DNA المدخلات لتقدير غلة التحليلات enChIP (انظر 8.11).

7. إعداد Dynabeads مترافق مع الأجسام المضادة (في 2 × 10 7 خلايا)

  1. قبلحلج اثنين من 1.5 مل أنابيب، واحد لمرحلة ما قبل المقاصة باستخدام مفتش الفأر العادي والآخر للحضانة مع المضادة للFLAG أب. إضافة 150 ميكرولتر من البروتين G مترافق الخرز المغناطيسي (انظر المواد) إلى كل أنبوب.
  2. وضع أنابيب على موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting.
  3. تعليق الخرز في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.01٪ توين-20 (PBS-T). وضع أنابيب على الوقوف المغناطيسي وانتظر لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف قبل pipetting، ثم كرر هذه الخطوة.
  4. تعليق الخرز في 1 مل من التي تحتوي على 0.1٪ BSA PBS-T.
  5. إضافة 15 ميكروغرام من مفتش الماوس العادي أو مكافحة FLAG أب وتناوب على 4 درجات CO / N.
  6. تدور باستمرار لفترة وجيزة، ثم وضع أنابيب على موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting.
  7. تعليق الخرز في 1 مل من PBS-T. عكس العينة عدة مرات، وتدور باستمرار لفترة وجيزة. وضع أنابيب على موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق، ثم تجاهل طاف قبل pipetting. تكرار غسلأكثر مرتين مع PBS-T (ما مجموعه ثلاث خطوات غسل).

8. مناعي لونين (في 2 × 10 7 خلايا)

  1. مزج لونين مجزأة أعد في 5.3) (حوالي 800 ميكرولتر) مع خمس من حجم (حوالي 200 ميكرولتر) المعدلة العازلة تحلل 3 تحتوي على 5٪ تريتون X-100 (تركيز النهائي من 1٪ تريتون X-100).
  2. إضافة حل لونين للأنبوب الذي تم إعداد حبات مغناطيسية بروتين G-مترافق مترافق مع الماوس العادي مفتش. تناوب على 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق.
  4. نقل طاف في أنبوب التي أعد حبات مغناطيسية بروتين G-مترافق مترافق مع مكافحة FLAG أب. تناوب على 4 درجات CO / N.
  5. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting.
  6. تعليق الخرز في 1 مل من العازلة الملح منخفضة (20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 2 مم EDTA، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ تريطن X-100، 0.1٪ SDS، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني)، وتناوب على 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف قبل pipetting وكرر الخطوة غسل.
  7. تغسل حبات مع العازلة الملح العالية (20 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 2 مم EDTA، 500 ملي كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ SDS، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني) مرتين.
  8. تغسل حبات مع LiCl العازلة (10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA، 250 ملي LiCl، و 0.5٪ IGEPAL CA-630، و 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، ومثبطات الأنزيم البروتيني 1X) مرتين.
  9. تغسل حبات مع TBS-IGEPAL CA-630 (50 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ IGEPAL CA-630، و1X مثبطات الأنزيم البروتيني) مرة واحدة.
  10. تعليق الخرز في 200 ميكرولتر من شطف العازلة (50 ملي تريس (7.5 درجة الحموضة)، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.1٪ IGEPAL CA-630، مثبطات الأنزيم البروتيني 1X، و 500 ميكروغرام / مل 3 × FLAG الببتيد)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وضع أنبوب في موقف المغناطيس والانتظار لمدة 3 دقائق. نقل طاف في أنبوب جديد 1.5 مل وكرر elutايون خطوة.
  11. تنقية DNA من جزء صغير (على سبيل المثال، 5٪) من شطافة عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم أو باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي (انظر المواد). الحمض النووي المنقى يمكن استخدامها لPCR مع التمهيدي معين يحدد لتقدير غلة enChIP يحلل بمقارنة مع الحمض النووي المدخلات التي أعدت في الخطوة 6.7 كما هو موضح سابقا 14،16.

9. SDS-PAGE، تلطيخ، وتحليل كتلة الطيف

  1. مزيج شطافة (400 ميكرولتر) مع 1 مل من 2 بروبانول، 50 ميكرولتر من 3M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2)، و 5 ميكرولتر من 20 ملغ / مل الجليكوجين. ترسيب لونين في -20 درجة CO / N.
  2. الطرد المركزي العينة (16000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة) وتجاهل طاف. شطف بيليه مع 1 مل من الايثانول 70٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى (16000 × غرام عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة). تجاهل طاف تماما من قبل pipetting.
  3. تعليق بيليه في 40 ميكرولتر من عينة العازلة 2X (125 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 10٪ 2-الحائزاتaptoethanol، 4٪ SDS، و 10٪ سكروز، و0.004٪ برموفينول الأزرق). دوامة لمدة 5 دقائق لإذابة بيليه تماما، ثم احتضان عند 100 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتفسد البروتينات وعكس يشابك.
  4. لSDS-PAGE، تشغيل 40 ميكرولتر من العينة على هلام حتى يصل الصبغة 1 سم تحت البئر. ملاحظة: نحن عادة استخدام المواد الهلامية 4-20٪ التدرج، ولكن المواد الهلامية الأخرى٪ يمكن استخدامها.
  5. وصمة عار الجل مع Coomassie بريليانت الأزرق أو الفضة وصمة عار.
  6. قطع هلام إلى خمس قطع (2 ملم الارتفاع).
  7. أداء في الهضم جل والتحليل الطيفي الشامل كما هو موضح سابقا 13-16.
  8. للتجارب SILAC مع 5 × 10 7 خلايا كل (ما مجموعه 1 × 10 8 خلايا)، تعليق بيليه من الأنابيب الخمسة الأولى في 40 ميكرولتر من عينة العازلة 2X (أنه ليس من الضروري لزيادة).

10. تنقية RNA وRNA تسلسل تحليل

  1. لتنقية RNA بعد enChIP، إضافة 5 U / مل من ريبونوكلياز المانع (SEمواد ه) لجميع الحلول العازلة، باستثناء تعديل العازلة تحلل 3 وشطف العازلة، التي تضيف 40 U / مل من ريبونوكلياز المانع.
  2. مزيج شطافة (400 ميكرولتر) مع 16 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  3. إضافة 1 مل من كاشف أساس حمض guanidinium الفينول (انظر المواد) للعينة. دوامة لمدة 15 ثانية ثم في احتضان RT ل5-15 دقيقة. الطرد المركزي العينة لمدة 15 دقيقة في 12000 × ز وRT.
  4. نقل طاف لأنبوب جديد 1.5 مل وإضافة 5 ميكرولتر من ف bromoanisole. دوامة لمدة 15 ثانية ثم في احتضان RT لمدة 3-5 دقيقة. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 12000 × ز وRT.
  5. نقل طاف (حوالي 1 مل) في أنبوب جديد 2 مل وإضافة 1 مل من 2 بروبانول. عكس الأنبوب واحتضان في RT لمدة 10 دقيقة. تحميل الخليط على عمود في عدة تنقية RNA (انظر المواد). أجهزة الطرد المركزي العمود لمدة 1 دقيقة في 12000 × ز وRT.
  6. غسلالعمود مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي غسل العازلة في عدة تنقية RNA (انظر المواد).
  7. إضافة 80 ميكرولتر من الدناز I كوكتيل (مزيج من 5 ميكرولتر من الدناز I (1 U / ميكرولتر)، 8 ميكرولتر من 10 × الدناز I رد فعل مؤقت، 3 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز خالية من المياه، و 64 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي غسل العازلة في طقم تنقية الحمض النووي الريبي (انظر المواد)) إلى العمود. احتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 12000 × ز وRT.
  8. غسل العمود مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي PreWash العازلة في عدة تنقية RNA (انظر المواد) مرتين.
  9. أزل الحمض النووي الريبي مع 50 ميكرولتر من الدناز / ريبونوكلياز خالية من المياه. الحمض النووي الريبي مزال يمكن استخدامها لRNA التسلسل.

Representative Results

عموما، يمكن تنقيته 1-30٪ من مناطق الجينوم الهدف باستخدام enChIP الشكل 3 يتضمن بيانات تمثيلية تبين غلة enChIP تحليلات تستهدف التيلوميرات ومروج للفيروسات (IFN) التنظيمي عامل 1 (IRF-1) الجينات. كأمثلة على نتائج نموذجية، يورد الجدول 1 البروتينات المرتبطة المروج IRF-1 بطريقة IFNγ معينة حددها enChIP-SILAC، الجدول 2 قوائم البروتينات ملزم التيلومير التي حددها enChIP جنبا إلى جنب مع قياس الطيف الكتلي (enChIP-MS) ويتضمن الجدول 3 الرنا المرتبطة التيلومير التي حددها enChIP-RNA تسلسل.

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على enChIP. enChIP باستخدام كريسبر (A، B) وTAL (C، D، E الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. تسلسل gBlock. المروج U6 (باللون الأسود)، وG النوكليوتيدات بefore تسلسل دليل (باللون الأزرق)، يتم عرض تسلسل دليل (gRNA هل) (باللون الأحمر)، وتسلسل سقالة (باللون الأخضر)، وتسلسل فاصل (باللون البرتقالي).

الشكل (3)
الشكل 3. العائد من تحليلات enChIP ممثل. المدخلات (A) النسبة المئوية لهدف IRF-1 موضع وغير المستهدفة Sox2 مكان. المدخلات (B) النسبة المئوية للالتيلوميرات المستهدفة وغير المستهدفة γ-الأقمار الصناعية. تم تعديل الأرقام وتعديلها من المنشورات السابقة 15،16.

أقسام البروتينات
نسخ DDX1، PARP1، CKAP4، Pescadillo homolog، PURβ،
تنشيط البلمرة RNA II النسخي المنشط P15،
BTF3، MYB ملزمالبروتين 1A
deacetylation هيستون،
مكونات تميم الكاظمة 		RBBP4، PA2G4، TBL3
أسيتيل أرجينين البروتين N-ناقلة ميثيل 1
DNA topoisomerase DNA topoisomerase 2α
الهستونات هيستون H2A.Z، هيستون H3.2

الجدول 1: أمثلة من البروتينات المرتبطة IRF-1 منطقة المروج الإنسان بطريقة IFNγ معينة حددها enChIP-SILAC تم تكييفها الجدول من منشور السابق 16.

أقسام البروتينات
البروتينات ملزم التيلومير الثدييات حزب الرابطة الاسلامية، الجيش الوطني الرواندي، CDK1، PARP1، PCBP1
التيلومير ثنائيةالاكتشاف البروتينات في الخميرة
أو الكائنات الحية الأخرى 		IMP4
البروتينات التفاعل مع التيلومير ملزمة
البروتينات [بروتين يرتبط ملزم التيلومير] 		البلمرة DNA α (POLA1) [Cdc13p]،
ARMC6 [TRF2]، CTBP1 [FOXP2-POT1]،
exportin-5 [TERT]، GNL3L [TRF1]،
exportin-1 [TERT]، 14-3-3 [TERT]
البروتينات توطين لالمغاير BEND3
البروتينات التي تنظم علامات جينية KDM5C
البروتينات التي تؤثر على وظيفة التيلومير الطفرات α البلمرة DNA (POLA1)، HAT1، Nup133،
CDK7، DPOE1، PRDX1، TYSY،
الغلوتامات السيستين يغاز، glutaredoxin، SMRC1

الجدول 2: أمثلة من البروتينات المرتبطة التيلوميرات الماوس التي تحددها enChIP-MS وكان جدول adapteد من منشور السابق 15.

أقسام الرنا
مكونات التيلوميراز TERC، Rmrp
Telomeric الرنا تراسات
scaRNAs Scarna6، Scarna10، Scarna13، Scarna2
H / ACA snoRNAs Snora23، Snora74a، Snora73b، Snora73a
C / D snoRNAs Snord17، Snord15a، Snord118
lncRNA Neat1

الجدول 3: أمثلة من الرنا المرتبطة التيلوميرات الماوس التي تحددها-RNA تسلسل enChIP وقد تم تعديل الجدول من منشور السابق 17.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم تاكيدا (TF)؛ مؤسسة الزجاج أساهي؛ مؤسسة ميموريال أوهارا (HF)؛ وكوراتا التذكارية هيتاشي علوم والتكنولوجيا (TF وHF)؛ منح في المعونة للعلماء الشباب (B) (# 25830131)، منحة في والمعونة للبحوث العلمية (C) (# 15K06895) (TF)؛ ومنحة في والمعونة للبحوث العلمية في "النسخ الدراجات المجالات المبتكرة (# 25118512 & # 15H01354)، منحة في والمعونة للبحوث العلمية (B) (# 15H04329)، منحة في والمعونة للبحوث الاستكشافية ( # 26650059) و "دعم الجينوم '(# 221S0002) (HF) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gBlock synthesis service Life Technologies Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service IDT (Integrated DNA Technologies) gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo Addgene 51128
pSIR-GFP Addgene 51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene 51135
pSIR-hCD2 Addgene 51143
TAL synthesis service Life Technologies GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 Addgene 47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro Addgene 51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG Addgene 51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 Addgene 51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo Addgene 51260
anti-FLAG M2 Ab Sigma-Aldrich F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2 Sigma-Aldrich F4049
DMEM medium for SILAC Life Technologies 89985 Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC Life Technologies 89986
L-Lysine-2HCl for SILAC Life Technologies 89987 For Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC Life Technologies 89989 For Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Life Technologies 89988 For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Life Technologies 89990 For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free Roche Diagnostics 4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201 Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator Zymo Research D5205
Dynabeads-Protein G Life Technologies DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2611
Isogen II Nippon Gene 311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050
LTQ Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC Advance, Michrom Bioresources A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler CTC Analytics A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
  2. Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
  3. Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
  4. Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
  5. Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
  6. Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
  7. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
  8. Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
  9. Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
  10. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
  11. Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
  12. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
  13. Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
  14. Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
  15. Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
  16. Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
  17. Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
  18. Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
  19. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  20. Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
  21. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
  22. Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
  23. Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
  24. Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
  25. O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
  26. de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 107، رقاقة، مناعي لونين، موضع معين رقاقة، enChIP وهندستها ملزم DNA بوساطة جزيء رقاقة، لونين، علم التخلق، وظيفة الجينوم
عزل المناطق الجينوم محددة وتحديد أسوشيتد الجزيئات التي enChIP
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of… More

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter