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Biology

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

Published: January 20, 2016 doi: 10.3791/53478
Automatic Translation
1, 1
1Chromatin Biochemistry Research Group, Combined Program on Microbiology and Immunology, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University

Introduction

Die Identifizierung von Molekülen mit spezifischen genomischen Regionen von Interesse verbunden ist erforderlich, um die Mechanismen der Regulation von genomischer Funktionen wie Transkription und epigenetischen Regulation verstehen. Obwohl mehrere Techniken für die biochemische Analyse von spezifischen genomischen Regionen 1-7 entwickelt wurden, werden sie nicht in großem Umfang zu diesem Zeitpunkt wegen ihrer inhärenten Probleme wie begrenzte Anwendung (beispielsweise nur für eine hohe Kopienzahl Loci oder Loci mit repeats) und gebrauchte zu viel Zeit und Anstrengungen erforderlich.

Um biochemische Analyse spezifischer Genomregionen leicht durchzuführen, haben wir zwei locusspezifische Chromatinimmunpräzipitation (Chip) Technologien, nämlich Insertions- Chip (Ichip) 8-13 und ausgeführt, DNA-bindendes Molekül vermittelte Chip (enChIP) entwickelt 14-17 . In Ichip wird eine Locus von Interesse durch Insertion Erkennungssequenzen eines exogenen DNA-bindendes Protein wie Lex taggedA. Die Ortskurve wird dann durch Affinitätsreinigung unter Verwendung der markierten DNA-bindenden Protein isoliert. In enChIP, konstruiert DNA-bindende Moleküle, wie Zinkfinger-Proteinen, Transkriptionsaktivator-like (TAL) Proteine ​​und gruppierten regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Repeats (CRISPR) -Komplexe verwendet werden, um einen Ort von Interesse zu markieren (Abbildung 1). Anschließend wird die Genomregion durch Affinitätsreinigung des markierten DNA-bindenden Moleküle isoliert.

Einer der Vorteile der enChIP über Ichip dass Insertion Erkennungssequenzen eines exogenen DNA-bindendes Protein ist nicht notwendig. Targeting von Loci unter Verwendung CRISPR-Komplexe, bestehend aus einer katalytisch inaktiven Form Cas9 (dCas9) und einer Führungs RNA (gRNA) ist viel einfacher als Targeting dieser Regionen durch Ichip oder enChIP Verwendung TAL und Zinkfinger-Proteine. Hier beschreiben wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll für enChIP kombiniert mit Massenspektrometrie und RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) locus-Assoziationen zu identifizierented Proteinen und RNAs, die jeweils.

Protocol

1. Design von Engineered DNA-bindende Moleküle in Anerkennung der Target-Locus

  1. Für enChIP Verwendung CRISPR Komplexe, verwenden Sie die CRISPRdirect Web-Tool (http://crispr.dbcls.jp) Kandidaten gRNA Zielsequenzen in der genomischen Region von Interesse, wie zuvor beschrieben 18 zu identifizieren. Dieses Web-Tool liefert 23 bp genomischer Websites der Form 5'-N 20 NGG-3 'im Zielbereich.
  2. Synthetisieren eine gBlock einschließlich der U6-Promotor-Sequenz und die Sequenz der 5'-N 20 in 5'-N 20 NGG-3 'unter Verwendung von kommerziellen Diensten (siehe 2), 19,20. Zur Subklonierung Zwecke umfassen geeignete Restriktionsenzymstellen außerhalb des gBlock.
  3. Legen Sie die gBlock in einen geeigneten Vektor, wie zuvor beschrieben 16. Mehrere retrovirale Vektoren für gBlocks stehen zur Verfügung (siehe Materialien).
  4. Für enChIP mit TAL-Proteinen, entwerfen TAL-Proteinen in Anerkennung der target loci. Generieren Plasmide TAL-Proteinen unter Verwendung von kommerziellen Dienstleistungen, kodiert. Generieren Expressionsvektoren, die TAL-Proteinen mit einem oder mehreren Tags wie 3 × FLAG verschmolzen, wie zuvor beschrieben 15 enthält.

2. Zeitpunkt der Gründung der Zellen für die Analyse enChIP

  1. Ausdruck 3 × FLAG-dCas9 und der gRNA (CRISPR-basierte Verfahren) oder 3 × FLAG-TAL (TAL Proteinbasis Verfahren) in den Zellen, wie zuvor beschrieben, um 14-17 analysiert.
    1. Verwenden transiente Transfektion, wenn die Transfektionseffizienz ist hoch. Ein Expressionsvektor, enthaltend 3 × FLAG-dCas9 und den CMV-Promotor ist verfügbar (siehe Materialien).
    2. In Erwägung ziehen, stabile Transformanten unter Verwendung herkömmlicher Verfahren, wenn die transiente Transfektion Effizienz gering ist. Zusätzlich zu den oben genannten retroviralen Vektoren für gBlock, sind retrovirale Vektoren von 3 × FLAG-dCas9 verfügbar (siehe Materialien).
    2. 14-17.
    Anmerkung: Die Expression dieser markierten Proteine ​​können auch durch intrazelluläre Färbung mit anti-FLAG-FITC und anschließender FACS-Analyse bestätigt werden. Ein Protokoll für die intrazelluläre Färbung steht auf unserer Homepage (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html) heruntergeladen werden.
  2. Ausdruck der gRNA durch Standard-RT-PCR-Technik zu bestätigen.
  3. Für quantitative Identifizierung von Proteinen in Wechselwirkung mit der genomischen Region von Interesse, zu prüfen Verwendung eines Silac (SILAC) Analyse kombiniert mit enChIP (enChIP-SILAC).
    Hinweis: Medien für das SILAC Analyse kann von kommerziellen Anbietern erworben werden. SILAC ist mächtig im Nachweis von spezifischen Wechselwirkungen.
    1. Kulturzellen in SILAC schweren Medium. Bereiten Zellen culturot im SILAC Lichtmedium als negative Kontrolle. Verwenden Sie mindestens 5 x 10 7 Zellen pro SILAC Medium (schwer oder leicht). Für eine effiziente Markierung hinzufügen, sowohl L-Lysin-2 HCl, 13 C 6 und L-Arginin-HCl, 13 C 6, 15 N 4 in den SILAC Schwere Medien. Hinweis: Mindestens fünf Zellteilungen erforderlich, Label-Proteine ​​sind.
      1. Beispielsweise Kultur menschlichen Fibrosarkom-HT1080-Zellen, die 3xFLAG-dCas9 und gRNA bei 37 ° C und 5% CO 2 in DMEM-Medium für SILAC und dialysiertem fötalem Rinderserum mit Lysin-2HCl plus L-Arginin-HCl (Light-Medium) oder 13 C 6 L-Lysin-2 HCl plus 13 C 6 15 N 4 L-Arginin-HCl (Heavy-Medium) (siehe Materialien) 16. Fügen Sie 50 mg von leichten oder schweren L-Lysin-2 HCl und L-Arginin-HCl in 500 ml Medium.
      2. Trypsinize und Ausstrich Zellen, bevor sie konfluent werden, so dass Zellen aufrechtzuerhalten exponentiellen growth.

3. Vernetzung der Zellen mit Formaldehyd

  1. Für Zellen in Suspensionskultur, Transfer 2 x 10 7 Zellen, 3xFLAG-TAL-Proteinen oder 3xFLAG-dCas9 zzgl gRNA und Aussetzung in 30 ml regelmäßigen Kulturmedium in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen. Wenn mehr Zellen verwendet werden, erhöhen Sie die Mengen und Mengen von Reagenzien proportional. Für SILAC Experimenten, mischen Sie die Zellen, die in schweren Medium oder eine Lichtmedium (5 x 10 7 Zellen pro Stück) kultiviert und unterteilen die Gesamtzahl von 1 x 10 8 Zellen in 5 Röhrchen mit 2 x 10 7 Zellen.
  2. Add 810 ul 37% Formaldehyd zu 30 ml der Zellsuspension (Endkonzentration 1%) und bei 37 ° C für 5 min. Für adhärente Zellen, direkt beheben Zellen in Kulturschalen durch Zugabe von 810 ul 37% Formaldehyd und 30 ml Kulturmedium.
  3. Stoppen Sie die Vernetzung durch Zugabe von 3,1 ml von 1,25 M Glycin-Lösung (Endkonzentration 127 mM) undInkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
  4. Sammeln Zellen durch Zentrifugation (300 × g für 5 min bei 4 ° C). Vorsichtig den Überstand verwerfen einschließlich Formaldehyd und speichern sie in einem geeigneten Abfallflasche.
    1. Für adhärente Zellen, lösen die Zellen mit einem Zellschaber und der Ernte in einem 50-ml-Tube, und sammeln Zellen, wie in diesem Schritt beschrieben.
    2. Für SILAC Experimenten, mischen Sie die abgelösten Zellen in schweren Medium oder eine Lichtmedium (5 x 10 7 Zellen je) kultiviert, teilen Sie die Gesamtzahl von 1 x 10 8 Zellen in 5 Röhrchen mit 2 x 10 7 Zellen, und sammeln Zellen, wie in diesem beschrieben Schritt.
  5. Zweimaliges Waschen des Zellpellets mit 30 ml PBS pro Röhrchen. Vorsichtig den Überstand verwerfen einschließlich Formaldehyd und speichern Sie es in einen geeigneten Abfall bottle.Handle Formaldehyd Abfall nach chemischen Sicherheitsrichtlinien. Die fixierten Zellen können eingefroren und bei -80 ° C gelagert werden.

4. Herstellung von Chromatin (je 2 x 107-Zellen)

  1. Aussetzung der fixierten Zellen in 10 ml Zelllysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630 und 1 × Protease-Inhibitoren) und Inkubation auf Eis für 10 min.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe (830 × g bei 4 ° C für 8 min) und den Überstand verwerfen sorgfältig.
  3. Aussetzen des Pellets in 10 ml Atom Lysepuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,5% Lauroylsarkosin und 1x Proteaseinhibitoren). Inkubieren auf Eis für 10 min und Vortex alle 2-3 min.
  4. Zentrifugieren Sie die Probe (830 × g bei 4 ° C für 8 min) und den Überstand verwerfen sorgfältig.
  5. In 10 ml PBS Waschen des Pellets. Das Pellet (Chromatin-Anteil) kann bei -80 ° C nach der sofortigen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

5. Beschallung Chromatin (pro 2 x 10 7 Zellen)

  1. Hängen Sie das Chromatin Fraktion in 800 & mgr; lmodifizierte Lysepuffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) aufnehmen und in ein 1,5 ml Röhrchen.
  2. Beschallen das Chromatin mit einem Ultraschallgerät (siehe Materialien), und die folgenden Bedingungen: Ausgang: 3; Pflicht: 100% (Dauerbetrieb); und Zeit: kostenlos. Zuführen 10-18 Zyklen der Ultraschallbehandlung für 10 s und Abkühlen auf Eis für 20 Sekunden. Eine zu starke Erwärmung zu vermeiden, läßt man die Proben auf Eis für 2 Minuten alle 5-6 Zyklen. Schaumbildung zu vermeiden, halten die Position der Spitze des Beschallungssonde 0,5 cm über dem Boden des Röhrchens.
  3. Zentrifuge die Probe bei (16000 × g bei 4 ° C für 10 min) und den Überstand in ein 1,5 ml Röhrchen. Die beschallt Chromatin kann bei -80 ° C nach der sofortigen Einfrieren in flüssigem Stickstoff gelagert werden.

6. Auswertung der Chromatin Fragmentation

  1. Mischen Sie 10 ul der fragmentierten Chromatin mit 85 ul destilliertem Wasser.
  2. In 4 ul5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° CO / N.
  3. 1 ul 10 mg / ml RNase A und bei 37 ° C für 45 min.
  4. Add 2 ul 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ul 1 M Tris (pH 6,8) und 1 ul 20 mg / ml Proteinase K, und dann bei 45 ° C inkubieren, für 1,5 Std.
  5. Separate 10 ul der Probe durch Elektrophorese in einem 1% Agarose-Gel, das keine Verfärbung Farbstoffe wie SYBR Green enthält.
  6. Fleck des Gels, um die Verteilung der Längen der fragmentierten Chromatin bewerten. Bedingungen, die eine mittlere Länge von 0,5 bis 2 kbp (Bereich von 0,2 bis 4 kbp) zu erzeugen, sind zu empfehlen.
  7. Reinigen DNA von den verbleibenden Proben durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit Hilfe eines DNA-Extraktions-Kits (siehe Materialien). Die gereinigte DNA kann als Eingabe-DNA verwendet werden, um die Ausbeuten an enChIP Analysen (siehe 8.11) zu schätzen.

7. Herstellung von Dynabeads Conjugated Antibodies mit (je 2 x 10 7 Zellen)

  1. Prepare zwei 1,5-ml-Röhrchen, eine für Pre-Clearing mit normalem Maus-IgG und die andere für die Inkubation mit dem Anti-FLAG-Ab. Zugabe von 150 & mgr; l Protein G-konjugierten magnetischen Beads (siehe Materialien) in jedes Röhrchen.
  2. Die Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren.
  3. Aussetzung der Kügelchen in 1 ml PBS, enthaltend 0,01% Tween-20 (PBS-T). Die Röhrchen auf einem Magnetständer und warten Sie 2 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren, und wiederholen Sie den Schritt.
  4. Aussetzung der Kügelchen in 1 ml PBS-T, enthaltend 0,1% BSA.
  5. In 15 & mgr; g normalem Maus-IgG oder anti-FLAG Ab und drehen bei 4 ° CO / N.
  6. Spin down kurz, dann legen Sie die Rohre auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren.
  7. Suspend die Perlen in 1 ml PBS-T. Kehren Sie die Probe mehrmals und Spin-down kurz. Die Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 Minuten, dann den Überstand verwerfen durch Pipettieren. Wiederholen Sie den Waschzwei weitere Male mit PBS-T (insgesamt drei Waschschritte).

8. Chromatin Immunopräzipitation (je 2 x 10 7 Zellen)

  1. Mischen das fragmentierte Chromatin in 5.3 hergestellten) (etwa 800 ul) mit einem Fünftel des Volumens (etwa 200 ul) von modifizierten Lysepuffer 3, enthaltend 5% Triton X-100 (Endkonzentration 1% Triton X-100).
  2. Fügen Sie die Chromatin-Lösung für das Rohr, in dem Protein G-konjugierten mit normalem Maus-IgG, konjugiert magnetischen Kügelchen wurden hergestellt. Rotieren bei 4 ° C für 1 Stunde.
  3. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min.
  4. Den Überstand in das Rohr, in dem G-Protein konjugiert mit anti-FLAG Ab konjugierten magnetischen Beads wurden hergestellt. Rotieren bei 4 ° CO / N.
  5. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren.
  6. Aussetzung der Kügelchen in 1 ml salzarme Puffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) und drehen sich bei 4 ° C für 5 min. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Überstand verwerfen durch Pipettieren und wiederholen Sie den Waschschritt.
  7. Der Kügelchen mit Hochsalzpuffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS und Proteaseinhibitoren 1x) zweimal zu waschen.
  8. Der Kügelchen mit LiCl-Puffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% Natriumdesoxycholat und 1x Proteaseinhibitoren) zweimal zu waschen.
  9. Der Kügelchen mit TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630 und 1x Proteaseinhibitoren) einmal zu waschen.
  10. Suspendieren die Kügelchen in 200 & mgr; l Elutionspuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1x Proteaseinhibitoren und 500 ug / ml 3 × FLAG-Peptid) und bei 37 ° C 20 min. Das Röhrchen auf einem Magneten stehen und warten für 3 min. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Tube und wiederholen Sie den ElutIonenschritt.
  11. Reinigen DNA von kleiner Teil (zB 5%) des Eluats durch Phenol-Chloroform-Extraktion oder mit Hilfe eines DNA-Extraktions-Kits (siehe Materialien). Die gereinigte DNA kann für die PCR verwendet werden, mit spezifischen Primer-Sets, um die Erträge zu schätzen von enChIP Analysen durch Vergleich mit in Schritt 6.7, hergestellt wie zuvor 14,16 beschriebenen Eingangs DNA.

9. SDS-PAGE, Färbung und Massenspektrometrische Analyse

  1. Mischen das Eluat (400 ul) mit 1 ml 2-Propanol wurden 50 ul 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 5 ul 20 mg / ml Glykogen. Fällt das Chromatin bei -20 ° CO / N.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe (16.000 × g bei 4 ° C für 30 Minuten) und den Überstand verwerfen. Spülen Sie das Pellet mit 1 ml 70% Ethanol und erneut abzentrifugiert (16000 × g bei 4 ° C für 10 min). Überstand verwerfen vollständig durch Pipettieren.
  3. Aussetzen des Pellets in 40 ul 2x Probenpuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% Saccharose und 0,004% Bromphenolblau). Wirbel für 5 Minuten, um das Pellet vollständig aufzulösen, und dann bei 100 ° C für 30 min inkubiert, um die Proteine ​​zu denaturieren, und umgekehrt die Vernetzung.
  4. Für SDS-PAGE, führen 40 ul der Probe auf das Gel, bis der Farbstoff erreicht 1 cm unterhalb der Bohrung. Hinweis: Wir verwenden normalerweise 4-20% Gradienten-Gele, aber andere% Gele verwendet werden.
  5. Fleck das Gel mit Coomassie Brilliant Blue oder Silberfärbung.
  6. Schneiden Sie das Gel in fünf Stücke (2 mm Höhe).
  7. Führen Sie in Gel-Verdauung und massenspektrometrische Analyse wie zuvor 13-16 beschrieben.
  8. Für SILAC Experimente mit 5 x 10 7 Zellen jeweils (insgesamt 1 × 10 8 Zellen), auszusetzen Pellet aus den ersten fünf Rohre in 40 ul 2x Probenpuffer (es ist nicht notwendig zu skalieren).

10. Reinigung von RNA und RNA-Seq Analysis

  1. Um die RNA nach enChIP reinigen, fügen Sie 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials), um alle Pufferlösungen, ausgenommen modifizierte Lysepuffer 3 und Elutionspuffer, an die 40 U / ml RNase-Inhibitor hinzuzufügen.
  2. Mischen das Eluat (400 ul) mit 16 ul 5 M NaCl und Inkubation bei 65 ° C für 2 Std.
  3. 1 ml säure Guanidinium-Phenol-Reagens (siehe Materialien) zur Probe. Vortex für 15 Sekunden und dann Inkubation bei Raumtemperatur für 5-15 min. Zentrifugieren Sie die Probe für 15 min bei 12000 g und RT.
  4. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ul p-Bromanisol. Vortex für 15 Sekunden und dann Inkubation bei Raumtemperatur für 3-5 min. Zentrifugieren Sie die Probe für 10 min bei 12000 g und RT.
  5. Den Überstand (etwa 1 ml) in ein neues 2-ml-Tube und 1 ml 2-Propanol. Das Röhrchen und Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. Laden Sie die Mischung auf eine Spalte in einer RNA-Reinigungskits (siehe Materialien). Zentrifugieren Sie die Säule für 1 min bei 12000 g und RT.
  6. Waschendie Säule wurde mit 400 ul Waschpuffer RNA in einem RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien).
  7. Werden 80 & mgr; l DNase I-Cocktail (Mischung von 5 ul DNase I (1 U / ul), 8 & mgr; l von 10 × DNase I-Reaktionspuffer, 3 ul DNase / RNase-freies Wasser und 64 ul RNA Waschpuffer eine RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien)) auf die Säule. Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 15 min und dann zu zentrifugieren für 30 Sekunden bei 12.000 × g und RT.
  8. Mit 400 & mgr; l RNA PreWash Puffer in einer RNA-Reinigungs-Kits (siehe Materialien), wasche zweimal die Spalte.
  9. Elution der RNA mit 50 ul DNase / RNase-freies Wasser. Die eluierte RNA zur RNA-Sequenzierung verwendet werden.

Representative Results

Insgesamt kann 1-30% des Ziels genomischen Regionen mittels enChIP gereinigt werden. Figur 3 enthält repräsentative Daten, die die Ausbeuten an enChIP Analysen Targeting Telomeren und den Promotor der Interferon (IFN) regulatory factor-1 (IRF-1) -Gen. Als Beispiele für typische Ergebnisse, Tabelle 1 sind die Proteine ​​mit der IRF-1-Promotors in einer IFN-spezifischen Weise durch enChIP-SILAC Tabelle identifiziert zugeordnet 2 listet die Telomer-bindenden Proteinen durch enChIP kombiniert mit Massenspektrometrie identifiziert (enChIP-MS) und Tabelle 3 zeigt die RNAs mit Telomeren enChIP-RNA-Seq identifiziert verbunden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Übersicht über enChIP. enChIP Verwendung CRISPR (A, B) und Elemente (C, D, E Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Reihenfolge der gBlock. Die U6-Promotor (in schwarz), die G-Nukleotid-bevor die Führungssequenz (in blau), die Führungssequenz (gRNA Spacer) (in rot), das Gerüst-Sequenz (in grün) und die Terminator-Sequenz (in orange) angezeigt.

Figur 3
Abbildung 3. Die Renditen von repräsentativen enChIP Analysen. (A) Prozentuale Eingänge für das Soll-IRF-1-Locus und dem Nicht-Ziel Sox2 Locus. (B) Prozentsatz Eingänge für die Ziel Telomere und Nichtziel-γ-Satelliten. Die Zahlen wurden angepasst und aus früheren Veröffentlichungen 15,16 modifiziert.

Kategorien Proteine
Transkription DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo Homolog, PURβ,
aktiviert RNA Polymerase II Transkriptionsaktivator p15,
BTF3, Myb-bindendeProtein 1A
Histondeacetylierung,
Corepressor Komponenten 		RBBP4, PA2G4, TBL3
Acetyltransferase Protein-Arginin-N-Methyltransferase 1
DNA-Topoisomerase DNA-Topoisomerase 2α
Histone Histone H2A.Z, Histon H3.2

Tabelle 1:. Beispiele für Proteine, die mit dem menschlichen IRF-1-Promotor-Region in einem IFN-spezifischen Weise durch enChIP-SILAC identifizierten zugehörigen Die Tabelle ist aus einer früheren Veröffentlichung 16 angepasst.

Kategorien Proteine
Säugetier Telomer-bindenden Proteinen PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1
Telomer-binden Proteine ​​in Hefe
oder anderen Organismen 		IMAP4
Proteine ​​interagieren mit Telomer-Binde
Proteinen assoziiert [Telomer-bindenden Protein] 		DNA-Polymerase α (POLA1) [Cdc13p],
ARMC6 [TRF2], CtBP1 [FoxP2-POT1],
Exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1],
Exportin-1 [TERT], 14-3-3 [TERT]
Proteine ​​zu lokalisieren, um Heterochromatin BEND3
Proteine ​​regulieren epigenetische Markierungen KDM5C
Proteine, deren Mutationen betreffen Telomerfunktion DNA-Polymerase α (POLA1), HAT1, Nup133,
CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY,
Glutamat-Cystein-Ligase Glutaredoxin SMRC1

Tabelle 2:. Beispiele für Proteine ​​mit Maus Telomeren enChIP-MS identifiziert, assoziiert Tabelle bereits adapted aus einer früheren Veröffentlichung 15.

Kategorien RNAs
Telomerase-Komponenten Terc, rMRP
Telomer-RNAs Terras
scaRNAs Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2
H / ACA snoRNAs Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a
C / D snoRNAs Snord17, Snord15a, Snord118
lncRNA Neat1

Tabelle 3: Beispiele für RNAs mit der Maus Telomere durch enChIP-RNA-Seq Die Tabelle hat sich von einer früheren Veröffentlichung 17 angepasst wurden identifiziert verbunden..

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Takeda Science Foundation (TF) unterstützt; die Asahi Glass Foundation; die Uehara Memorial Foundation (HF); die Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (TF und HF); Grant-in-Aid für junge Wissenschaftler (B) (# 25830131), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (# 15K06895) (TF); und eine Grant-in-Aid for Scientific Research für innovative Bereiche 'Transcription Zyklus' (# 25118512 & # 15H01354), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid for Exploratory Research ( # 26650059) und "Genome Support '(# 221S0002) (HF) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie in Japan.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gBlock synthesis service Life Technologies Gene Synthesis by GeneArt
gBlock synthesis service IDT (Integrated DNA Technologies) gBlocks Gene Fragments
pSIR-neo Addgene 51128
pSIR-GFP Addgene 51134
pSIR-DsRed-Express2 Addgene 51135
pSIR-hCD2 Addgene 51143
TAL synthesis service Life Technologies GeneArt Precision TALs
3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 Addgene 47948
3×FLAG-dCas9/pMXs-puro Addgene 51240
3×FLAG-dCas9/pMXs-IG Addgene 51258
3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 Addgene 51259
3×FLAG-dCas9/pMXs-neo Addgene 51260
anti-FLAG M2 Ab Sigma-Aldrich F1804
FITC-conjugated anti-FLAG M2 Sigma-Aldrich F4049
DMEM medium for SILAC Life Technologies 89985 Other medium can be purchased from Life Technologies
Dialyzed FBS for SILAC Life Technologies 89986
L-Lysine-2HCl for SILAC Life Technologies 89987 For Light medium
L-Arginine-HCl for SILAC Life Technologies 89989 For Light medium
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC Life Technologies 89988 For Heavy medium
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC Life Technologies 89990 For Heavy medium
Complete, mini, EDTA-free Roche Diagnostics 4693159
Ultrasonic Disruptor UD-201 Tomy Seiko
ChIP DNA Clean & Concentrator Zymo Research D5205
Dynabeads-Protein G Life Technologies DB10004
RNasin Plus RNase Inhibitor Promega N2611
Isogen II Nippon Gene 311-07361
Direct-zol RNA Miniprep kit Zymo Research R2050
LTQ Orbitrap Velos Thermo Fisher Scientific A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
nanoLC Advance, Michrom Bioresources A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis
HTC-PAL autosampler CTC Analytics A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis

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References

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Molecular Biology Ausgabe 107 Chip Chromatin-Immunopräzipitation locusspezifischen Chip enChIP entwickelt DNA-Bindungsmolekül-vermittelte-Chip Chromatin Epigenetik Genomfunktion
Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP
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Fujita, T., Fujii, H. Isolation of… More

Fujita, T., Fujii, H. Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP. J. Vis. Exp. (107), e53478, doi:10.3791/53478 (2016).

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