Introduction
Identifiseringen av molekyler assosiert med spesifikke genomiske regioner av interesse er nødvendig for å forstå mekanismene for regulering av genomiske funksjoner som transkripsjon og epigenetisk regulering. Selv om flere metoder er blitt utviklet for biokjemisk analyse av bestemte genomiske regioner 1-7, er de ikke brukes mye på dette trinn på grunn av deres iboende problemer som begrenset anvendelse (for eksempel bare for høyt kopiantall loci eller loci med gjentakelser) og for mye tid og innsats som kreves.
For å utføre biokjemiske analyse av bestemte genomiske regioner enkelt, har vi utviklet to locus spesifikke kromatin immunoutfellingsstudier (chip) teknologier, nemlig insertional ChIP (iChIP) 8-13 og utviklet DNA-bindende molekyl-mediert ChIP (enChIP) 14-17 . I iChIP, er en locus av interesse tagget ved å sette inn gjenkjennelsessekvenser av en eksogen DNA-bindende protein som LexA. locus isoleres deretter ved affinitetsrensing ved hjelp av den kodede DNA-bindende protein. I enChIP, konstruerte DNA-bindende molekyler, slik som sink-finger-proteiner, transkripsjon aktivator-lignende (TAL) proteiner, og gruppert regelmessig avbrutt av korte palindromiske gjentas (CRISPR) komplekser, blir brukt til å merke et locus av interesse (figur 1). Deretter blir det genomiske regionen isolert ved affinitetsrensing av de merkede DNA-bindende molekyler.
En av fordelene med enChIP enn iChIP er at innsetting av gjenkjennelsessekvenser av en eksogen DNA-bindende protein er ikke nødvendig. Målretting av loci hjelp CRISPR komplekser bestående av et katalytisk inaktiv form av Cas9 (dCas9) og en guide RNA (gRNA) er mye enklere enn målretting av disse regionene etter iChIP eller enChIP bruker TAL og sink-finger proteiner. Her beskriver vi en trinn-for-trinn-protokoll for enChIP kombinert med massespektrometri og RNA-sekvensering (RNA-Seq) for å identifisere locus-knytted proteiner og RNA, henholdsvis.
Protocol
1. Design av konstruerte DNA-bindende Molekyler Erkjenner Target Locus
- For enChIP bruker CRISPR komplekser, bruker CRISPRdirect web-verktøy (http://crispr.dbcls.jp) for å identifisere kandidat gRNA målsekvenser i genomisk regionen av interesse beskrevet som tidligere 18. Dette webverktøyet returnerer 23 bp genomiske områder av form 5'-N 20 NGG-3 'innenfor målområdet.
- Syntetisere en gBlock inkludert U6 promotorsekvens og sekvensen av 5'-N 20 i 5'-N 20 NGG-3 'ved hjelp av kommersielle tjenester (se figur 2) 19,20. For subkloning formål, ta riktige restriksjonsenzymseter utenfor gBlock.
- Sett gBlock inn i en passende vektor som tidligere beskrevet 16. Flere retrovirale vektorer for gBlocks er tilgjengelige (se Materials).
- For enChIP bruker TAL proteiner, designe TAL proteiner som gjenkjenner Target loci. Generere plasmider som koder TAL proteiner ved hjelp av kommersielle tjenester. Generere ekspresjonsvektorene inneholder TAL proteiner smeltet sammen med en eller flere koder som 3 × FLAG som tidligere beskrevet 15.
2. Etablering av celler for enChIP Analysis
- Uttrykk 3 x FLAG-dCas9 og gRNA (CRISPR basert prosedyre) eller 3 x FLAG-TAL (TAL proteinbasert prosedyre) i cellene som skal bli analysert slik som beskrevet tidligere 14-17.
- Bruk transient transfeksjon dersom transfeksjonseffektiviteten er høy. En ekspresjonsvektor inneholdende 3 x FLAG-dCas9 og CMV-promoteren er tilgjengelig (se Materials).
- Vurdere å etablere stabile transformanter ved hjelp av konvensjonelle metoder hvis transient transfeksjon effektiviteten er lav. I tillegg til de nevnte retrovirale vektorer for gBlock, retrovirale vektorer av 3 x FLAG-dCas9 er tilgjengelige (se Materials).
- Bekrefte ekspresjon av gRNA ved standard RT-PCR-teknikken.
- For kvantitativ identifikasjon av proteiner som vekselvirker med den genomiske regionen av interesse, vurdere bruk av en stabil isotop merking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) analyse kombinert med enChIP (enChIP-SILAC).
Note: Media for SILAC analyse kan kjøpes fra kommersielle leverandører. SILAC er kraftig i å oppdage spesifikke interaksjoner.- Kultur cellene i SILAC tung medium. Forbered celler Culturødt lys i SILAC medium som en negativ kontroll. Bruk minst 5 × 10 7 celler for hver SILAC medium (tung eller lett). For effektiv merking, legge både L-lysin-2HCl, 13 C 6 og L-Arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Heavy media. Merk: Minst fem celledelinger er nødvendig å etikett proteiner.
- For eksempel, kultur human fibrosarkom HT1080-celler som stabilt uttrykker 3xFLAG-dCas9 og et gRNA ved 37 ° C og 5% CO2 i DMEM medier for SILAC og dialysert føtalt bovint serum med Lysin-2HCl pluss L-arginin-HCl (Light medium) eller 13 C 6 L-lysin-2HCl pluss 13 C 6 15 N 4 L-Arginine-HCl (Heavy medium) (se Materials) 16. Tilsett 50 mg av lett eller tung L-lysin-2HCl og L-arginin-HCl i 500 ml medium.
- Trypsineres og replate celler før de blir sammenflytende slik at cellene opprettholde eksponentiell growth.
- Kultur cellene i SILAC tung medium. Forbered celler Culturødt lys i SILAC medium som en negativ kontroll. Bruk minst 5 × 10 7 celler for hver SILAC medium (tung eller lett). For effektiv merking, legge både L-lysin-2HCl, 13 C 6 og L-Arginine-HCl, 13 C 6, 15 N 4 i SILAC Heavy media. Merk: Minst fem celledelinger er nødvendig å etikett proteiner.
Merk: Uttrykk av disse merkede proteiner kan også bekreftes ved intracellulær farging med anti-FLAG-FITC og en påfølgende FACS analyse. En protokoll for intracellulær flekker kan lastes ned fra vår hjemmeside (http://www.biken.osaka-u.ac.jp/lab/microimm/fujii/iChIP_protocols/english.html).
3. Tverrbinding av celler med formaldehyd
- For celler i suspensjonskultur, overføre 2 x 10 7 celler som uttrykker 3xFLAG-TAL proteiner eller 3xFLAG-dCas9 pluss gRNA og suspendere i 30 ml vanlig kulturmedium i et 50 ml sentrifugerør. Når flere celler anvendes, økning i volum og mengder av reagenser proporsjonalt. For SILAC eksperimenter, bland cellene dyrket i tunge medium eller lys medium (5 x 10 7 celler hver) og dele den totale av 1 x 10 8 celler inn i 5 rør som inneholder 2 x 10 7 celler.
- Legg 810 ul av 37% formaldehyd i 30 ml av cellesuspensjonen (sluttkonsentrasjon 1%) og inkuberes ved 37 ° C i 5 min. For adherente celler, direkte feste celler i kulturskåler ved å tilsette 810 ul av 37% formaldehyd i 30 ml kulturmedium.
- Stoppe den tverrbindingen ved å tilsette 3,1 ml av 1,25 M glycin-oppløsning (sluttkonsentrasjon 127 mM) ogInkuber ved RT i 10 min.
- Samle celler ved sentrifugering (300 x g i 5 min ved 4 ° C). Forkaste nøye supernatanten inkludert formaldehyd og lagre den i en passende avfallsflasken.
- For adherente celler, løsner celler med en celleskrape og høsting i et 50 ml rør, og samle cellene som beskrevet i dette trinn.
- For SILAC eksperimenter, blande de frigjorte celler dyrket i tungt medium eller lett medium (5 x 10 7 celle hver), dele den totale på 1 x 10 8 celler i 5 rør inneholdende 2 x 10 7 celler, og samle cellene som er beskrevet i denne skritt.
- Vask cellepelleten med 30 ml PBS to ganger per rør. Forkaste nøye supernatanten inkludert formaldehyd og lagre den i riktig beholder bottle.Handle formaldehyd avfall i henhold til kjemikaliesikkerhetsretningslinjer. De fikserte celler kan fryses og lagres ved -80 ° C.
4. Utarbeidelse av Chromatin (per 2 x 107 celler)
- Suspendere de faste cellene i 10 ml av cellelyseringsbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5% IGEPAL CA-630, og 1 x proteasehemmere) og inkuber på is i 10 min.
- Sentrifuger prøven (830 x g ved 4 ° C i 8 min) og kaste supernatanten forsiktig.
- Suspendere pelleten i 10 ml atom lysisbuffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksykolat, 0,5% lauroyl-sarcosin, og 1 x proteasehemmere). Inkuber på is i 10 min, og vortex hver 2-3 min.
- Sentrifuger prøven (830 × g ved 4 ° C i 8 min) og kaste supernatanten forsiktig.
- Vask pelleten i 10 ml PBS. Pelleten (kromatin fraksjon) kan lagres ved -80 ° C etter å ha umiddelbar frysing i flytende nitrogen.
5. Sonikering av Chromatin (per 2 x 10 7 celler)
- Heng kromatin fraksjonen i 800 ulmodifisert lysis buffer 3 (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, og 1 x proteasehemmere) og overfør til et 1,5 ml rør.
- Sonikere kromatin bruker en sonicator (se Materials) og følgende betingelser: utgang: 3; duty: 100% (kontinuerlig); og tid: gratis. Utføre 10-18 sykluser med sonikering i 10 sekunder og avkjøling på is i 20 sekunder. For å unngå overoppheting, inkuber prøvene på is i 2 min hver 5-6 sykluser. For å unngå skumdannelse, å holde posisjonen til spissen av ultralydsonden 0,5 cm over bunnen av røret.
- Sentrifuger prøven ved (16 000 x g ved 4 ° C i 10 minutter), og supernatanten overføres til et 1,5 ml rør. Den ultralydbehandlet kromatin kan oppbevares ved -80 ° C etter å ha umiddelbar frysing i flytende nitrogen.
6. Evaluering av Chromatin Fragmentering
- Bland 10 ul av den fragmenterte kromatin med 85 mL av destillert vann.
- Tilsett 4 plav 5 M NaCl og inkuberes ved 65 ° CO / N.
- Tilsett 1 pl 10 mg / ml RNase A og inkuber ved 37 ° C i 45 min.
- Tilsett 2 pl 0,5 M EDTA (pH 8,0), 4 ul av 1 M Tris (pH 6,8), og 1 ul av 20 mg / ml proteinase K, og deretter inkuberes ved 45 ° C i 1,5 timer.
- Separate 10 ul av prøven ved elektroforese i en 1% agarose-gel som ikke inneholder flekker fargestoffer som SYBR Green.
- Flekker på gelen for å vurdere fordelingen av lengdene av den fragmenterte kromatin. Forhold som genererer en gjennomsnittlig lengde på 0,5-2 kbp (spekter av 0,2-4 kbp) anbefales.
- Rense DNA fra de gjenværende prøvene ved fenol-kloroform-ekstraksjon eller ved å bruke en DNA-ekstraksjon kit (se Materials). Det rensede DNA kan brukes som input DNA for å beregne utbyttet av enChIP analyser (se 8.11).
7. Utarbeidelse av Dynabeads Konjugert med Antistoffer (per 2 x 10 7 celler)
- Prepare to 1,5 ml rør, en for pre-Rydding med vanlig mus IgG og den andre for inkubasjon med anti-FLAG Ab. Tilsett 150 ul av Protein G-konjugerte magnetiske kuler (se Materials) til hvert rør.
- Plasser rørene på en magnet stå og vente i 3 min. Kast supernatanten ved pipettering.
- Suspendere kulene i 1 ml PBS inneholdende 0,01% Tween-20 (PBS-T). Plasser rørene på en magnetisk stativ og vente på 2 min. Kast supernatanten ved pipettering, og deretter gjenta trinn.
- Suspendere perler i 1 ml PBS-T inneholder 0,1% BSA.
- Tilsett 15 mikrogram av normal mus IgG eller anti-FLAG Ab og rotere ved 4 ° CO / N.
- Spinne ned kort, deretter plassere rørene på en magnet stå og vente i 3 min. Kast supernatanten ved pipettering.
- Suspendere perler i 1 ml PBS-T. Vend prøven flere ganger og spinne ned kort. Plasser rørene på en magnet stå og vente i 3 minutter, deretter kast supernatanten ved pipettering. Gjenta vasketo ganger med PBS-T (totalt tre vasketrinn).
8. Chromatin Immunutfelling (per 2 x 10 7 celler)
- Bland den fragmenterte kromatin fremstilt i 5,3) (ca. 800 ul) med en femtedel av volumet (ca. 200 ul) av modifisert lysisbuffer 3 inneholdende 5% Triton X-100 (sluttkonsentrasjon på 1% Triton X-100).
- Tilsett kromatin løsningen til røret i hvilken Protein G-konjugerte magnetiske kuler konjugert med normal muse-IgG ble fremstilt. Rotere ved 4 ° C i 1 time.
- Plasser røret på en magnet stå og vente på 3 min.
- Overfør supernatanten inn i røret hvor Protein G-konjugerte magnetiske kuler konjugert med anti-FLAG Ab ble forberedt. Rotere ved 4 ° CO / N.
- Plasser røret på en magnet stå og vente på 3 min. Kast supernatanten ved pipettering.
- Suspendere kulene i 1 ml av lav saltbuffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, og 1 x proteasehemmere) og rotere ved 4 ° C i 5 min. Plasser røret på en magnet stå og vente på 3 min. Kast supernatanten ved pipettering og gjenta vasketrinnet.
- Vask kulene med høy saltbuffer (20 mM Tris (pH 8,0), 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, og 1 x proteasehemmere) to ganger.
- Vask kulene med LiCl-buffer (10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 250 mM LiCl, 0,5% IGEPAL CA-630, 0,5% natriumdeoksykolat, og 1 x proteasehemmere) to ganger.
- Vask kulene med TBS-IGEPAL CA-630 (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, og 1 x proteasehemmere) en gang.
- Suspendere kulene i 200 ul elueringsbuffer (50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 0,1% IGEPAL CA-630, 1 x proteasehemmere, og 500 ug / ml 3 x FLAG-peptid) og inkuber ved 37 ° C i 20 min. Plasser røret på en magnet stå og vente på 3 min. Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør og gjenta Elution trinn.
- Rense DNA fra liten del (for eksempel 5%) av eluatet ved fenol-kloroform-ekstraksjon eller ved å bruke en DNA-ekstraksjon kit (se Materials). Det rensede DNA kan brukes til PCR med spesifikke primer sett for å beregne utbyttet av enChIP analyser ved å sammenligne med inngangs DNA fremstilt i trinn 6.7, som beskrevet tidligere 14,16.
9. SDS-PAGE, Farging, og Massespektrometrisk analyse
- Bland eluatet (400 ul) med 1 ml 2-propanol, 50 ul 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 5 ul av 20 mg / ml glykogen. Utfelling av kromatin ved -20 ° CO / N.
- Sentrifuger prøven (16 000 x g ved 4 ° C i 30 minutter), og supernatanten kastes. Skyll pellet med 1 ml 70% etanol og sentrifuger på nytt (16 000 x g ved 4 ° C i 10 min). Kast supernatanten helt ved pipettering.
- Suspendere pelleten i 40 ul av 2x prøvebuffer (125 mM Tris (pH 6,8), 10% 2-mercaptoethanol, 4% SDS, 10% sukrose, og 0,004% bromfenolblått). Vortex i 5 minutter for å oppløse pelleten fullstendig, og deretter inkuberes ved 100 ° C i 30 minutter for å denaturere proteiner og reversere tverrbindingen.
- For SDS-PAGE, drevet 40 ul av prøven på gelen inntil fargestoffet når 1 cm under brønnen. Merk: Vi bruker vanligvis 4-20% stigning gels, men andre% gels kan brukes.
- Flekk gelen med Coomassie Brilliant Blue eller sølvfarge.
- Skjær gel inn i fem stykker (2 mm høyde).
- Utføre i gel fordøyelse og massespektrometrisk analyse som tidligere beskrevet 13-16.
- For SILAC eksperimenter med 5 x 10 7 celler som hver (totalt 1 x 10 8 celler), suspen pellet fra de første fem rør i 40 ul av 2x prøvebuffer (det er ikke nødvendig å skalere opp).
10. Rensing av RNA og RNA-Seq Analysis
- Å rense RNA etter enChIP, tilsett 5 U / ml RNase Inhibitor (see Materials) til alle bufferoppløsninger, bortsett modifisert lysisbuffer 3 og elueringsbufferen, hvortil legge til 40 U / ml RNase inhibitor.
- Bland eluatet (400 ul) med 16 ul av 5 M NaCl og inkuberes ved 65 ° C i 2 timer.
- Tilsett 1 ml av syre-guanidinium-fenol-basert reagens (se Materials) til prøven. Vortex i 15 sekunder, og deretter inkubert ved romtemperatur i 5-15 min. Sentrifuger prøven i 15 minutter ved 12 000 x g og RT.
- Overfør supernatanten til et nytt 1,5 ml rør og tilsett 5 mL av p-bromanisol. Vortex i 15 sekunder, og deretter inkubert ved RT i 3-5 min. Sentrifuger prøven i 10 minutter ved 12 000 x g og RT.
- Overfør supernatanten (ca. 1 ml) inn i en ny 2 ml rør og tilsett 1 ml 2-propanol. Snu røret og inkuber ved romtemperatur i 10 min. Installering av blandingen på en kolonne i en RNA-rensesett (se Materials). Sentrifuger kolonnen i 1 minutt ved 12.000 x g og RT.
- Vaskekolonnen med 400 mL av RNA Wash Buffer i en RNA-rensing kit (se Materials).
- Legg 80 mL av DNase I cocktail (blanding av 5 ul av DNase I (1 U / pl), 8 ul 10 x DNase I reaksjonsbuffer, 3 ul av DNase / RNase-fritt vann, og 64 pl av RNA-vaskebuffer i et RNA rensesett (se Materials)) på kolonnen. Inkuber prøven ved 37 ° C i 15 minutter og så sentrifugeres i 30 sekunder ved 12.000 x g og RT.
- Vask kolonnen med 400 mL av RNA forvask buffer i et RNA-rensing kit (se Materials) to ganger.
- Eluer RNA med 50 ul av DNase / RNase-fritt vann. Det eluerte RNA kan brukes for RNA-sekvensering.
Representative Results
Generelt kan 1-30% av genomiske mål-regioner bli renset ved hjelp av enChIP. Figur 3 omfatter representative data som viser utbyttene av enChIP analyser rettet telomerer og promoteren til interferon (IFN) regulerende faktor-1 (IRF-1) genet. Som eksempler på typiske resultater, Tabell 1 viser proteiner forbundet med IRF-1-promoteren i en IFNy-spesifikk måte identifiseres ved enChIP-SILAC, Tabell 2 viser de telomere-bindende proteiner identifisert ved enChIP kombinert med massespektrometri (enChIP-MS) og Tabell 3 viser de RNA forbundet med telomerer identifisert av enChIP-RNA-Seq.
Figur 1. Oversikt over enChIP. enChIP bruker CRISPR (A, B) og TAL (C, D, E Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Sekvens av gBlock. Den U6 promoter (i svart), G nucleotide before guiden sekvens (i blått), guide sekvensen (gRNA spacer) (i rødt), stillaset sekvens (i grønt), og terminatorsekvens (i oransje) er vist.
Figur 3. Rentene av representant enChIP analyser. (A) Prosent innganger for mål-IRF-1-locus og ikke-target-Sox2 locus. (B) Prosent innganger for målet telomerer og utenfor målgruppen y-satellitter. Tallene er tilpasset og endret fra tidligere publikasjoner 15,16.
| Kategorier | Proteiner |
| Transkripsjon | DDX1, PARP1, CKAP4, Pescadillo homolog, PURβ, aktivert RNA polymerase II transkripsjonen aktivator p15, BTF3, Myb-bindingprotein 1A |
| Histone deacetylering corepressor komponenter | RBBP4, PA2G4, TBL3 |
| Acetyltransferase | Protein arginin N-metyltransferase 1 |
| DNA topoisomerase | DNA topoisomerase 2α |
| Histoner | Histone H2A.Z, histon H3.2 |
Tabell 1.: Eksempler på proteiner forbundet med det humane IRF-1-promoter-regionen i et IFNy-spesifikk måte identifiseres ved enChIP-SILAC Bordet har blitt tilpasset fra en tidligere publikasjon 16.
| Kategorier | Proteiner |
| Pattedyr telomere bindende proteiner | PML, RPA, CDK1, PARP1, PCBP1 |
| Telomer-binding proteiner i gjær eller andre organismer | IMP4 |
| Proteiner i samspill med telomer-binding proteiner [assosiert telomer-bindende protein] | DNA polymerase α (POLA1) [Cdc13p] ARMC6 [TRF2], CTBP1 [FoxP2-POT1] exportin-5 [TERT], GNL3L [TRF1] exportin-en [TERT], 14-3-3 [TERT] |
| Proteiner lokaliser å heterochromatin | BEND3 |
| Proteiner regulere epigenetiske merker | KDM5C |
| Proteiner som mutasjoner påvirker telomere funksjon | DNA polymerase α (POLA1), HAT1, Nup133, CDK7, DPOE1, PRDX1, TYSY, glutamat-cystein ligase, glutaredoxin, SMRC1 |
Tabell 2.: Eksempler på proteiner forbundet med mus telomerer identifisert ved enChIP-MS Bordet har vært ADAPTEd fra en tidligere publikasjon 15.
| Kategorier | RNA |
| Telomerase komponenter | TERC, Rmrp |
| Telomeric RNA | Terras |
| scaRNAs | Scarna6, Scarna10, Scarna13, Scarna2 |
| H / ACA snoRNAs | Snora23, Snora74a, Snora73b, Snora73a |
| C / D snoRNAs | Snord17, Snord15a, Snord118 |
| lncRNA | Neat1 |
Tabell 3: Eksempler på RNA forbundet med muse telomerer identifisert av enChIP-RNA-Seq Tabellen har blitt tilpasset fra en tidligere publikasjon 17..
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Takeda Science Foundation (TF); Asahi Glass Foundation; den Uehara Memorial Foundation (HF); den Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation (TF og HF); Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (# 25830131), Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (# 15K06895) (TF); og en Grant-in-Aid for Scientific Research på innovative områder 'transkripsjon Cycle' (# 25118512 & # 15H01354), Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (# 15H04329), Grant-in-Aid for Utforskforskning ( # 26650059) og "Genome Support '(# 221S0002) (HF) fra departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gBlock synthesis service | Life Technologies | Gene Synthesis by GeneArt | |
| gBlock synthesis service | IDT (Integrated DNA Technologies) | gBlocks Gene Fragments | |
| pSIR-neo | Addgene | 51128 | |
| pSIR-GFP | Addgene | 51134 | |
| pSIR-DsRed-Express2 | Addgene | 51135 | |
| pSIR-hCD2 | Addgene | 51143 | |
| TAL synthesis service | Life Technologies | GeneArt Precision TALs | |
| 3xFLAG-dCas9/pCMV-7.1 | Addgene | 47948 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-puro | Addgene | 51240 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-IG | Addgene | 51258 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-I2 | Addgene | 51259 | |
| 3×FLAG-dCas9/pMXs-neo | Addgene | 51260 | |
| anti-FLAG M2 Ab | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| FITC-conjugated anti-FLAG M2 | Sigma-Aldrich | F4049 | |
| DMEM medium for SILAC | Life Technologies | 89985 | Other medium can be purchased from Life Technologies |
| Dialyzed FBS for SILAC | Life Technologies | 89986 | |
| L-Lysine-2HCl for SILAC | Life Technologies | 89987 | For Light medium |
| L-Arginine-HCl for SILAC | Life Technologies | 89989 | For Light medium |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Life Technologies | 89988 | For Heavy medium |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Life Technologies | 89990 | For Heavy medium |
| Complete, mini, EDTA-free | Roche Diagnostics | 4693159 | |
| Ultrasonic Disruptor UD-201 | Tomy Seiko | ||
| ChIP DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D5205 | |
| Dynabeads-Protein G | Life Technologies | DB10004 | |
| RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | |
| Isogen II | Nippon Gene | 311-07361 | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | |
| LTQ Orbitrap Velos | Thermo Fisher Scientific | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| nanoLC | Advance, Michrom Bioresources | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis | |
| HTC-PAL autosampler | CTC Analytics | A component of a nanoLC-MS/MS system for MS analysis |
References
- Zhang, X. Y., Horz, W. Analysis of highly purified satellite DNA containing chromatin from the mouse. Nucleic Acids Res. 10, 1481-1494 (1982).
- Workman, J. L., Langmore, J. P. Nucleoprotein hybridization: a method for isolating specific genes as high molecular weight chromatin. Biochemstry. 24, 7486-7497 (1985).
- Boffa, L. C., Carpaneto, E. M., Allfrey, V. G. Isolation of active genes containing CAG repeats by DNA strand invasion by a peptide nucleic acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 1901-1905 (1995).
- Jaskinskas, A., Hamkalo, B. A. Purification and initial characterization of primate satellite chromatin. Chromosome Res. 7, 341-354 (1999).
- Griesenbeck, J., Boeger, H., Strattan, J. S., Kornberg, R. D. Affinity purification of specific chromatin segments from chromosomal loci in yeast. Mol. Cell Biol. 23, 9275-9282 (2003).
- Ghirlando, R., Felsenfeld, G. Hydrodynamic studies on defined heterochromatin fragments support a 30-µm fiber having six nucleosomes per turn. J. Mol. Biol. 376, 1417-1425 (2008).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136, 175-186 (2009).
- Hoshino, A., Fujii, H. Insertional chromatin immunoprecipitation: a method for isolating specific genomic regions. J. Biosci. Bioeng. 108, 446-449 (2009).
- Fujita, T., Fujii, H. Direct idenification of insulator components by insertional chromatin immunoprecipitation. PLoS One. 6, e26109 (2011).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions by insertional chromatin immunoprecipitation (iChIP) with a second-generation tagged LexA DNA-binding domain. Adv. Biosci. Biotechnol. 3, 626-629 (2012).
- Fujita, T., Fujii, H. Locus-specific biochemical epigenetics / chromatin biochemistry by insertional chromatin immunoprecipitation. ISRN Biochem. 2013, 913273 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions retaining molecular interactions by the iChIP system using recombinant exogenous DNA-binding proteins. BMC Mol. Biol. 15, 26 (2014).
- Fujita, T., Kitaura, F., Fujii, H. A critical role of the Thy28-MYH9 axis in B cell-specific expression of the Pax5 gene in chicken B cells. PLoS One. 10, (2015).
- Fujita, T., Fujii, H. Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated proteins by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR. Biochem. Biophys. Res. Commun. 439, 132-136 (2013).
- Fujita, T., et al. Identification of telomere-associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP). Sci. Rep. 3, 3171 (2013).
- Fujita, T., Fujii, H. Identification of proteins associated with an IFNγ-responsive promoter by a retroviral expression system for enChIP using CRISPR. PLoS One. 9, e103084 (2014).
- Fujita, T., Yuno, M., Okuzaki, D., Ohki, R., Fujii, H. Identification of non-coding RNAs associated with telomeres using a combination of enChIP and RNA sequencing. PLoS One. 10, e0123387 (2015).
- Naito, Y., Hino, K., Bono, H., Ui-Tei, K. CRISPRdirect: software for designing CRISPR/Cas guide RNA with reduced off-target sites. Bioinformatics. , (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Esvelt, K. M., et al. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing. Nat. Methods. 10, 1116-1121 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152, 1173-1183 (2013).
- Wu, X., et al. Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 32, 670-676 (2014).
- Kuscu, C., Arslan, S., Singh, R., Thorpe, J., Adli, M. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease. Nat Biotechnol. 32, 677-683 (2014).
- Cencic, R., et al. Protospacer adjacent motif (PAM)-distal sequences engage CRISPR Cas9 DNA target cleavage. PLoS One. 9, 109213 (2014).
- O'Green, H., Henry, I. M., Bhakta, M. S., Meckler, J. F., Segal, D. J. A genome-wide analysis of Cas9 binding specificity using ChIP-seq and targeted sequence capture. Nucleic Acids Res. 43, 3389-3404 (2015).
- de Lange, T. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev. 19, 2100-2110 (2005).
