Introduction
O sistema radicular é crucial para o crescimento da planta, uma vez que garante ancoragem e absorção de água e nutrientes do solo. Uma vez que a expansão de um sistema radicular baseia-se principalmente na produção de raízes laterais, a iniciação e formação têm sido amplamente estudados. Raízes laterais são iniciados em um subconjunto específico de células periciclo, chamados de células fundadoras 1. Na maior parte das dicotiledóneas, tais como Arabidopsis thaliana, estas células estão localizados nos pólos protoxilema 2, ao passo que em monocotiledóneas, como o milho, que são encontrados nos pólos 3 do floema. Fundador células são marcadas por um aumento da resposta auxina 4, seguido pela expressão de genes do ciclo celular específicas (por exemplo, a ciclina B1; 1 / CYCB1; 1), após o que eles passam por uma primeira rodada de divisões anticlinais assimétricas 5. Após uma série de divisões e anticlinal periclinal coordenados, um primórdio raiz lateral é formado, que finalmente irá emergir como um umraízes laterais utonomous. O local e hora do início de raízes laterais não são, porém previsível, uma vez que estes eventos não são nem abundante nem sincronizados. Esta situação impede o uso de abordagens moleculares, como transcriptomics para estudar este processo.
Para combater isso, um lateral Sistema Inducible Root (IRIs) foi desenvolvido 6, 7. Neste sistema, as mudas são tratados primeiro com N -1-naphthylphthalamic (NPA), que inibe o transporte de auxina e acumulação, consequentemente bloqueando iniciação de raízes laterais 8. Por posteriormente a repicagem em meio contendo auxina sintética ácido acético 1-naftaleno (NAA), toda a camada periciclo responde aos níveis elevados de auxina assim maciçamente raiz iniciar divisões celulares laterais indutores 6. Como tal, este sistema leva a rápidas, síncronas e extensas iniciações raízes laterais, permitindo fácil recolha de amostras de raízes enriquecido para um determinado estádio da tardedesenvolvimento radicular ral. Posteriormente, estas amostras podem ser utilizadas para determinar os perfis de expressão de todo o genoma durante a formação de raízes laterais. O IRIs rendeu conhecimento já significativo sobre a iniciação de lateral de raiz em Arabidopsis e milho 13/09, mas a necessidade de aplicar este sistema para outras espécies de plantas torna-se mais evidente à medida que mais genomas são sequenciados e há um crescente interesse de transferir conhecimento para importante econômica espécies.
Aqui, os protocolos detalhados de Arabidopsis e de milho são dadas LRISs. Em seguida, um exemplo do uso do sistema é fornecida, pelo que ilustra como os dados obtidos com o transcriptômica IRIs milho pode ser utilizado para identificar homólogos funcionais que têm uma função conservada durante a iniciação de raízes laterais em diferentes espécies de plantas. Finalmente, as orientações para optimizar a IRIs são propostos para outras espécies de plantas.
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Protocol
1. Arabidopsis IRIs Protocol
Nota: O texto refere-se a experiências "pequenas" ou "grandes" escala. Experimentos de pequena escala, como a análise de linha de marcação e coloração histológica 6, 14, exigem apenas algumas amostras. Experiências em larga escala, tais como em tempo real quantitativa qRT-PCR, as micro-matrizes de 9-11 ou de sequenciação de ARN, requerem uma maior quantidade de amostras. Como tal, uma quantidade de ~ 1000 mudas por amostra foi utilizada por Vanneste et al 11. Executar experiência microarray após dissecção segmento de raiz.
DIA 1
- A esterilização de sementes de Arabidopsis
Nota: Selecione um dos seguintes procedimentos de esterilização de sementes. Qualquer um deles é adequado para as próximas etapas do protocolo. Esterilização de gás (1.1.2) apresenta duas principais vantagens sobre a esterilização líquida (1.1.1): leva menos tempo ao manusear uma grande entorpecidoer de sementes, uma vez que não tem de ocorrer pipetagem para as amostras individuais; e as sementes esterilizadas podem ser armazenados por um período mais longo. No entanto, isso exige um exsicador e tratamento cuidadoso.- Esterilização líquido
- Despeje o número desejado de sementes em tubos de micro-centrífuga. Utilizar-se a 20 mg (~ 800 sementes) em um tubo de 1,5 ml ou de 40 mg (~ 1600 sementes) em tubos de 2 ml de micro-centrífuga.
- Adicionar 1 ml de etanol a 70%. Inverter ou agitar suavemente por 2 min.
- Substituir o etanol a 70% com 1 ml de solução de esterilização durante 15 min. (Preparar uma solução de solução de esterilização: 3,85 ml de hipoclorito de sódio (NaOCl) de ações (12%) (ATENÇÃO: Use exaustor), 5 ul Tween 20, até 10 ml com água Inverta os tubos várias vezes para se certificar de que todas as sementes vir. em contacto com a solução.
- Em uma câmara de fluxo laminar de ar, substituir a solução de esterilização com 1 ml de água destilada estéril e lavar as sementes 5 vezes durante 5 min por repetidasly substituindo com 1 ml de água estéril destilada fresca.
- Esterilização por gás
- Verter o número desejado de sementes num tubo de micro-centrifugadora de 2 ml. Use tubos individuais quando se trabalha com várias linhas independentes, e organizá-los em uma caixa aberta tubos micro-centrífuga de plástico ou titular. Se o número de sementes em um tubo superior a 500 (12,5 mg), subdividir as sementes do número apropriado de tubos para assegurar a esterilização bem sucedida. Certifique-se as tampas de tubos vizinhos não cobrem uns aos outros. Encaixar a tampa da caixa na parte inferior, uma vez que necessita de estar no exsicador, bem como para esterilização.
- Coloque a caixa na tigela de um secador, juntamente com um copo de vidro (ATENÇÃO: Use exaustor).
- Encha o copo com 100 ml de 12% NaOCl (ATENÇÃO: Use extractor de fumo). Colocar a tampa no exsicador, mas deixar uma pequena abertura, onde o copo é colocado.
- Adicionar 3 ml de ácido clorídrico a 37% (fumegante) (CAUÇÃO: Use exaustor) para o copo através da pequena abertura e rapidamente fechar o exsicador. A vontade bolha solução por algum tempo devido à formação Cl 2 -gas. Deixar o sistema fechado O / N (ou, pelo menos, 8 horas).
- Remover a tampa do exsicador. Retire a caixa e cobri-lo com a tampa para evitar a contaminação durante o transporte.
- Coloque a caixa em um armário de fluxo de ar laminar, retire a tampa e deixar as sementes para cerca de 1 hora à temperatura ambiente para permitir a libertação de gás.
Nota: As sementes podem ser armazenadas com segurança a seco em tubos de micro-centrifugação de fechadas durante até 2 semanas a 4 ° C.
- Esterilização líquido
- A indução de raízes laterais em Arabidopsis
- Lateral Root Inibição (Tratamento NPA)
- Prepare meio de crescimento para o crescimento in vitro. O meio contém metade da força Murashige e Skoog mistura de sal de 15, 0,1 g / l de mio-inositol, 10 g / L de sacarose, e é tamponado com 0,5g / L de 2- (N-morfolino) etanossulfónico (MES).
- Ajustar o pH para 5,7 com 1 M de KOH. Adiciona-se 8 g / L de agar de tecido da planta e do meio de autoclave durante 20 min a 121 ° C.
- Prepare uma solução estoque 25 mM de NPA em dimetilsulfóxido (DMSO) (ATENÇÃO: Usar luvas). Em uma câmara de fluxo laminar de ar, arrefecer o meio autoclavado para baixo para cerca de 65 ° C (que é a temperatura à qual a garrafa pode ser realizada à mão), e adicionar solução de estoque 25 NPA mM para obter uma concentração final de 10 uM NPA.
- Homogeneizar em cima disso agitando a garrafa por 10 s. Pour 50 ml de meio por prato de petri quadrado (12 cm x 12 cm).
Nota: Em caso de experimento em grande escala, aplique uma malha de nylon (20 mm) para garantir a fácil transferência. Prepara-se uma malha (9 cm x 9 cm) por tratamento em autoclave (Figura 1A). Quando autoclavado, aplicar a malha para o meio de crescimento estéril utilizando pinças (Figura 1B). Empurre a malha para o meio de crescimento usando um sterilized drigalsky para se certificar de que está em bom contato com o meio de crescimento (Figura 1B) (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis). - Semear as sementes nos NPA-placas.
Nota: No caso de um experimento em grande escala está prevista, semear 2 linhas densas e bem-alinhados de 50 sementes para facilitar a recolha de amostras (ver 1.2.2.3).- Em caso de esterilização líquido, semear as sementes no NPA placas usando uma pipeta de 200 mL. Cortar 3 - 4 mm da extremidade das pontas conta-gotas em condições estéreis (ou antes da esterilização das pontas), a fim de ser capaz de pipetar com as sementes. Pipeta cima e para baixo algumas vezes para voltar a suspender as sementes, em seguida, pipete água cerca de 150 mL estéril com 10 - 20 sementes e esperar até que o sedimento sementes na parte inferior da ponta. (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis)
Nota: Quando tocar o agar ou a malha suavemente com a ponta, uma gota de água com uma semente vai ser libertado a partir dele (Figura 1C). <li> Em caso de esterilização por gás, semear as sementes usando autoclavado toothpicks.Pinch o palito no agar antes de tomar as sementes para garantir uma superfície pegajosa. Escolher-se a sementes, um a um utilizando o palito e distribuir as sementes nas placas (Figura 1D). Como alternativa, adicione a água estéril para as sementes e semear como descrito em 1.2.1.5.1 (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis).
- Em caso de esterilização líquido, semear as sementes no NPA placas usando uma pipeta de 200 mL. Cortar 3 - 4 mm da extremidade das pontas conta-gotas em condições estéreis (ou antes da esterilização das pontas), a fim de ser capaz de pipetar com as sementes. Pipeta cima e para baixo algumas vezes para voltar a suspender as sementes, em seguida, pipete água cerca de 150 mL estéril com 10 - 20 sementes e esperar até que o sedimento sementes na parte inferior da ponta. (ATENÇÃO: O trabalho em condições estéreis)
- Selar as placas com fita adesiva respirável e armazená-los placas a 4 ° C no escuro durante pelo menos 2 dias e máximo de uma semana. Isso é necessário para estratificação e garante sincronizados e germinação mais eficiente.
Nota: Como alternativa, as sementes podem ser estratificada antes da semeadura, imersa em água destilada em micro-centrífuga de tubos, o que requer menos espaço frigorífico. Neste caso, os tubos para armazenar pelo menos uma semana a 4 ° C, e mover as placas para a câmara de crescimento imediatamente após a sementeira (ver 1.2.1.7).
DIA 3 Mover as placas para a câmara de crescimento (luz contínua (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) durante 5 dias (2 dias de germinação e 3 dias de crescimento) numa posição quase vertical (80 a 90 °) para assegurar o crescimento das raízes, e não na forma.
DIA 8
- Lateral Root Inibição (Tratamento NPA)
- Lateral Root indução (tratamento NAA)
- Prepara-se o mesmo meio de crescimento como descrito em 1.2.1.1 1.2.1.2 e. Prepare uma solução estoque de 50 mM NAA em DMSO (CUIDADO: Use luvas). Arrefece-se o meio autoclavado para baixo a 65 ° C e adicionar solução de NAA para a forma a obter uma concentração final de 10 uM de NAA (CUIDADO: O trabalho em condições estéreis).
- Homogeneizar em cima disso agitando a garrafa por 10 s. Pour 50 ml de meio por prato de petri quadrado (12 cm x 12 cm).
- Transferir as mudas das placas contendo o meio de crescimento suplementado com 10 ^ M para os ANP suptadas com 10 mM NAA.
- Gancho nos braços de uma pinça curvas sob os cotilédones de plântulas e gentilmente removê-lo da placa. Transferir apenas mudas de que as raízes têm crescido inteiramente em contacto com o meio de crescimento NPA-e, de preferência baixo.
- Skim a raiz sobre a superfície do meio de crescimento contendo NAA sobre uma pequena distância. Certifique-se que as raízes das plantas estão em bom contato com o meio de crescimento. Se necessário, pressione a raiz suavemente para a superfície de meio de crescimento com a pinça.
Nota: Em caso de uma experiência em larga escala, remover todas as plântulas que não estão em contacto com a malha e de transferência, levantando a malha nos dois cantos superiores com uma pinça. Certifique-se a malha está em bom contato com o meio contendo NAA por desnatação a malha sobre a superfície de ágar sobre uma pequena distância (Figura 1E).
- Selar as novas placas com fita respirável e colocá-los no armário de crescimento (conluz contínuo (110 μE m -2 s -1), 21 ° C) numa posição vertical durante o tempo desejado após a indução até à colheita.
Nota: Em caso de uma experiência em larga escala, usa um bisturi para cortar os segmentos de raiz de uma só vez directamente sobre a malha e prove-las por raspagem suave da superfície da malha.
- Prepara-se o mesmo meio de crescimento como descrito em 1.2.1.1 1.2.1.2 e. Prepare uma solução estoque de 50 mM NAA em DMSO (CUIDADO: Use luvas). Arrefece-se o meio autoclavado para baixo a 65 ° C e adicionar solução de NAA para a forma a obter uma concentração final de 10 uM de NAA (CUIDADO: O trabalho em condições estéreis).
2. IRIs Milho Protocol
- Estratificação de milho Grãos
- Incubar os grãos de milho a 4 ° C no escuro durante pelo menos 1 semana.
Nota: Este protocolo foi desenvolvido usando as linhas puras de milho B73.
- Incubar os grãos de milho a 4 ° C no escuro durante pelo menos 1 semana.
- Esterilização de milho Grãos
DIA 1
Nota: Embora plântulas de milho não tem que ser cultivadas em condições estéreis, é recomendado para esterilizar os grãos de milho e trabalhar com material estéril para evitar o crescimento de fungos no rolo de papelsistema.- Coloque o número necessário de grãos de milho em um copo de vidro esterilizado.
- Adicione 100 ml de solução de esterilização (6% NaOCl em água) (ATENÇÃO: Use exaustor).
- Adicionar uma barra de agitação magnética e colocar o copo num agitador magnético de agitação a baixa velocidade (aproximadamente 250 rpm) a temperatura ambiente durante 5 min.
- Lavar cinco vezes durante 5 min, substituindo a solução com 100 ml de água estéril fresco.
- Semeadura do milho Sementes
- Calçar luvas para reduzir o risco de contaminação e tomar um rolo de toalhas de papel.
- Rasgue dois trechos de papel toalha de mão com um comprimento total de duas folhas (aproximadamente 92 centímetros x 24 cm) e coloque-os em cima uns dos outros em uma superfície limpa (Figura 2A).
- Dobrar as folhas dobrar ao longo do comprimento (cerca de 92 cm x 12 cm) (Figura 2A).
- Use uma pinça para distribuir 10 núcleos em aproximadamente 2 cm da parte superior sobre tele todo o comprimento do papel, enquanto mantendo um espaço intermédio de 8 cm entre cada núcleo e 8 cm livre em ambas as extremidades (Figura 2B). Certifique-se a radícula do kernel está voltada para baixo e para o papel (Figura 2B).
- Rolo delicadamente o papel ao longo do comprimento, mantendo as sementes no lugar (Figura 2B). Para facilitar o rolamento, é opcional a primeira pulverizar o papel com água estéril.
- Coloque os rolos de papel em tubos de vidro esterilizados de cerca de 6 cm de diâmetro e 14 cm de altura (por exemplo, 250 ml tubos de centrífuga) e colocá-los em um rack (Figura 2C).
- A indução de raízes laterais em Maize
- Prepare uma solução a 50 mM estoque NPA (dissolvido em DMSO) (ATENÇÃO: Usar luvas).
- Para cada tubo, fazer uma solução 50 fiM NPA adicionando 125 ul da solução de estoque 50 mM de ANP a 125 ml de água estéril num recipiente de vidro esterilizado.
- Misture bem eColoque 125 ml de uma solução a 50 uM ANP sobre o rolo de papel no tubo. O rolo de papel irá absorver a solução e tornar-se completamente encharcado.
Nota: Ao usar rolos de papel e tubos com outras dimensões, ajustar o volume em conformidade. O líquido deve chegar na metade do tubo para garantir a absorção suficiente. - Coloque o sistema de rolo de papel em uma câmara de crescimento durante três dias (27 ° C, luz contínua, 70% de humidade relativa). Certifique-se de que os rolos de papel permanecer embebido através da adição de solução adicional NPA 50 uM, uma vez que a solução evapora-se ao longo do tempo (Figura 2D).
DIA 4 - Prepare uma solução a 50 mM NAA estoque (dissolvido em DMSO) (ATENÇÃO: Usar luvas).
- Para cada tubo, preparar uma solução de NAA 50 uM por adição de 125 ul de estoque a 50 mM a NAA 125 ml de água estéril num recipiente de vidro esterilizado.
- Aperte delicadamente a maior parte do NPA solução remanescente dos rolos de papel e colocar om em água estéril durante 5 min para lavá-lo para fora (CUIDADO: Use luvas). Espremer suavemente a maior parte da água a partir dos rolos de papel. Repita este passo de lavagem três vezes.
- Misture bem e despeje a solução NAA 50 mM ao longo dos rolos de papel nos tubos. Certifique-se de que eles estão completamente encharcado.
- Colocar o sistema de rolo de papel na câmara de crescimento (27 ° C, a luz contínua, 70% de humidade relativa) durante a duração desejada após a indução.
- A indução de raízes laterais em raízes adventícias coroa de milho
Nota: O IRIs como descrito acima induz raízes laterais na raiz principal. No entanto, em milho e outras monocotiledôneas, a raiz primária e as raízes seminais embrionárias, juntamente com as suas raízes laterais, são principalmente importante durante o desenvolvimento de mudas. Numa fase posterior no crescimento das plantas, as raízes adventícias pós-embrionárias surgir na haste e também desenvolver raízes laterais para formar um novo sistema radicular 16. O IRIs também pode ser usadod para induzir raízes laterais sobre essas raízes adventícias coroa pós-embrionárias, seguindo alguns pequenos ajustes para a IRIs na raiz primária embrionário.- Para fazer com que os rolos de papel, criar um sanduíche de papéis com, respectivamente, duas camadas de papel toalha de mão sobre o lado exterior, e duas camadas de papel de germinação dentro. Coloque os grãos esterilizados (ver passos 2.1 e 2.2), entre as duas folhas de papel de germinação. Papel de germinação, em comparação com papel toalha de mão, será menos propenso a ser penetrado por pêlos radiculares e das raízes laterais, o que fará a abertura da rolos de papel mais fácil depois. Por outro lado, as duas camadas exteriores de papel toalha de mão irá facilitar a absorção do líquido.
- Insira os rolos em 700 ml tubos de vidro e despeje água estéril sem NPA sobre eles. Certifique-se de que eles estão completamente encharcado.
- Germinar as sementes esterilizadas no gabinete do crescimento (ver passo 2.4.9).
- Crescer as mudas até as raízes adventícias coroacomeçam a surgir (6 dias para o B73). Certifique-se os rolos de papel são mantidos úmido em todos os momentos por adição de água estéril, quando necessário.
- Transferir para uma solução a 25 uM NPA durante 4 dias (ver passos 2.4.1 a 2.4.4), seguido por uma indução semelhante de iniciação de raízes laterais, substituindo a solução com uma solução NPA NAA 50 uM após uma etapa de lavagem (ver passo 2.4 0,5 a 2.4.9).
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Representative Results
Aplicação do IRIs executar comparativos transcriptómica do lateral Processo Root Iniciação
Uma aplicação da IRIs é a comparação e a correlação dos perfis de expressão de genes durante a formação de raízes laterais em espécies diferentes. Transcriptomics Comparativos aproxima criar a possibilidade de identificar genes ortólogos envolvidas no processo de desenvolvimento de raízes laterais em espécies diferentes. Iniciação de raízes laterais, que consiste na formação de um novo órgão de um subconjunto de células contidas em um eixo raiz já formada, é o mecanismo principal compartilhada por angiospermas para controlar a sua arquitectura raiz. Consequentemente, é muito provável que ele evoluiu de vias existentes presentes em um ancestral comum e foi conservado ao longo da evolução. Com efeito, os reguladores potenciais comuns de iniciação de raízes laterais foram encontradas em diferentes espécies <sup> 17, 18.
A amostragem de materiais usando o IRIs em Arabidopsis e milho, e análise de transcriptoma
O IRIs foi estabelecida em duas espécies diferentes:. Arabidopsis e de milho 10, 13 Em ambas as espécies, decidiu-se provar as plantas apenas antes do tratamento NAA, e logo após a indução, no início de ou durante a resposta de auxina, como bem como no aparecimento de, ou durante as primeiras divisões no periciclo. Além disso, a separação de células activadas por fluorescência 19 (SCAF) foi utilizada em Arabidopsis ou de captura laser Microscopia 20, 21 (LCM) no milho para seleccionar células periciclo. Na Arabidopsis, os pontos temporais de 2 e 6 horas após a indução foram escolhidos com base na caracterização da transcrição do pDR5 :: GUS e resposta auxina pCYCB1; 1 :: GUS linhas marcadoras 9 do ciclo celular (Figura 3). No milho, o tempo de pontos 2, 3 e 4 h após a indução, foram seleccionados após caracterização microscópica de actividade a divisão celular e a análise da expressão de vários genes marcadores do ciclo celular utilizando reversa em tempo real quantitativo reacção em cadeia da polimerase de transcrição (qRT-PCR) 13 . O ARN foi extraído a partir das células isoladas e hibridado em plataformas de microarray como anteriormente descrito 10, 13.
Encontrar o Ortólogo de Arabidopsis CYCB1; 1 (AtCYCB1; 1) em milho
Em Arabidopsis, a linha marcador pCYCB1; 1 :: GUS tem sido amplamente usado para rastrear as primeiras divisões do periciclo durante o início de raízes laterais. Tal marcador seria muitoútil no milho. Vários homólogos de AtCYCB1; 1 foram encontrados em milho (www.maizesequence.org, todos os peptídeos, BLASTP, as configurações padrão). Seis deles estavam presentes no microarray realizada após IRIs em milho e mostrou enriquecimento significativo. O melhor acerto do BLAST, GRMZM2G310115, mostraram níveis muito elevados de transcrição após IRIs, semelhante ao que foi observado em Arabidopsis para AtCYCB1; 1 (Figura 4).
Aplicação do IRIs a verificação individual da Expressão Gênica
Para validar GRMZM2G310115 como um bom candidato ortólogo de AtCYCB1; 1 na iniciação de raízes laterais milho, em tempo real qRT-PCR em amostras tomadas a diferentes pontos de tempo foi realizada durante o curso de um IRIs 13. As plantas foram tratadas como descrito no protocolo acima referido e colhidas em diferentes pontos de tempo: antes NTratamento AA (NPA), e depois de 2, 3 e 4 horas de tratamento NAA. Além disso, o material de plantas cultivadas apenas em água foi colhida para comparar a expressão de genes entre IRIs e condições neutras. Imediatamente após a colheita, segmentos de raiz correspondente a uma região compreendida entre 5 mm e 15 mm acima da ponta da raiz foram dissecadas sob a binocular. Usando pinças, o córtex foi separada da estela (que contém o periciclo), e extraiu-se o ARN a partir de ambos os tecidos. Este último passo foi realizado em vez de GCV, porque é muito mais rápido e mais barato para validação. Usando o seguinte respectivo direta e inversa iniciadores qRT-PCR, AGCAGGACGCAGTTGGAGAG e GAGCCGAGAGCACAGAAGAAAG, GRMZM2G310115 foi validado para ser regulado para cima em cima IRIs, e para ser específico para os tecidos estela (Figura 5). Além disso, esta experiência mostra que sem indução síncrona, os eventos discretos de iniciação de raízes laterais que acontecem em uma raiz que cresce na água não são detectáveis, e ilustrar a necessidade da IRIs para revelar a expressão diferencial de genes relacionados com o processo de iniciação de raízes laterais.
Figura 1. Lateral raiz do sistema Inducible para Arabidopsis (A) Preparação da malha de nylon (20 mm):. Cortar a malha de nylon (9 cm por 9 cm), envolvê-la em papel de alumínio e colocá-lo em um copo de vidro para autoclavagem. (B) Aplique a malha de nylon em uma placa NPA contendo (10 mM), usando uma pinça. Em seguida, usar um Drigalski esterilizada de modo a eliminar bolhas de ar. (C) Sementes da sementeira na malha de nylon usando uma pipeta. (D) Sementes da sementeira na malha de nylon usando um palito. (E) Transferir a malha de nylon para uma placa contendo NAA (10 mM), usando uma pinça.81 / "target =" _ blank "53481fig1large.jpg> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Lateral raiz do sistema Inducible para o milho. (A) preparar os rolos de papel: coloque duas camadas de papel (92 cm x 24 cm, comprimento de duas folhas) em cima uns dos outros e dobrá-los ao longo do comprimento (92 cm x 12 cm). (B) Colocar 10 grãos de milho esterilizados com a radícula voltada para baixo no papel de 2 cm a partir do topo com um interspacing de 8 cm. Em seguida, enrole o papel, mantendo os grãos de milho no lugar. (C) Coloque os rolos de papel em tubos (por exemplo, 250 ml tubos de centrífuga) e colocá-los em um rack. (D) crescer as plântulas de milho para três dias em uma solução NPA 50 uM (a 27 ° C, a luz contínua, humi relativadity 70%). (E) Esquerda: mudas apenas antes da transferência para NAA; Médio: seções transversais micrótomo apenas antes da transferência para NAA e 2 dias após a transferência para NAA; À direita:. Plântulas com raízes laterais visíveis surgiram 5 dias após a transferência para NAA Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Lateral Root Iniciação é estimulada Após prolongada curso NAA tratamento. (AF) Tempo que mostra a resposta auxina, durante um tratamento NAA usando a linha marcador pDR5 :: GUS. A resposta de auxina, que é um dos primeiros eventos desencadeiam a iniciação de raízes laterais, começa 2 horas após o início do tratamento de NAA. No painel superior, uma visão geral de toda a plântula é dado; o painel inferior mostraé a resposta auxina na ponta da raiz. Claro (GM) Tempo de um tratamento NAA usando o pCYCB1; linha de marcação 1 :: GUS. O sinal representa a expressão de GUS do CYCB1; 1 gene, indicando que as primeiras divisões celulares que conduzem à formação de raízes laterais começar 6 horas após o início do tratamento de NAA. No painel superior, uma visão geral de toda a plântula é dado; o painel inferior mostra CYCB1;. 1 expressão na ponta da raiz (coloração GUS de acordo com Beeckman e Engler, 1994 22) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Expressão de Genes Perfil CYCB1 em Arabidopsis e milho durante IRIs. (A) os valores de expressão de Microarray AtCYCB1; 1 durante IRIs como descrito por De Smet et al. 2008 10 (B) Microarray valores de expressão de ortólogos potenciais de AtCYCB1; 1 durante IRIs tal como descrito por Jansen et ai. 2013 13 BLASTP pontuação é a pontuação obtida quando explodir a sequência da proteína de AtCYCB1; 1 no genoma do milho. As barras de erro expressar desvio padrão e ** representa um -valor p ≤0.01. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Expressão dos GRMZM2G310115 na Estela eo córtex de raízes de milho durante IRIs. A expressão de <em> GRMZM2G310115 durante IRIs no milho foram avaliadas por quantitativo em tempo real qRT-PCR em amostras de córtex estela e dissecados. Uma amostra adicional foi realizada em plantas cultivadas em água. Os valores foram normalizados para a expressão na estela em água. As barras de erro expressar desvio padrão e ** representa um -valor p ≤0.01 (primers e genes de referência de acordo com Jansen et al. 2013 13). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
No protocolo de Arabidopsis IRIs, é importante apenas para transferir as plântulas que cresceram inteiramente em contacto com o meio de crescimento contendo NPA. Isto assegura que a iniciação de raízes laterais é bloqueado ao longo de todo o comprimento da raiz. A fim de evitar ferir as plântulas durante a transferência, os braços das pinças curvas pode ser ligado sob os cotilédones de plântulas a. Após a transferência, certifique-se de que as raízes de mudas estão em contacto suficiente com o meio agar contendo NAA. Isto pode ser conseguido por desnatação à raiz sobre a superfície de agar sobre uma pequena distância. Isso irá garantir uma indução sincronizado eficiente da iniciação de raízes laterais ao longo do comprimento total de raízes. As raízes podem ser cultivadas expostas à luz, sem afectar negativamente o seu crescimento e indução de raízes laterais.
No protocolo IRIs milho, é importante que a radícula do núcleo está voltado para baixo e para o papel de assegurar a raiz cresce downwards e anexar ao papel no lado correto 16. Depois de três dias de tratamento NPA, as mudas devem ter surgido a partir do kernel com um pequeno rebento, uma raiz primária e raízes seminais 16. A raiz principal deve ser, aproximadamente, 2 cm de comprimento, antes de prosseguir para a indução de iniciação de raízes laterais. Este protocolo foi desenvolvido utilizando a linha pura B73 do milho, mas, em caso de uma linha de milho com uma taxa de crescimento diferente, ajustar o tempo de incubação em conformidade. Certifique-se de que os rolos de papel embebido permanecer regularmente adicionando 50 � solução NPA quando o líquido evapora ao longo do tempo, caso contrário tratamento NPA poderia ser o desenvolvimento de raízes laterais cedo ineficiente e indesejada poderia ocorrer. O próprio sistema evita a exposição das raízes à luz, mas a luz não é uma questão importante e não afeta o crescimento da raiz e indução de raízes laterais.
Formas alternativas para a indução controlada de raízes laterais são o uso de MEChanical dobra 23 ou 24 gravistimulation. A principal vantagem destes sistemas é que eles têm uma indução mais "natural" em comparação com os tratamentos hormonais no IRIs, mas a desvantagem é que elas são limitadas na quantidade de material que pode ser colhida num dado ponto de tempo porque apenas produzir um evento de iniciação de raízes laterais na curva por muda em relação a uma indução completa do periciclo no IRIs.
O IRIs utilizado em Arabidopsis e de milho podem ser utilizados numa variedade de plantas, embora as condições favoráveis precisa ser optimizada. Para instalar um IRIs, duas etapas sucessivas importantes têm de ser alcançados: (1) o bloqueio de transporte de auxina e (2) acumulação de auxina para induzir a iniciação de raízes laterais. O sistema deve permitir crescente para a absorção eficiente e uniforme dos compostos e deveria permitir o desenvolvimento das mudas. Sistemas alternativos para meio sólido (Arabidopsis) e rolos de papel (milho), tais como cultura líquida, hidroponia, ou aeroponics, poderia ser utilizado para outras espécies. A primeira etapa na IRIs, ou seja, o bloqueio do transporte de auxina, pode ser alcançado pela adição de um inibidor do transporte de auxina. Embora NPA leva a um bloco eficiente de iniciação de raízes laterais em Arabidopsis e milho, compostos alternativos, tais como o ácido 2,3,5-triiodobenzóico (TIBA) ou ácido chlorophenoxyisobutyric p- (pCIB) pode funcionar melhor em outras espécies. Uma optimização similar pode ser feito para a segunda etapa do IRIs, ou seja, o tratamento de auxina. A auxina sintética NAA parece ser o mais adequado para um IRIs. O precursor de auxina indol-3-butírico (IBA) pode ser uma boa alternativa, uma vez que também induz fortemente raízes laterais e tem uma alta bioactividade em diferentes plantas 25, por outro lado, o ácido indole-3-acético auxina naturais 26. (IAA) é menos estável e mais facilmente metabolizados 27, racionalizando seu efeito mais fraco em devel raizvolvimento em, por exemplo, de milho ou arroz 25, 26. A auxina sintética ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) se acumula nas células altamente periciclo, parcialmente porque não é exportado a partir das células 28, prejudicando a iniciação apropriada de raízes laterais e induzindo artificial estruturas fundidas. Também outros compostos que interagem com as vias de auxina, tais como naxillin 12, têm sido mostrados para induzir a iniciação de raízes laterais em Arabidopsis e pode ser testado em outras espécies.
Em alguns casos, a germinação é ineficiente na presença de ANP e pode-se escolher primeiro a germinar as sementes na ausência de ANP, subsequentemente para transferir as plântulas para o sistema de ANP que contém. Isto induz um possível risco de ter início raiz primordial laterais iniciadas antes da indução de raízes laterais com tratamento NAA e, portanto, é importante apenas para provar a região da raiz alongada que durante o tratamento NPA. Seguindo esta estratégia geral, um should ser capaz de otimizar um IRIs para praticamente qualquer (semente) da planta e, como tal, tem um sistema fácil para estudar o desenvolvimento de raízes laterais para a planta de interesse. A caracterização adicional do momento do início de raízes laterais podem ocorrer através de linhas de marcação, tal como exemplificado para Arabidopsis. Se as linhas marcadoras são difíceis de obter, um estudo histológico detalhada pode ser feito, mas isso é moroso e as primeiras divisões celulares não são facilmente reconhecíveis. Alternativamente, a análise de marcadores de divisão celular de expressão pode ser utilizado para indicar o momento das primeiras divisões celulares.
O IRIs pode ser usado para diferentes fins, tais como análise de transcriptoma 13/09 como brevemente descrito nos resultados, bem como observações histológicas, a nível macroscópico e microscópico durante o início de raízes laterais 14. Diferentes tipos de amostragem, que vão desde a escala órgão célula 29, poderá permitir desvendar os diferentes aspectos da tardeiniciação raiz al. Além disso, o IRIs pode ser utilizado para monitorizar o efeito de diferentes compostos sobre a iniciação de raízes laterais 12, 30. Finalmente, usando linhas repórter, um IRIs pode também ser usado para caracterizar facilmente a expressão do gene e / ou a localização da proteína durante laterais desenvolvimento radicular.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARABIDOPSIS LRIS | |||
| Seeds | |||
| Arabidopsis seeds | Col-0 ecotype | ||
| Gas sterilization of seeds | |||
| micro-centrifuge tubes 1.5 ml | SIGMA-ALDRICH | 0030 125.215 | Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean |
| micro-centrifuge tubes 2 ml | SIGMA-ALDRICH | 0030 120.094 | Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes |
| hydrochloric acid | Merck KGaA | 1,003,171,000 | 37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu |
| glass desiccator | SIGMA-ALDRICH | Pyrex | |
| glass beaker | |||
| plastic micro-centrifuge tubes box or holder | |||
| Bleach sterilization of seeds | |||
| ethanol | Chem-Lab nv | CL00.0505.1000 | Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70% |
| sodium hypochlorite (NaOCl) | Carl Roth | 9062.3 | 12% |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | |
| sterile water | |||
| Growth medium | |||
| Murashige and Skoog salt mixture | DUCHEFA Biochemie B.V. | M0221-0050 | |
| myo-inositol | SIGMA-ALDRICH | I5125-100G | |
| 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | DUCHEFA Biochemie B.V. | M1503.0100 | |
| sucrose | VWR, Internation LLC | 27483.294 | D(+)-Sucrose Ph. Eur. |
| KOH | Merck KGaA | 1050211000 | pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Plant Tissue Culture Agar | LabM Limited | MC029 | |
| Lateral root induction chemicals | |||
| N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0926.0250 | 10 µM (Arabidopsis) |
| 1-naphthalene acetic acid (NAA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0903.0050 | 10 µM (Arabidopsis) |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | SIGMA-ALDRICH | 494429-1L | |
| Making a mesh for transfer | |||
| nylon mesh | Prosep byba | Synthetic nylon mesh 20 µm | |
| Sowing and seedling handling | |||
| square petri dish plates | GOSSELIN | BP124-05 | 12 x 12 cm |
| 50 ml DURAN tubes | SIGMA-ALDRICH | CLS430304 | Corning 50 ml centrifuge tubes |
| drigalski | Carl Roth | K732.1 | |
| pipette | |||
| cut pipette tips | Daslab | 162001X | Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving |
| breathable tape | 3M Deutschland GmbH | cat. no. 1530-1 | |
| tweezers | Fiers nv/sa | K342.1; K344.1 | Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7 |
| Growth conditions | |||
| growth room | 21 °C, continuous light | ||
| Materials | Company | Catalog | Comments |
| MAIZE LRIS | |||
| Seeds | |||
| Maize kernels | B-73 | ||
| Bleach sterilization of kernels | |||
| glass beaker | |||
| magnetic stirrer | Fiers nv/sa | C267.1 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl) | Carl Roth | 9062.3 | 12% |
| sterile water | |||
| Lateral root induction chemicals | |||
| N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0926.0250 | 50 µM (maize primary root), 25 µM (maize adventitious root) |
| 1-naphthalene acetic acid (NAA) | DUCHEFA Biochemie B.V. | No. N0903.0050 | 50 µM (maize) |
| dimethylsulfoxide (DMSO) | SIGMA-ALDRICH | 494429-1L | |
| Sowing and seedling handling | |||
| paper hand towels | Kimberly-Clark Professional* | 6681 | SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm) |
| seed germination paper | Anchor Paper Company | 10 X 15 38# seed germination paper | |
| tweezers | Fiers nv/sa | K342.1; K344.1 | Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7 |
| 250 ml (centrifuge) tubes | SCHOTT DURAN | 2160136 | approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height |
| 700 ml tubes | DURAN GROUP | 213994609 | cylinders, round foot tube, D 60 x 250 |
| rack | for maize tubes, home made | ||
| sterile water | |||
| Growth conditions | |||
| growth cabinet | 27 °C, continuous light, 70% relative humidity |
References
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