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Biology

側根誘導系で doi: 10.3791/53481 Published: January 14, 2016
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Introduction

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それが土壌から、足場と水と栄養素の摂取を保証するため、根系は、植物の成長のために重要です。根系の拡大は主に側根の生産に依存しているため、その開始及び形成が広く研究されています。側根は、創業者セル 1と呼ばれる、鞘細胞の特定のサブセットに開始されます。トウモロコシなどの単子葉植物に、それらは師部の極3に見られるのに対し、このようなシロイヌナズナなどのほとんどの双子葉植物では、これらの細胞は、原生木部の極2に配置されています。創始細胞は、特定の細胞周期遺伝子の発現に続いて増加オーキシン応答4、でマークされている例えば サイクリンB1; 1 / CYCB1; 1)、その後、彼らは非対称背斜部門5の第1ラウンドを受けます。協調背斜と周縁部門の一連の後、側根の原基は、最終的にAと出てくるように形成されていますutonomous側根。これらのイベントが豊富でも同期でもないので、側根開始の位置とタイミングは、しかし、予測可能ではありません。これは、このプロセスを研究するためのトランスクリプトミクス、分子的アプローチの使用を妨げます。

これに対処するには、側根誘導系(LRISは)7,6を開発してきた。このシステムでは、苗を最初に結果的に側根の開始を阻止する、オーキシン輸送と蓄積を阻害するN -1-ナフチルフタラミン酸(NPA)で処理されています8。その後、合成オーキシン1-ナフタレン酢酸(NAA)を含む培地に苗を転送することによって、全体の鞘層が、それによって大量の細胞分裂6を開始する側根を誘導上昇オーキシンレベルに応答します。このように、このシステムは、後半の特定の段階について濃縮根サンプルの容易な収集を可能にする、高速同期と豊富側根のイニシエーションにつながりますRALルート開発。その後、これらのサンプルは、側根形成の間のゲノムワイドな発現プロファイルを決定するために用いることができます。 LRISは、側根のシロイヌナズナの開始とトウモロコシ9-13について、すでにかなりの知識が得られましたが、より多くのゲノムが配列決定されており、経済的な重要に知識を伝達する関心の高まりがあるとして、他の植物種にこのシステムを適用する必要性がより明らかになり、種。

ここでは、 シロイヌナズナやトウモロコシLRISsの詳細なプロトコルが与えられています。次に、システムの使用例は、トウモロコシLRISから得られたトランスクリプトミクスデータが異なる植物種間側根開始時に保存された機能を持つ機能的ホモログを同定するために使用することができる方法を示すことによって、提供されます。最後に、他の植物種のためLRISを最適化するためのガイドラインが提案されています。

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Protocol

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1. シロイヌナズナ LRISプロトコル

注:テキストは、「小」または「大」規模の実験を指します。そのようなマーカーのライン分析および組織学的染色6、14のような小さな規模の実験では、わずか数のサンプルを必要とします。そのような定量的リアルタイム定量RT-PCR、マイクロアレイ9-11またはRNA配列決定のような大規模な実験は、サンプルのより大きな量を必要とします。このように、サンプル当たり〜1000年苗の量は、ルートセグメントの解剖後にマイクロアレイ実験を行うためにVanneste 11で使用されていました。

1日目

  1. シロイヌナズナの種子の殺菌
    注:種子消毒のための次の手順のいずれかを選択します。それらのいずれかのプロトコルの次のステップのために適しています。ガス滅菌(1.1.2)は、液体殺菌(1.1.1)上の2つの主な利点を提供する:大規模な麻痺を取り扱う際にはあまり時間がかかります種子のER、何のピペット操作は、個々のサンプルのために発生することがないので、滅菌種子は、より長い期間保存することができます。しかし、デシケーターと慎重な取り扱いが必要です。
    1. 液体滅菌
      1. マイクロ遠心管における種子の所望の数を注ぎます。 2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1.5mlチューブ中の20mg(〜800種子)または40mgの(〜1600種子)まで使用します。
      2. 70%エタノール1 mlを加え。反転または軽く2分間振ります。
      3. 15分間1mLの滅菌溶液で70%エタノールを交換してください。 (新鮮な滅菌溶液を調製する:3.85ミリリットルの次亜塩素酸ナトリウム(NaOC​​lを)株式(12%)(注意:使用ヒュームフード)、5μlのトゥイーン20を、水で10mlまでのすべての種子が来ることを確認するために、チューブを数回反転します。溶液と接触しました。
      4. 層流キャビネット中で、1 mlの滅菌蒸留水を消毒液を交換し、繰り返しによって5分間の種を5回すすぎLY新鮮な滅菌蒸留水1mlで置き換えます。
    2. ガス殺菌
      1. 2 mlのマイクロ遠心チューブにシードの所望の数を注ぎます。いくつかの独立したラインで作業する場合、個々のチューブを使用し、それらをプラスチック微量遠心管ボックスまたはホルダーにオープンしたアレンジ。一本のチューブ内のシードの数は、500(12.5 mg)を超えた場合、成功した滅菌を確実にするために、チューブの適切な数の種を細分化。近隣のチューブのキャップがお互いをカバーしていないことを確認してください。それは殺菌のためだけでなく、デシケーター中であることが必要であるとして、底の箱の蓋を一緒にフィット。
      2. ガラスビーカー(:使用ドラフトチャンバー注意)とともに、デシケーターのボウルに箱を置きます。
      3. 12%のNaOCl(:使用ドラフトチャンバー注意)100mlの入ったビーカーを埋めます。デシケーターに蓋を置くが、ビーカーが置かれている小さな開口部を残します。
      4. 37%塩酸3mlの(発煙)(CAUを追加TION:小さな開口を通してビーカーにヒュームフード)を使用し、迅速にデシケーターを閉じます。 Cl 2ガスの形成に起因するいくつかの時間のためのソリューション意志バブル。 O / Nを閉じた(または少なくとも8時間)システムのままにしておきます。
      5. デシケーターの蓋を外します。箱を取り出し、輸送中の汚染を避けるために蓋でそれをカバーしています。
      6. 層流キャビネットのボックスを入れ、ふたを取り外し、ガス放出を可能にするために、室温で約1時間の種を残します。
        注:種子を安全に4℃で最大2週間、閉鎖ミクロ遠心管中の乾燥を格納することができます。
  2. シロイヌナズナの側根の誘導
    1. 側根の阻害(NPA処理)
      1. in vitroでの成長のための成長培地を準備します。培地の半分強ムラシゲ・スクーグ塩混合物15、0.1グラム/ Lのミオイノシトール、10グラム/ Lのスクロースを含み、0.5で緩衝されていますG / L 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)。
      2. 1 M KOHで5.7にpHを調整します。植物組織寒天を8g / Lを加え、121℃で20分間、培地をオートクレーブ。
      3. ジメチルスルホキシド(DMSO)(:使用手袋注意)NPAの25 mMストック溶液を調製します。層流キャビネット中で、(ボトルを手で保持することができる温度である)が約65°Cまでオートクレーブ培地を冷却し、10μMNPAの最終濃度を得るために、25 mMのNPAストック溶液を加えます。
      4. 静かに10秒間ボトルを振ることにより添加した際に均質化します。正方形のシャーレ(12センチメートル×12センチ)あたりの培地50mlを注ぎます。
        注:大規模な実験の場合には、容易な移動を確保するためにナイロンメッシュ(20ミクロン)を適用します。オートクレーブ処理( 図1A)のためのメッシュ(9センチメートル×9センチ)を準備。オートクレーブ処理した場合には、無菌のピンセット( 図1B)を使用して、増殖培地にメッシュを適用します。静かにSTEを使用して増殖培地にメッシュをプッシュそれは成長培地( 図1B)(:無菌状態での作業注意)との良好な接触にあることを確認するrilized drigalsky。
      5. NPA-プレート上の種をまきます。
        注:場合は、大規模な実験が予定されている、(1.2.2.3を参照)2緻密でサンプリングを容易にするための50個の種子のよく整列行まきます。
        1. 液体の滅菌の場合は、200μlのピペットを用いて、NPA-プレート上に種をまきます。種子をピペットすることができるようにするために無菌状態でのピペット先端の終わり(または先端の滅菌前)の4ミリメートル - 3をカット。ピペットアップや種子を再懸濁するために数回ダウンは、その後10で約150μlの滅菌水をピペット - 20種子や先端の下部にある種子の堆積物まで待ちます。 (注意:無菌状態での作業)
          注意:先端で軽く寒天またはメッシュをタッチすると、シードと水の低下はそれから解放されます( 図1C)。
        2. <ガス滅菌の場合、Liが>、粘着性表面を確保するために種子を取る前にオートクレーブしtoothpicks.Pinchに寒天につまようじを使用して種をまきます。種子に爪楊枝を使用して1つずつピックアップし、プレート上の種子を配布する( 図1D)。また、種子に滅菌水を追加し、1.2.1.5.1(注意:無菌状態での作業)に記載されているように種をまきます。
      6. 通気性粘着テープでプレートを密封し、それらに少なくとも2日、最大1週間暗所で4℃でプレートを保存します。これは、層別化し、同期を保証し、より効率的な発芽のために必要とされます。
        注:また、種子がより少ない冷蔵庫のスペースを必要とする、播種前成層マイクロ遠心管中で蒸留水に浸漬することができます。この場合には、4℃で少なくとも1週間のチューブを格納し、直ちに(1.2.1.7参照)を播種した後、成長キャビネットにプレートを移動させます。
        3日目 ほぼ垂直の位置(80〜90°)で5日(発芽と成長の3日の2日間)成長キャビネット(連続光(110μEmを-2-1)、21°C)にプレートを移動のではなく、培地中の根の成長を確保します。
        8日目
    2. 側根誘導(NAA処理)
      1. 1.2.1.1と1.2.1.2で説明したのと同じ成長培地を準備します。 (:使用手袋注意)DMSO中のNAAの50 mMストック溶液を調製します。 65℃までのオートクレーブ処理中に冷却し、10μMNAA(注意:無菌状態での作業)の最終濃度を得るために、培地にNAAのソリューションを追加します。
        1. 静かに10秒間ボトルを振ることにより添加した際に均質化します。正方形のシャーレ(12センチメートル×12センチ)あたりの培地50mlを注ぎます。
      2. これらのSUPに10μMのNPAを補足した成長培地を含むプレートから苗を転送10μMNAAとplemented。
        1. 苗の子葉の下に曲がったピンセットの腕を引っ掛け、ゆっくりプレートから取り外します。唯一の根が完全に好ましくは下向きNPA-増殖培地とに接触して成長しているの苗を移します。
        2. 小さな距離にわたってNAAを含む成長培地の表面上にルートをすくい取ります。植物の根は成長培地との良好な接触状態にあることを確認します。必要に応じて、ピンセットで穏やかに成長培地表面へのルートを押してください。
          注:大規模な実験の場合には、ピンセットを持つ2つの上部の角にメッシュを持ち上げてメッシュと転送と接触していないすべての苗を削除します。メッシュが小さな距離( 図1E)の上に寒天表面上にメッシュをスキミングすることにより、NAAを含む培地との良好な接触状態にあることを確認します。
      3. 通気性のテープで新しいプレートを密封し、成長キャビネットに配置します(コンサンプリングまでの誘導後の所望の時間のための垂直位置にあるtinuous光(110μEmを-2-1)、21℃)。
        注:大規模な実験の場合には、メッシュ上のすべてを一度に直接ルート・セグメントをカットし、軽くメッシュの表面をこすることによって、それらをサンプリングするためにメスを使用しています。

2. LRISトウモロコシプロトコル

  1. トウモロコシカーネルの階層化
    1. 少なくとも1週間、暗所で4℃でトウモロコシ穀粒をインキュベートします。
      注:このプロトコルは、B73トウモロコシ近交系を使用して開発されてきました。
  2. トウモロコシカーネルの滅菌
    1日目
    注意:トウモロコシの苗は、無菌状態で増殖させることはありませんが、それはロール紙での真菌の増殖を防止するために、トウモロコシ穀粒を殺菌し、滅菌材料で作業することをお勧めしますシステム。
    1. 滅菌ガラスビーカーにトウモロコシカーネルの必要な数を入れてください。
    2. 滅菌溶液100ml(6%水中の次亜塩素酸ナトリウム)(:使用ドラフトチャンバー注意)を追加します。
    3. 磁気攪拌棒を加え、室温で5分間低攪拌速度(約250 rpm)で磁気撹拌機にビーカーを置きます。
    4. 新鮮な滅菌水100mlでソリューションを置き換えることにより、5分間、5回洗浄します。
  3. トウモロコシカーネルを蒔きます
    1. 汚染のリスクを軽減し、ペーパータオルのロールを取るために手袋を着用してください。
    2. 2枚(約92センチメートル×24センチ)の長さの合計とハンドタオル紙の2ストレッチを切り取り、きれいな表面( 図2A)に互いの上にそれらを配置します。
    3. シートは、長さ(約92センチメートル×12センチ)( 図2A)の上に二つ折り。
    4. トン以上の上部から約2cmで10のカーネルを配布するためにピンセットを使用して、彼の紙の全体の長さ、両端( 図2B)で無料各カーネルと8センチメートル間に8cmの隙間を維持しながら。カーネルの幼根がダウンと紙( 図2B)を向いていることを確認します。
    5. 図2B)の場所に種を維持しながらゆっくりと、長さにわたって紙をロールバックします。ローリングを促進するために、それは最初に滅菌水で紙をスプレーするオプションです。
    6. 約6センチ、直径14センチ、高さ例えば、250ミリリットル遠心管)の滅菌ガラス管にロール紙を入れて、ラック( 図2C)に配置します。
  4. トウモロコシにおける側根の誘導
    1. (DMSOに溶解)の50mM NPA原液(:使用手袋注意)を準備。
    2. 各チューブは、滅菌ガラスビーカーに125 mlの滅菌水に50mMのNPAストック溶液から125μLを添加することにより、50μMのNPAソリューションを作ります。
    3. よく混ぜ、チューブ内のロール紙の上に、50μMNPA液の125ミリリットルを注ぎます。ロール紙は、ソリューションを吸収し、完全に浸しになります。
      注意:他の寸法のロール紙とチューブを使用する場合は、それに応じて音量を調整します。液体は、十分な取り込みを確保するために途中でチューブに到達する必要があります。
    4. 3日(27℃、連続光、相対湿度70%)の成長キャビネットにロール紙システムを配置します。ロール紙は、ソリューションが( 図2D)時間をかけて蒸発するので、余分な50μMのNPA溶液を添加することにより浸したままであることを確認してください。
      4日目
    5. (DMSOに溶解)、50mMのNAA原液(:使用手袋注意)を準備。
    6. 各チューブは、滅菌ガラスビーカーに125 mlの滅菌水に50mMのNAAストックから125μlのを追加することで、50μMのNAA液を調製。
    7. ゆっくりと紙ロールから残りNPAソリューションのほとんどを絞り出すと場所(:使用手袋注意)それを洗い流すために5分間滅菌水中メートル。ゆっくりと紙ロールからほとんどの水を絞り出します。この洗浄工程を3回繰り返します。
    8. 十分に混合し、チューブ内の用紙ロールオーバー、50μMのNAA液を注ぎます。彼らは完全に浸されていることを確認します。
    9. 誘導後の所望の期間の成長キャビネット(27℃、連続光、相対湿度70%)にロール紙システムを配置します。
  5. トウモロコシの不定冠根における側根の誘導
    注:上記のLRISとしては、プライマリルートに側根を誘導します。しかし、トウモロコシおよび他の単子葉植物、プライマリルートおよび胚種子根に、一緒に彼らの側根で、開発苗の間に主に重要です。植物の成長の後の段階では、後胚不定根が茎に発生し、また、新しい根系16を形成するために、側根を開発しています。 LRISも使用することができますdは、胚主要ルートにLRISにいくつかのマイナーな調整に従うことによって、これらの後胚不定冠根の側根を誘導しました。
    1. ロール紙を作るために、それぞれ外側にハンドタオル紙の二つの層、および内で発芽紙の2層を有する紙のサンドイッチを作成します。発芽紙の2枚の間に(ステップ2.1〜2.2を参照)滅菌カーネルを配置します。ハンドタオル紙に比べて発芽紙は、紙の開口部は、後に容易に転がるようになりますこれは、根毛と側根が貫通しにくいでしょう。一方、ハンドタオル紙の2つの外部層は、液体の吸収を促進します。
    2. 700ミリリットルのガラス管にロールを挿入し、それらの上NPAずに滅菌水を注ぎます。彼らは完全に浸されていることを確認します。
    3. 成長キャビネットに滅菌カーネルを発芽(ステップ2.4​​.9を参照)。
    4. 不定冠根まで苗を育てます(B73のために6日)出現し始めます。ロール紙が必要なときに滅菌水を添加することにより、常に湿った保たれていることを確認します。
    5. 4日間、25μMNPA溶液に移す(ステップは2.4.4に2.4.1を参照)、洗浄工程の後、50μMのNAA液でNPAソリューションを置き換えることにより、側根開始の同様の誘導に続いて(ステップ2.4​​を参照してください2.4.9に0.5)。

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Representative Results

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LRISの適用は、側根開始プロセスの比較トランスクリプトを実行します

LRISの1つの用途は、異なる種における側根形成の間の比較遺伝子発現プロファイルの相関関係です。比較トランスクリプトミクスは、異なる種における側根の開発プロセスに関与オルソロガス遺伝子を特定する可能性を作成して近づきます。既に形成されているルートの軸に含まれる細胞のサブセットから新しい器官の形成で構成されて側根の開始は、その根本アーキテクチャを制御するために、被子植物で共有される主要なメカニズムです。したがって、それは共通の祖先に存在する既存経路から進化し、進化を通して保存されていた可能性が非常に高いです。実際、側根開始の共通電位レギュレータは異なる種で発見されています<SUP> 17、18。

シロイヌナズナ とトウモロコシ でLRISを使用してサンプリング素材 、およびトランスクリプトーム解析

LRISは2つの異なる種で確立されています。 シロイヌナズナとトウモロコシ10、13両方の種では、それはちょうど、NAA処理前、まもなく誘導後、開始時、またはオーキシン応答の間に植物をサンプリングすることが決定された、として同様の開始時、または鞘内の最初の分裂の間。さらに、19蛍光活性化細胞選別(FACS)は、内鞘細胞を選択するためにトウモロコシにシロイヌナズナやレーザーキャプチャー顕微鏡20、21(LCM)で使用されました。 シロイヌナズナでは、誘導後2および6時間の時点は、PDR5の転写特性評価に基づいて選択した:: GUSのオーキシン応答とpCYCB1; 1 :: GUS細胞周期マーカー 9(図3)。トウモロコシでは、誘導後の時点2、3及び4時間、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を使用して、微視的細胞分裂活性の特徴付けおよびいくつかの細胞周期マーカー遺伝子発現の分析の後に選択した13 。 RNAが単離された細胞から抽出され、以前に10、13に記載のようにマイクロアレイプラットフォーム上でハイブリダイズさせました。

シロイヌナズナ CYCB1 のオルソログを見つける ; 1(AtCYCB1; 1) トウモロコシに

シロイヌナズナ 、マーカーラインpCYCB1、1 :: GUSは、広く側根開始時に鞘の最初の分裂を追跡するために使用されてきました。このようなマーカーは、非常になりますトウモロコシに有用。 AtCYCB1のいくつかのホモログ; 1は、トウモロコシ (www.maizesequence.org、全てのペプチド、BLASTP、デフォルト設定)で発見されました。それらのうち6つがトウモロコシでLRISした後に行うマイクロアレイ上に存在していたとかなりの濃縮を示しました。最高のBLASTヒット、GRMZM2G310115は 、AtCYCB1ためシロイヌナズナで観察されたものと同様、LRIS後に非常に高い転写レベルを示した; 1(図4)。

LRISの適用は、個々の遺伝子の発現を確認します

AtCYCB1の良い候補オルソログとしてGRMZM2G310115を検証するために、1トウモロコシの横のルート開始、リアルタイム定量RT-PCRにおいて異なる時点で採取した試料では、LRIS 13の過程で行われました。上記のプロトコールに記載され、異なる時点で回収として植物を処理した:N前AA処理(NPA)およびNAA処理の2,3及び4時間後。また、水のみで生育した植物材料をLRISと中性との間の遺伝子発現を比較するために回収しました。すぐに収穫後、根端の上に5ミリメートルと15ミリメートルとの間に含まれる領域に対応するルートセグメントは、両眼の下で解剖しました。ピンセットを使用して、皮質(鞘を含む)の石碑から分離し、RNAを両方の組織から抽出しました。それは検証のためにはるかに高速かつ安価であるため、この最後のステップは、代わりに、LCMの行いました。前方にそれぞれ以下と定量RT-PCRプライマーをリバースを使用して、AGCAGGACGCAGTTGGAGAGとGAGCCGAGAGCACAGAAGAAAG、GRMZM2G310115は LRIS時にアップレギュレートであることを確認した、と石碑組織図5)に特異的です。さらに、この実験は、誘導同期することなく、水の中に成長しているルートで起こっ側根開始の個別のイベントが検出されないことを示し、そして側根開始のプロセスに関連する示差的遺伝子発現を明らかにするLRISの必要性を示しています。

図1
シロイヌナズナ 図1.側根誘導系 (A)ナイロンメッシュ(20μm)を準備:。、ナイロンメッシュ(9センチメートルで9センチ)カットアルミホイルでラップし、オートクレーブ用のガラスビーカーに入れました。 (B)は、ピンセットを使用して、NPA-含むプレート(10μM)にナイロンメッシュを適用します。そして、気泡を除去するために滅菌ドリガルスキを使用しています。 (C)ピペットを用いてナイロンメッシュに種まき。 (D)ナイロンに種まきは爪楊枝を使用してメッシュ。 (E)はナイロンがピンセットを使用して、NAA-含むプレート(10μM)にメッシュ移します。81 / 53481fig1large.jpg「ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2. トウモロコシのための側根誘導系。  互いの上に場所紙の二つの層(92センチメートル×24センチ、2枚の長さ)と長さにわたって倍増して倍(92センチメートル×12センチ):(A)ロール紙を準備します。 (B)は、幼根は8cmのinterspacingで上から2センチメートルで紙の上に下に向けて10滅菌トウモロコシカーネルを入れてください。場所にトウモロコシのカーネルを維持しながら紙をロールアップ。 (C)が例えば、250ミリリットル遠心管)チューブにロール紙を置き、ラックに入れます。 (D)27℃、連続光、相対HUMIで50μMのNPA溶液(中3日間のトウモロコシの苗を育てdity 70%)。 (E)左:ちょうどNAAに転送する前に苗。ミドル:ちょうどNAAとNAAに転送後2日以内に転送する前に、ミクロトーム横断切片を、右:5日NAAへの転送後に目に見える現れ側根と実生この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
PDR5 :: GUSマーカーラインを使用して、NAA処理中にオーキシン応答を示す図3.側根開始が延長されたNAAの処理の際に刺激される。(AF)時間経過。側根の開始をトリガする最初のイベントの一つであるオーキシン応答は、NAA処理の開始後2時間を開始します。上のパネルでは、全体の苗の概要が与えられます。下のパネルショー根端におけるオーキシン応答をね。 pCYCB1を使用して、NAA処理の(GM)時間経過; 1 :: GUSマーカーライン。 GUS信号はCYCB1の発現示し、1遺伝子を、側根の形成につながる最初の細胞分裂は、NAA処理の開始後6時間を開始することを示しています。上のパネルでは、全体の苗の概要が与えられます。下のパネルは、CYCB1を示している 。(Beeckmanとエングラー、1994年22に従ってGUS染色)根端での1の発現は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
LRIS中の シロイヌナズナ とトウモロコシ CYCB1 遺伝子 図4.発現プロファイル   (A)AtCYCB1のマイクロアレイ発現値; 1 LRIS時のデスメットらによって記載されているように。 2008 10(B)AtCYCB1の潜在的なオルソログのマイクロアレイ発現値; 1 LRIS中のジャンセンらによって記載されているように。トウモロコシゲノム上の1、2013 13 BLASTPスコアAtCYCB1のタンパク質配列を爆破時に得られるスコアです。エラーバーは標準偏差を表し、**は≤0.01 -値Pの略です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
図5 石碑で GRMZM2G310115 発現 LRIS中のトウモロコシの根の皮質。の発現<em>のトウモロコシにおけるLRIS中にGRMZM2G310115を解剖石碑と皮質の試料について定量的リアルタイム定量RT-PCRにより評価しました。補足サンプリングは水で栽培された植物で行われました。値は、水中での石碑での発現のために標準化しました。エラーバーは標準偏差を表し、**は(ジャンセンによると、プライマーと参照遺伝子。2013 13)≤0.01 -値Pの略です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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シロイヌナズナ LRISプロトコルでは、それが唯一の完全NPAを含む成長培地と接触して成長した実生を転送することが重要です。これは、側根の開始は全体の根の長さの上にブロックされることを保証します。転送中の小植物を傷つけないようにするために、湾曲した鉗子のアームは、苗の子葉の下に引っ掛けることができます。転送時には、苗の根はNAAを含む寒天培地と十分に接触していることを確認してください。これは、小さな距離で寒天表面上でルートをスキミングすることにより達成することができます。これは、総根長にわたって側根開始の効率的な同期誘導を保証します。根は、負にその成長と側根の誘導に影響を与えることなく、光に曝露成長させることができます。

トウモロコシLRISプロトコルでは、カーネルの幼根は、Dが成長するルートを確保するためにダウンして、紙に向いていることが重要ですownwards、正しい側16に紙に付着します。 NPA処理の3日後、苗は小さなシュート、プライマリルートおよび種子根16をカーネルから浮上している必要があります。プライマリルートは、側根開始の誘導に進む前に、約2cm長さでなければなりません。このプロトコルは、B73トウモロコシ近交系を使用して開発されたが、異なる成長速度を有するトウモロコシラインの場合には、それに応じて、インキュベーション時間を調整されています。ロール紙は、液体が経時的に蒸発したときに非効率的であり、不必要な初期の側根の発達が発生する可能性がある可能性がありそうでない場合は、NPA処理を定期的に50μMのNPA溶液を添加することにより浸したままであることを確認してください。システム自体は光に根の博覧会を防ぎますが、光が大きな問題ではなく、根の成長と側根の誘導に影響を与えることはありません。

側根の制御された誘導のための代替の方法は、MECを使用しています23またはgravistimulation 24を曲げhanical。これらのシステムの主な利点は、それらがLRISにおけるホルモン療法と比較して、より「自然な」誘導を有することであるが、欠点は、それらが所与の時点で収穫することができる材料の量が制限されるということであるので、それらだけLRISにおける鞘の完全な誘導に比べて苗あたりの曲げ内の1つの側根の開始イベントが得られます。

有利な条件を最適化する必要があるものの、シロイヌナズナおよびトウモロコシで使用LRISは、植物の様々な使用することができます。 LRISをインストールするには、二つの重要な一連の工程を達成しなければならない:(1)側根の開始を誘導するためにオーキシン輸送とオーキシンの(2)蓄積のブロッキング。成長システムは、化合物の効率的かつ均一な取り込みを可能にすべきであると苗の良い開発を可能にすべきです。固形培地( シロイヌナズナ )とロール紙の代替システム(このような液体培養、水耕栽培、または空中栽培などトウモロコシ)は、他の種のために使用することができます。 LRISの最初の段階すなわちオーキシン輸送の遮断は、オーキシン輸送阻害剤を添加することによって達成することができます。警察庁は、 シロイヌナズナとトウモロコシにおける側根開始の効率的なブロックにつながるが、このような2,3,5-トリヨード安息香酸(TIBA)またはp型 chlorophenoxyisobutyric酸(PCIB)などの代替化合物は、他の種で良い仕事かもしれません。同様の最適化は、すなわち 、LRISの第二段階のためのオーキシン処理を行うことができます。合成オーキシンNAAはLRISために最も適していると思われます。それはまた、強く側根を誘導し、異なる植物25、26。一方、天然オーキシンインドール-3-酢酸で高い生物活性を有する限り、オーキシン前駆インドール-3-酪酸(IBA)は、良い代替であるかもしれません(IAA)が少なく安定しており、より簡単にルートdevelの上のその弱い効果を合理化、27代謝しました例えば、トウモロコシや米25、26で発。合成オーキシン2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4D)それはセル 28からエクスポートされていない部分から、内鞘細胞で高度に蓄積し、適切な側根の開始を損なうと人工誘導融合した構造。また、naxillin 12などのオーキシン経路と相互作用する他の化合物は、 シロイヌナズナの側根の開始を誘導することが示されており、他の種において試験することができます。

いくつかのケースでは、発芽はNPAの存在下で非効率的であり、1つは続いてNPAを​​含むシステムに苗を転送するために、最初のNPAの不存在下で種子を発芽することを選択するかもしれません。これは、それが唯一のNPAの治療中に細長いルート領域をサンプリングするために重要であり、したがって、NAA処理による側根の誘導の前に開始し、初期の側根の原基を持つことのリスクの可能性を誘導します。この一般的な戦略に続いて、1笙実質的に任意の(種)の植物などが対象のプラントの側根の発達を研究するための簡単​​なシステムを持っているようにするためのLRISを最適化することができるULD。側根開始のタイミングのさらなる特徴は、 シロイヌナズナのために例示したように、マーカー線を介して発生する可能性があります。マーカー線を得ることが困難である場合には、詳細な組織学的研究を行うことができるが、これは時間がかかり、最初の細胞分裂が容易に認識されません。あるいは、細胞分裂マーカーの発現解析は、最初の細胞分裂のタイミングを指示するために使用することができます。

LRISは、短時間側根開始の14時に巨視的および微視的レベルでの結果と同様に、組織学的観察に記載のようなトランスクリプトーム解析9-13のような異なる目的に使用することができます。器官からの細胞スケール29までのサンプリングの異なるタイプは、後のさまざまな側面を解明できる可能性がありますアルルート開始。また、LRISは、側根開始の12、30上の異なる化合物の効果をモニターするために用いることができる。最後に、レポーター株を用いて、LRISも容易に横方向の間の遺伝子発現および/ ​​またはタンパク質の局在化を特徴付けるために使用することができますルート開発。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ARABIDOPSIS LRIS
Seeds
Arabidopsis seeds Col-0 ecotype
Gas sterilization of seeds
micro-centrifuge tubes 1.5 ml SIGMA-ALDRICH 0030 125.215 Eppendorf microtubes 3810X, PCR clean
micro-centrifuge tubes 2 ml SIGMA-ALDRICH 0030 120.094 Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes
hydrochloric acid Merck KGaA 1,003,171,000 37% (fuming) for analysis EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eu
glass desiccator SIGMA-ALDRICH Pyrex
glass beaker
plastic micro-centrifuge tubes box or holder
Bleach sterilization of seeds
ethanol Chem-Lab nv CL00.0505.1000 Ethanol, abs. 100% a.r. dilute to 70%
sodium hypochlorite (NaOCl) Carl Roth 9062.3 12%
Tween 20 SIGMA-ALDRICH P1379
sterile water
Growth medium
Murashige and Skoog salt mixture DUCHEFA Biochemie B.V. M0221-0050
myo-inositol SIGMA-ALDRICH I5125-100G
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) DUCHEFA Biochemie B.V. M1503.0100
sucrose VWR, Internation LLC 27483.294 D(+)-Sucrose Ph. Eur.
KOH Merck KGaA 1050211000 pellets for analysis (max. 0.002% Na) EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Plant Tissue Culture Agar LabM Limited MC029
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0926.0250 10 µM (Arabidopsis)
1-naphthalene acetic acid (NAA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0903.0050 10 µM (Arabidopsis)
dimethylsulfoxide (DMSO) SIGMA-ALDRICH 494429-1L
Making a mesh for transfer
nylon mesh Prosep byba Synthetic nylon mesh 20 µm
Sowing and seedling handling
square petri dish plates GOSSELIN BP124-05 12 x 12 cm
50 ml DURAN tubes SIGMA-ALDRICH CLS430304 Corning 50 ml centrifuge tubes
drigalski Carl Roth K732.1
pipette
cut pipette tips Daslab 162001X Universal 200, cut off 5 mm of tip before autoclaving
breathable tape  3M Deutschland GmbH cat. no. 1530-1
tweezers Fiers nv/sa K342.1; K344.1 Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
Growth conditions
growth room 21 °C, continuous light
Materials Company Catalog Comments
MAIZE LRIS
Seeds
Maize kernels B-73
Bleach sterilization of kernels
glass beaker
magnetic stirrer  Fiers nv/sa C267.1
sodium hypochlorite (NaOCl) Carl Roth 9062.3 12%
sterile water
Lateral root induction chemicals
N-1-naphthylphthalamic acid (NPA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0926.0250 50 µM (maize primary root), 25 µM (maize adventitious root)
1-naphthalene acetic acid (NAA) DUCHEFA Biochemie B.V. No. N0903.0050 50 µM (maize)
dimethylsulfoxide (DMSO) SIGMA-ALDRICH 494429-1L
Sowing and seedling handling
paper hand towels Kimberly-Clark Professional* 6681 SCOTT Hand Towels - Roll / White; sheet size (24 x 46 cm)
seed germination paper Anchor Paper Company 10 X 15 38# seed germination paper
tweezers Fiers nv/sa K342.1; K344.1 Dumont tweezers type a nr 5; Dumont tweezers type e nr 7
250 ml (centrifuge) tubes SCHOTT DURAN 2160136 approx. 5.6 cm diameter and 14.7 cm height 
700 ml tubes DURAN GROUP 213994609 cylinders, round foot tube, D 60  x 250
rack for maize tubes, home made
sterile water
Growth conditions
growth cabinet 27 °C, continuous light, 70% relative humidity

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References

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側根誘導系で<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;とトウモロコシ
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Crombez, H., Roberts, I., Vangheluwe, N., Motte, H., Jansen, L., Beeckman, T., Parizot, B. Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize. J. Vis. Exp. (107), e53481, doi:10.3791/53481 (2016).More

Crombez, H., Roberts, I., Vangheluwe, N., Motte, H., Jansen, L., Beeckman, T., Parizot, B. Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize. J. Vis. Exp. (107), e53481, doi:10.3791/53481 (2016).

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