Summary
슈퍼 미세 혈관 문합을위한 비 봉합 커프 기술을 적용 마우스에서 소성을 뒷다리 이식이 새로운 모델은, 혈관 복합 동종 이식 (VCA)에 관한 생체 역학적 면역 학적 연구를위한 강력한 도구를 제공합니다.
Protocol
모든 실험은 관리 및 국립 보건 연구소 (NIH)의 실험 동물의 사용을위한 설명서에 따라 실시하고, 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용위원회 (JHUACUC)에 의해 승인되었다. 구체적인 절차는 승인 ACUC 프로토콜 MO13M108 하에서 수행 하였다.
1. 기부자 운영
- 수술하기 전에 각각의 약리학 적 제제에 대한 적절한 시점에서 진통을 관리. 0.1 mg의 프레 노르 핀의 피하의 / kg BW 1 시간 전에 피부 절개에 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜 사용에 따라.
- 이소 플루 란 침착 도너 4 %의 이소 플루 란 기화기에 부착 된 챔버를 통해인가; 코 콘을 통해 2 %에 진정 및 마취을 유지한다. 절차의 개시에 앞서 마취 깊이를 모니터링하도록 발가락 핀치 움츠림 반사를 수행한다.
- 마스크, 일회용 절연 가운과 장갑을 착용 할 것.
- 수술 아칸소 쉐이브개, 10 % 포비돈과 특히 뒷다리와 사타구니, 그리고 준비에 - 요오드.
- 멸균 필드 드레이프, 멸균 장비 및 고배율 현미경 (40X)를 사용합니다.
- 허벅지 중간 영역 근위 가위를 사용하여 고간 피부 절개를 원주 마우스 본체의 나머지 뒷다리를 구별하기 위해 절개를 연결한다.
- 식별 및 대퇴 동맥, 정맥 신경을 해부하다. 포셉 및 마이크로 가위를 사용하여 세 가지 구조를 분리합니다.
- 척추 경 혈관이 절개되면 마이크로 가위를 사용 사타구니 인대의 수준에서 혈관을 나눈다.
- 다음에, 가위를 사용하여 공여체 동물의 그래프트 별도 허벅지 중간 레벨에서 근위 개별 복부 (박근 및 내측 대퇴부 근육) 및 척수 근육 그룹 (20)을 분할하는 것을 계속한다.
- 대퇴골을 가로로 쪼개다 가위를 사용하여 대퇴골 간부의 중간에서 절단.
- 이소 플루 란 과다 복용 FOL로 동물을 안락사자궁 전위에 의해 lowed. 심장 박동 및 호흡의 중단을 확인합니다.
- 주사기에 장착 된 33 G 플러싱 바늘을 사용하여 헤파린 2 ㎖ (30 IE) 감기 (4 °에 C) 식염수 사지를 플러시 (재료 표 참조).
- 각각 대퇴 정맥과 동맥에 한 폴리이 미드 커프를 배치합니다.
- 삽입 할 때까지 4 ° C에서 배양 접시와 저장소에 젖은면 거즈, 장소에 이식 랩.
2.받는 사람 운영
- 뒷다리의 제거
- 수술하기 전에 각각의 약리학 적 제제에 대한 적절한 시점에서 진통을 관리. 승인 된 동물 관리 및 사용 프로토콜 사용 부 프레 놀핀 SC 1 시간 이전에 피부 절개 0.1 ㎎ / ㎏ BW에 따라.
- 이소 플루 란 침착 도너 4 %의 이소 플루 란 기화기에 부착 된 챔버를 통해인가; 코 콘을 통해 2 %에 진정 및 마취을 유지한다. 부서를 모니터링 발가락 핀치 철수 반사를 수행절차의 개시에 앞서 마취 H.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의학 연고를 사용합니다.
- 특히, 10 % 포비돈와 뒷다리와 사타구니 준비를 외과 영역을 면도 - 요오드.
- 허벅지 중간 영역 근위 가위를 사용하여 고간 피부 절개를 원주 마우스 본체의 나머지 뒷다리를 구별하기 위해 절개를 연결한다.
- 포셉 및 마이크로 가위를 사용하여 세 가지 구조를 확인하고 대퇴 동맥, 정맥 신경을 해부와 구분합니다.
- 척추 경 혈관이 절개되면 사타구니 인대 레벨 대퇴부 혈관 클램프.
- 표면 상복부 동맥의 수준에서 말초 혈관을 잘라.
- 다음으로, 고유 뒷 리튬을 분리 근위 대퇴부의 중간 레벨에서 개별 복부 (박근 및 내측 대퇴부 근육) 및 척수 근육 그룹 (20)을 분할 계속가위를 사용하여 동물로부터받는 MB.
- 가위를 이용하여 대퇴골 축의 중간 대퇴골 횡단면.
- 절개 부위의 출혈 때문에받는 혈액 손실을 방지하기 위해 이전에 횡단 허벅지의 근육을 소작.
- 심기
- 따뜻한 식염수 (37 °에 C)와 수술 필드를 관개하고 이전에 0.3 ml의에게 따뜻한 식염수를 주입하고 수술 후 유체 손실을 최소화합니다.
- 받는 사람과 이식의 대퇴골 뼈를 정렬하고 골수로드로 20 G 척추 바늘을 사용하여 연결하여 기본 뒷다리의 정확한 해부학 적 위치를 반영하는 방법으로 이식을 놓습니다.
- Coapt 흡수성 봉합사 (6-0 Polysorb)을 이용하여 복부 및 척수 근육 그룹.
- 비 봉합 커프 기술을 사용하여 대퇴 혈관 연결; 커프 이전 용기에 장착 위에 상세히, 그라프 끝 용기의 수신자 측 당겨티. 10-0 나일론 봉합사를 사용하고 팔목에받는 용기를 해결하기 위해 원주 넥타이를 수행합니다.
- 다음 클램프를 놓습니다. 이 단계에서 시각적 커프 회전 용기의 오 회전 및 꼬임을 방지하는 최적의 위치를 확인.
- 근육받는 도너 인터페이스 뼈 단부에 특히 초점을 전기 소작을 사용 세심한 지혈을 수행한다.
- 비 흡수성 나일론 봉합사 (6-0 에틸 론)를 사용하여 피부를 닫습니다.
- 동물이 가열 램프 아래의 새장에 복구 할 수 있도록하여 정상 체온 조건을 설정합니다. 주택 시설에 반환하기 전에 적어도 4 시간 동안 정기적 인 모니터링을 계속합니다.
- 3 일간를 0.1 mg / kg SC마다 6 ~ 8 시간의 용량 부 프레 놀핀와 수술 후 진통제를 제공합니다.
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Representative Results
비 봉합 커프 기술을 사용하여, 마우스 모델에서 혈관 복합 동종 이식을 수행하는도 1에 도시 된 바와 같이 우수한 장기 이식 동물의 생존을 달성 할 수있다. 또한,이 혈관 복합 점진적 동종 이식 거부 반응의 재현 가능한 결과를 수득하는 신뢰할 수있는 방법을 나타낸다 동종 이식도 2에 도시 이미지에 의해 설명 된대로. 거절 더이 쥐 모델에서 동종 이식 거부 반응의 재현성 역학 (그림 3)을 강조받은 동물에서 얻은 조직의 H & E 조직학.
완전 H2-일치하지 않는 마우스 스트레인 조합 그림 1. 동종 이식 생존 [C57BL6 (H2K 나)에을 Balb / C (H2K d 개)]. 모든 동계 transpl 동안9 일 - 개미 (N = 10)은 장기, 치료 동종 이식 (N = 10) 급성 이내에 거부 (8)의 평균되었다 허용했다. 밴프 기준에 따라 피부 거부 3 학년은이 연구에서 전체 거부로 간주되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 임상 거부 기능 및 쥐 동소 이식 뒷다리 이식 완전 H2-일치하지 않는 [C57BL6 (H2K 나)에을 Balb / C (H2K의 D)]의 역학. (A) 임상 등급 0, (B) 임상 1 급 ( C) costimul 치료 임상 2 급, (D) 임상 3 학년, 및 (E) 임상 4 학년 거부, (F) 장기 생존 동종 이식 (POD 100)ATION 봉쇄 (antiCD40 단클론 항체 + 된 hCTLA4Ig) 기반 요법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. POD 8과에 피부와 근육 동계 이식의 (A) 및 동종 이식 (B)의 H & E 염색 POD 8 동계 이식 (C)과 동종 이식에 발바닥 피부와 근육의 H & E 염색 (D ) (스케일 바 :. 0.1 μm의) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
혈관 복합 동종 이식은 이러한 파괴적인 조직 결손의 재건을위한 상지 및 얼굴 이식으로, 기존의 재건 절차를 수정할 수있는없는 환자에 대한 올바른 치료 옵션으로 진화하고있다. 재건 미세 분야의 기술 발전뿐만 아니라 강력한 면역 억제 및 고체 장기 이식에서 면역 조절 성 치료와 광대 한 경험은 지금이 독특한 환자 인구 3,21에서 장기 이식 생존 할 수 있습니다. 그러나, 동종 이식 유지 보수 및 생존에 필요한 장기 면역 억제의 중요한 부작용은 여전히 개선이 아닌 재건 양식 3,22,23을 생명을 구하는 이들의 삶의 광범위한 응용 프로그램을 제한합니다. 또한, 고형 장기 이식 달리 VCA를 성공은 또한 운동 기능 모두 근육 정신 자극 재뿐만 아니라,하기에 이식받는 신경의 재생에 따라 적절터치 및 온도 감각에 대한 감각 요소는 기능을 회복한다. 면역 학적 관점에서 의약품 이식 모두에서와 같이, 재건 이식에서 지배적 목적은 장기간 유지 면역 (23)를 필요로하지 않고 동종의 수용을 허용 공차의 동작 상태를 실현하는 것이다. 이와 관련하여, 마우스 그대로 면역계의 특정 내성 alloantigen 달성하는 방법을 조사 이식 면역학 연구 생체 내 모델 시스템에서 메인을 나타내는 진화했다. 또한, 마우스 H2 착체 밀접 인간 MHC 복합체를 닮았다. 따라서, 근친과 유전자형 마우스 균주는 완전 동종 변형 조합에 동계에서 일치하지 alloantigen의 다양한 학위를 이용하여 관련 및 비 관련 생활과 사체 기증자 설정의 임상 시나리오를 모델링 할 수 있습니다. 형질 전환 동물 및 특정 녹아웃 동물의 가용성 추가 모든선택적인 활성화 또는 세포 나 단백질 성분의 파괴의 가능성을 제공함으로써 역할과 면역 수용과 거부의 개별 분자 경로 및 규제 메커니즘의 효과 OWS 조사. 이는 진단 및 치료제 (예., 항체) 고유 체외에 대한 마우스 시스템 개발의 폭 넓은 가용성에 의해 병렬 및 생체 내에서 24을 연구한다. 전반적으로, 이러한 측면은 쥐의 시스템 기본 이식 면역학 연구를위한 "황금 표준"을 확인합니다.
최근 Brandacher 등의 검토로 VCA에 기술 된 다양한 13,16,18,20,25,26 크고 작은 동물 14,27-29 모델이되어 있지만. 30 만 거의 실제로 기본적인 기계적인 면역 학적 연구 (16)에 대해 적용 할 수 있습니다 , 24, 30. 때문에 마우스 대퇴 동맥과 정맥의 작은 혈관 직경, 그것은 진보 된 수술과 슈퍼 마일이 필요합니다crosurgical 교육과 기술 소성을 뒷다리 이식의 핵심 구성 요소로 성공적으로 문합을 수행 할 수 있습니다. 해부학 적 구조의 세심한주의 깊은 절개가 이전에 발행 된 모델 20,31,32에서와 같이이 모델에서와 같이 비판적으로 관련이 있지만, 커프 기술은 서브 밀리미터 선박 16,25와의 봉합 문합에 비해 덜 가파른 학습 곡선을 보여주고있다 엄격한 매일 연습 몇 개월의 훈련에 달성 될 수있다. 우리의 경험을 바탕으로, 훈련받지 않은 microsurgeon 높은 성공률이 모델을 수행하기에 충분하고 신뢰할 수있는 기술을 습득하기 위해 30 -50 절차 적 시도를해야합니다. 경험과 고도로 훈련 된 microsurgeon를 들어 15-30 시도는 올라가고 있잖아은 여기에 제시된 절차의 복잡성이 더욱 이러한 접근이 제한 선박 길이 때문에 절개를 필요로한다는 사실에 의해 반사 감소이 커프 기반의 마우스 뒷다리 이식을 마스터 충분합니다. 우리는 t을 복용 발견그는 사타구니 인대에서 도너 혈관 커프 기법 적용 광범위한 추가 길이를 필요로한다는 공통적 인 개념에도 불구하고 충분한 길이를 제공 피상적 상복부 혈관 수준받는 용기. 예를 들어, 하나의 방법은 이전에 발행 오금 용기 (32)의 레벨에서 장골 혈관받는 용기 외부의 수준에서 수확 도너 용기의 필요성을 설명한다. 또한, 커프 기법, 문합을 수행하는 봉합 기술에 비해 더 적은 시간을 필요로하고 전체 동작 시간 감소를 이끈다. 숙련 된 손, 두 기증자와받는 절차는 90 분의 평균에 완료 할 수 있습니다. 이받는 사람 마취의 기간은 성공과 수술 생존을위한 중요한 결정이었다 확장하는 이전에보고 된 방법에 비해 상당한 개선이다 두 외과 의사의 필요성이 전제 조건 31-33 접근하고.또한, 문합 더 기여 출혈없이 최소한 크게 혈액 손실을 감소하고이 모델 (33)에서의 성공을위한 또 다른 결정으로 전술 한 바와 같이하여받는 사람의 유체 소생술의 필요성이 줄어 듭니다. 마지막으로, 커프 기술 11-0 마이크로 봉합 재료의 높은 비용에 비해 상당한 비용 이점 방법을 나타낸다. 따라서, 비 봉합 커프 기술 기본 프로토콜의 가장 중요한 단계를 나타낸다. 오동 나무로 우아한 연구 등. 다양한 다른 myo-를하고, 혈관 사타구니 피부 플랩을 포함 osteomyocutaneous 플랩 설명 마우스 대퇴 혈관 척추 경 (32)의 기반으로하고있다. 여기에 제시된 방법은 전체 마우스 뒷다리의 이식에 전적으로 초점을 맞추고 있지만, 제시된 원리를 쉽게 변환 등 다양한 해부학 플랩 설계에 사용될 수있다. 주목할만한는 사실 이전의 저자는 automutilation보고있는 동안 그또는이 우리의 경험에서 관찰되지 않은 수술 후 생존율 (31, 32) 중 중요한 합병증으로 이식의 자식 작용. 또한, 신속한 복구 및 공급 및 정리의 동물의 능력의 제한으로 손상은 이식 된 다리의 소성을 삽입은 최소한의받는 사람 이환율을 입 힙니다 것을 강조한다.
이 비디오 책에서 설명한 모델은 추가로 이전에 게시 된 기술에 비해 마우스 설정에 뚜렷한 장점을 소개합니다. 우리 그룹 (16)에 의해 이전에보고 된 바와 같이 무엇보다도, 커프 기술 뒷다리 동종의 동 소성 이식을 허용 내강 직경 1mm 미만으로 용기에 사용될 수있다. 이러한 접근법은 두 면역뿐만 아니라 VCA 16,25 관련된 신경 재생의 기능 연구에 결합 모델을 채용하기위한 기초를 제공한다. 신경 재생은 F에 키 중요하다재건 이식의 ield, 이러한 성공 주로 기능과 미적 결함의 복원에 의해 결정되는 손해 절약 절차이기 때문에.
뒷다리에서 발생하는 osteomyocutaneous 플랩의 이소성 인세는 외과 의사 (15)에 사용할 수있는 추가 모델입니다. 그러나이 방법에서, 이러한 손톱과 발바닥의 털이 피부 잠재적 인 관심의 구조의 제거 수술은 해부학 적으로 변경되지 않은 뒷다리 동종 이식의 동 소성 이식에 비해이 방법의 다양성을 제한한다. 이러한 구조는 자신의 손 (34)에 이식 기계적 응력을 가하는 환자 비정형 거부 프로세스의 대상으로 설명되었지만 이것은 재건 이식 특히 흥미 롭다. 혈관 뼈가 가능한 골수를 포함하고 constantl 그대로 혈관 복합 조직 이식에 본래 고유의 뼈 구성 요소이며,Y는 구성 요소와 공여체 면역계의 전구체 소스를 갱신. 이것은 조심스럽게 호스트 질병 (GVHD) 이식편 대에 대한 가능한 소스로 간주하지만,이 두 동물 모델 (35, 36)과 인간 (37)에서 관찰되지 않았습니다. 36 전임상 및 임상 연구 38-40에 나타낸 바와 같이 반대로 많은 실제로, 공여자 골수 이식 장기 이식의 조합 또는 선택된 골수 유래 세포 제품 수혈 실제로 면역 억제제의 양 (21)을 필요에 대한 유리한 효과를 나타낸다 ; 일부 프로토콜들은 심지어 면역 억제 약물 계 (41) 없이도 동작을 허용 보여준다.
받는 사람의 조합 (그림 1)과 시연으로 이식 accepta의 잘 특성화 된 패턴 -이 책으로 도시 모델과 방법론은 100 % 장기 동물 동계 기증자의 생존을 얻었다동종 변형 조합 후부 및 거부도 2 및 3에 설명 된대로. 또한, VCA에서 거부의 표시 주 대상으로 피부는 인간의 VCA에 대한 결과와 상관 관계를 거부 4 별개의 임상 시나리오의 재현 패턴을 다음에 의해 설명 된대로 의 밴프 2007 작업 분류 피부 함유, VCA (42)이 모델은 특히 번역하고. 따라서, 무엇보다도 재건 이식이 신뢰성이 높은 마우스 모델은 임상 VCA에 번역 영향 진단 및 중재 적 연구에 대한 가능성을 열어 유 전적으로 정의 근친과 유전자 변형 마우스 변종의 다양한 면역 학적 모델 시스템의 가용성을 소개합니다.
설명 된 기술을 습득을 시작하기 전에 기본 미세 수술 기술의 필요성이 모델에 제한으로 간주 될 수 있고, 그러나, 임의의 마우스 모델 미세 수술 같은 주요 장애물이다. 목(S)는이 비디오 프로토콜은 주로 혈관 복합 동종 이식 용 생체 내 뮤린 모델에서 미세 혈관 문합 대안 접근 조미 microsurgeon를 제공하는 것을 목적으로한다. 또한, 모델 혈관 손상 골수 이식 성분뿐만 아니라, 신경 재생 연구 기능 모델의 사용을 허용한다.
결론적으로 VCA의 모든 측면에 관한 기본적인 기계적으로 문뿐만 아니라 병진 연구를 열어 비 봉합 커프 기술을 이용하여 소성을 뒷다리 이식 소설 다목적 안정적인 마우스 모델을 구축.
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Acknowledgments
이 작품은 상 호 W81XWH - 13-2-0053에서, AFIRM II의 노력을 지원하기 위해 육군, 해군, NIH, 공군, VA 보건 업무에 의해 지원되었다. 미국 육군 의학 연구 수집 활동, 820 챈들러 거리, 포트 데 트릭 MD 21702-5014가 수여 및 관리 취득 사무실입니다. 의견, 해석, 결론 및 권고 사항은 저자의 것이며, 반드시 국방부에 의해 승인되지 않습니다.
저자는이 연구 기간 동안 우수한 수의학 지원 제시카 IZZI, DVM, 캐롤라인 개렛, DVM과 줄리 왓슨, DVM에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suture, 6-0 Nylon | MWI | 31849 | |
| Suture, 6-0 Polysorb | MWI | 72667 | |
| Suture, 10-0 Nylon | Aero Surgical | TK-107038 | |
| Polyimide Tubing, Size 25 | Vention Medical | 141-0023 | |
| Polyimide Tubing, Size 27 | Vention Medical | 141-0015 | |
| Microvascular Clamps (Single) | Synovis | 00396 | |
| Microvascular Clamps (Double) | Synovis | 00414 | |
| Micro-Scissors | Synovis | SAS-18 | |
| Micro-Forceps | Synovis | FRS-15 RM-8 | |
| Micro-Dilators | Synovis | FRS-15 RM-8d.1 | |
| Micro-Needledriver | Synovis | C-14 | |
| Micro-Clamp Applicator | Synovis | CAF-4 | |
| Micro-Flushing Needle | Hamilton | 10MM, 30°, 33G | |
| Lactated Ringers Solution | Fisher Scientific | NC9968051 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy. | ||
| Enrofloxacin; Baytril | Bayer Health Care | 186599 | |
| Heparin | Obtained from hosptial pharmacy |
References
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