Summary
Ce modèle de roman pour arrière orthotopique branche transplantation chez la souris, l'application d'une technique de brassard non-suture pour anastomose super-microvasculaire, fournit un outil puissant pour la recherche immunologique mécanique in vivo concernant une allotransplantation composite vascularisée (VCA).
Protocol
Toutes les expériences ont été menées en conformité avec le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé (NIH) et ont été approuvés par le Comité de l'Université Johns Hopkins animal soin et l'utilisation (JHUACUC). Les procédures spécifiques ont été réalisées dans le cadre du protocole de MO13M108 de ACUC approuvé.
Opération 1. des donateurs
- Administrer une analgésie au point de temps approprié pour chaque formulation pharmacologique avant la chirurgie. Conformément à la protection des animaux et l'utilisation approuvée protocole utilisé 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine sous-cutanée 1 heure avant l'incision de la peau.
- Sedate le donateur à l'isoflurane appliquée à travers une chambre attachée à un vaporisateur isoflurane à 4%; maintenir la sédation et anesthésie à 2% grâce à un cône de nez. Effectuer orteil retrait de pincement réflexion pour contrôler la profondeur de l'anesthésie avant l'ouverture de la procédure.
- Porter des masques, des blouses d'isolation jetables et des gants.
- Raser les ar chirurgicaleEA, en particulier le membre postérieur et à l'aine, et préparation avec 10% Povidone - iode.
- Utilisez un drap de champ stérile, instruments autoclave et d'un microscope à fort grossissement (40X).
- Faire l'aine incision de la peau avec des ciseaux proximale à la zone mi-cuisse et la circonférence connecter l'incision à la démarcation de la patte postérieure du reste du corps de la souris.
- Identifier et disséquer l'artère fémorale, la veine et le nerf. Séparer les trois structures à l'aide de pinces et de micro-ciseaux.
- Une fois que le pédicule est disséqué diviser les vaisseaux au niveau du ligament inguinal au moyen de micro ciseaux.
- Ensuite, continuer à diviser les différents ventrales (gracilis et muscles de la cuisse médiale) et les groupes de muscles dorsaux 20 de manière proximale au niveau de la mi-cuisse pour séparer le greffage de l'animal donneur avec des ciseaux.
- Transect fémur et couper au milieu de la diaphyse fémorale à l'aide de ciseaux.
- Euthanasier des animaux par fol surdosage isofluranemugissaient par dislocation cervicale. Confirmez cessation des battements du cœur et de la respiration.
- Rincer la branche avec 2 ml héparinisés (30 IE) froide (4 ° C) une solution saline en utilisant une aiguille de calibre 33 de chasse monté sur une seringue (voir tableau des matériaux).
- Placer un brassard de polyimide sur la veine fémorale et l'artère, respectivement.
- Enveloppez greffe dans de la gaze de coton humide, placer dans un plat de Pétri et conserver à 4 ° C jusqu'à ce médaillon.
2. Bénéficiaire Opération
- L'enlèvement de la patte postérieure
- Administrer une analgésie au point de temps approprié pour chaque formulation pharmacologique avant la chirurgie. Conformément à la protection des animaux et l'utilisation approuvée protocole utilisé 0,1 mg / kg de poids corporel de la buprénorphine SC 1 heure avant l'incision de la peau.
- Sedate le donateur à l'isoflurane appliquée à travers une chambre attachée à un vaporisateur isoflurane à 4%; maintenir la sédation et anesthésie à 2% grâce à un cône de nez. Effectuer orteil retrait de pincement réflexion pour surveiller le depth de l'anesthésie avant l'ouverture de la procédure.
- Utilisez pommade vétérinaire sur les yeux de la souris pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
- Raser la zone chirurgicale, en particulier le membre postérieur et à l'aine et préparation avec 10% Povidone - iode.
- Faire l'aine incision de la peau avec des ciseaux proximale à la zone mi-cuisse et la circonférence connecter l'incision à la démarcation de la patte postérieure du reste du corps de la souris.
- Identifier et disséquer l'artère fémorale, la veine et le nerf et séparer les trois structures à l'aide de pinces et de micro-ciseaux.
- Une fois que le pédicule est disséqué, serrer les vaisseaux fémoraux au niveau du ligament inguinal.
- Couper les vaisseaux distale au niveau de l'artère épigastrique superficielle.
- Ensuite, continuer à diviser les différents ventrales (gracilis et muscles de la cuisse médiale) et les groupes de muscles dorsaux 20 de manière proximale au niveau de la mi-cuisse pour séparer l'arrière li nativemb des animaux receveurs avec des ciseaux.
- Transect du fémur dans le milieu de la diaphyse fémorale à l'aide de ciseaux.
- Cautériser muscles de la cuisse précédemment sectionnés pour prévenir les saignements du site de dissection et donc destinataire perte de sang.
- Implantation
- Minimiser la perte de liquide par l'irrigation du champ opératoire avec une solution saline chaude (37 ° C) et l'injection de 0,3 ml de solution saline chaude avant et après l'opération.
- Placez la greffe d'une manière qui reflète la position anatomique précise de la patte arrière natif en alignant le fémur du destinataire et la greffe et de les connecter en utilisant une aiguille spinale 20 G comme une tige intramédullaire.
- Coapt les Groupes musculaires ventrales et dorsales en utilisant du matériel de suture absorbable (6-0 Polysorb).
- Connecter les vaisseaux fémoraux en utilisant la technique du brassard non-suture; en détail, tirer du côté du destinataire du navire au cours des poignets montés préalablement sur le navire extrémités du graft. Utilisez un Nylon suture 10-0 et effectuer une cravate circonférentielle de fixer le navire bénéficiaire sur le brassard.
- libérer Suivant les pinces. A ce stade, vérifier visuellement la rotation de la coiffe et un positionnement optimal pour empêcher une mauvaise rotation et de déformation des récipients.
- Effectuer hémostase méticuleuse utilisant cautérisation électro avec un accent particulier sur l'interface des donateurs bénéficiaire musculaire et les extrémités osseuses.
- Fermez la peau en utilisant des sutures en nylon non résorbables (6-0 Ethilon).
- Établir des conditions normothermiques en permettant à l'animal dans sa cage récupérer sous une lampe chauffante. Poursuivre la surveillance régulière pendant au moins 4 heures avant de le retourner à l'installation de logements.
- Une analgésie post-opératoire avec la buprénorphine à la dose de 0,1 mg / kg SC toutes les 6-8 heures pendant 3 jours.
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Representative Results
Effectuer allotransplantation composite vascularisée dans un modèle de souris à l'aide d'une technique non-suture manchon permet d'obtenir une excellente et de longue greffon à long terme et des animaux survie comme le montre la Figure 1. De plus, il représente une méthode fiable pour l'obtention de résultats reproductibles de rejet d'allogreffe progressive de composite vascularisée allotransplantation tel que documenté par les images de la figure 2. H & E histologie des tissus obtenus à partir d'animaux qui subissent le rejet souligne en outre la dynamique reproductibles de rejet d'allogreffe dans ce modèle murin (figure 3).
Figure 1. allogreffe de survie dans une souris Combinaison de souche entièrement H2-dépareillés [Balb / c (H2K d) dans C57BL6 (H2K b)]. Bien que tous Transpl syngéniquefourmis (n = 10) ont été acceptés à long terme, les allogreffes non traités (n = 10) ont été vivement rejetées à l'intérieur et en moyenne de 8 - 9 jours. Peau rejet de grade 3 selon les critères de Banff a été considérée comme pleine rejet dans cette étude. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. cliniques Caractéristiques et Dynamique d'un entièrement H2-dépareillés [Balb / c (H2K d) dans C57BL6 (H2K B)] murin orthotopique membre postérieur de rejet de greffe. (A) clinique de grade 0, (B) Clinical Grade 1, ( C) traitée avec un costimul Clinical grade 2, (D) Niveau clinique 3, et (E) Clinical grade 4 rejet, (F) à long terme survivant d'allogreffe (POD 100)blocus ation (antiCD40 mAb + CTLA4Ig) régime basé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. coloration H & E de peau et le muscle dans un isogreffe (A) et allogreffe (B) sur POD 8 ainsi que H & E taches sur la peau Footpad et musculaire dans un isogreffe (C) et allogreffe sur POD 8 (D ) (barre d'échelle:. 0,1 um) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Vascularisée composite allotransplantation, comme extrémité supérieure et le visage transplantation pour la reconstruction de défauts tissulaires dévastatrices, a évolué comme une option de traitement valable pour les patients non modifiables de procédures de reconstruction classiques. Les progrès techniques dans le domaine de la microchirurgie reconstructive ainsi que d'une vaste expérience avec immunosuppresseur puissant et thérapies modulatrices immunitaires dans la transplantation d'organes solides, permet désormais la survie de l'allogreffe à long terme dans cette population de patient unique 3,21. Cependant, les effets secondaires importants de l'immunosuppression à long terme nécessaires à l'entretien d'allogreffe et la survie limitent encore l'application plus large de ces amélioration de la vie, mais sauver des vies pas les modalités de reconstruction 3,22,23. En outre, le succès de OCV contrairement aux transplantations d'organes solides dépend aussi de la régénération rapide de nerfs bénéficiaires dans l'allogreffe de re-innervent les muscles de la fonction motrice, ainsi quecomposants sensoriels pour le toucher et la sensation de température de retrouver la fonction. Du point de vue immunologique, comme dans l'ensemble de la médecine de transplantation, l'objectif primordial dans la transplantation reconstructive est de parvenir à un état de tolérance opérationnelle permettant l'acceptation d'une allogreffe sans avoir besoin de long terme immunosuppression de maintenance 23. À cet égard, la souris a évolué pour représenter le principal système de modèle in vivo dans la recherche en immunologie de la transplantation d'étudier les moyens de parvenir à un alloantigène tolérance spécifique dans un système immunitaire intact. En outre, le complexe de H2 de la souris ressemble étroitement au complexe du CMH humain. Ainsi, les souches consanguines et génotypés souris permettent de modéliser des scénarios cliniques de milieux de vie et de donneur cadavérique connexes et non connexes en utilisant divers degrés de alloantigène désadaptation d'un syngénique à une combinaison de souche entièrement allogénique. La disponibilité des animaux transgéniques et des animaux spécifiques de finale en outre tousenquête ux des rôles et des effets de voies moléculaires individuels et des mécanismes de régulation sur l'acceptation immunitaire et le rejet en offrant la possibilité d'activation sélective ou l'épuisement des cellules ou de composants protéiques. Ce va de pair avec une grande disponibilité des agents diagnostiques et thérapeutiques (par ex., Des anticorps développés) unique pour le système de la souris in vitro et pour des études in vivo 24. Dans l'ensemble, ces aspects rendent le système murin le «gold standard» pour la recherche fondamentale en immunologie de la transplantation.
Bien qu'il y ait eu plusieurs petites 13,16,18,20,25,26 et grands animaux 14,27-29 modèles décrits pour VCA comme l'a récemment examiné par Brandacher et al. 30 seulement très peu sont réellement applicable pour la recherche immunologique mécaniste de base 16 , 24,30. En raison de la faible diamètre de vaisseau de l'artère fémorale et la veine de la souris, elle nécessite de pointe chirurgicale et super-mila formation et les compétences pour effectuer crosurgical anastomose succès en tant que composant clé de orthotopique transplantation des membres postérieurs. Alors que la dissection minutieuse et attentive des structures anatomiques est aussi critique pertinente dans ce modèle comme dans les modèles déjà publiés 20,31,32, la technique du brassard a montré une courbe d'apprentissage moins raide par rapport à suture anastomose des vaisseaux sous-millimétriques 16,25 et peut être réalisé en quelques mois de formation à la pratique quotidienne rigoureuse. Basé sur notre expérience, un microsurgeon inexpérimenté devra 30 -50 tentatives procédurales d'acquérir des compétences suffisantes et fiables pour effectuer ce modèle avec des taux de réussite élevés. Pour la microsurgeon expérimenté et hautement qualifié de 15 - 30 tentatives devraient suffire à maîtriser cette arrière de la souris membre greffe sur la base de la coiffe-model.The réduit la complexité de la procédure présentée ici est également reflété par le fait que cette approche nécessite la longueur du navire limitée et donc dissection. Nous avons trouvé en prenant til navires donneurs au ligament inguinal et les vaisseaux receveurs au niveau des vaisseaux épigastriques superficielles fournit une longueur suffisante, en dépit de la notion commune que la technique du brassard nécessite une longueur supplémentaire pour être applicable. Par exemple, une approche déjà publié décrit la nécessité de navires récolte donateurs au niveau de l'extérieur vaisseaux iliaques et des navires de bénéficiaires au niveau des vaisseaux poplités 32. En outre, avec la technique du brassard, d'effectuer l'anastomose nécessite moins de temps par rapport à la technique de suture et conduit à un temps total de fonctionnement réduite. Dans des mains expérimentées, les deux procédures donateurs et bénéficiaires peut être complété en une moyenne de 90 min. Cela représente une amélioration significative par rapport aux méthodes précédemment rapportés dans lesquels la prolongation durée de l'anesthésie de destinataire a été un facteur déterminant pour le succès et la survie périopératoire; faisant la nécessité d'un deux-chirurgien approche une condition 31-33.En outre, peu ou pas de saignement de l'anastomose contribue en outre à une réduction significative de la perte de sang et réduit ainsi la nécessité d'une réanimation liquidienne des bénéficiaires, comme décrit précédemment comme un autre facteur déterminant pour le succès de ce modèle 33. Enfin, la technique d'un procédé brassard représente un avantage de coût significatif par rapport aux coûts élevés des matières micro-11-0 suture. Ainsi, la technique de suture non brassard représente l'étape la plus critique du protocole sous-jacent. Dans une étude élégante par Tung et al., Divers myo différent et volets ostéomyocutané dont un vascularisé lambeau de peau de l'aine ont été décrits en fonction hors du pédicule souris navire fémorale 32. Alors que la méthode présentée ici se concentre exclusivement sur la transplantation de l'ensemble du membre postérieur de la souris, les principes présentés peuvent être facilement traduits et utilisés dans divers autres modèles de volets anatomiques. Il convient de noter le fait que, bien que les auteurs précédents signalent automutilationou autophagie de la greffe comme une complication significative au cours de la survie post-opératoire 31,32 cela n'a pas été observée dans notre expérience. En outre, la récupération rapide et dépréciation limitée de la capacité de l'alimentation et le toilettage de l'animal souligne que l'encart orthotopique de la jambe transplanté inflige minime morbidité bénéficiaire.
Le modèle décrit dans cette publication de vidéo présente en outre des avantages distincts au réglage de la souris par rapport aux techniques déjà publiés. Tout d'abord, comme indiqué précédemment par notre groupe 16, la technique du brassard peut être utilisé dans les bateaux avec un diamètre de lumière inférieur à 1 millimètre, ce qui permet à la transplantation orthotopique d'un membre allogreffe arrière. Cette approche fournit la base pour l'emploi de ce modèle combiné à la fois immunologiques ainsi que des études fonctionnelles de la régénération nerveuse liée à VCA 16,25. La régénération des nerfs est d'une importance clé pour la fDOMAINE DE transplantation reconstructive, car ce sont des procédures d'économie non-vie dont le succès est principalement déterminée par la restauration des défauts fonctionnels et esthétiques.
L'encart de hétérotopique d'un volet ostéomyocutané provenant de la patte arrière est un modèle supplémentaire à la disposition du chirurgien 15. Dans cette approche, toutefois, l'ablation chirurgicale des structures d'intérêt potentiel, comme les ongles et la peau glabre de la patte, limite la polyvalence de cette méthode par rapport à la transplantation orthotopique d'un anatomiquement inchangé membres postérieurs allogreffe. Ceci est d'un intérêt particulier dans la transplantation de reconstruction étant donné que ces structures ont été décrites en tant que cible de processus de rejet chez des patients atypiques infligeant des contraintes mécaniques à leurs allogreffes à main 34. Intrinsèquement unique d'une allogreffe de tissu composite vascularisée est la composante de l'os, que l'os viable vascularisé contient la moelle osseuse et est un constantly source de renouvellement des composants et des précurseurs du système immunitaire du donneur. Pendant ce temps prudemment considéré comme une source possible de maladie du greffon contre l'hôte (GvHD), cela n'a pas été observée dans les deux modèles animaux 35,36 ainsi que les humains 37. Bien au contraire en fait, comme le montre la précliniques 36 cliniques et études 38-40, la combinaison d'une transplantation d'organe avec une transplantation de moelle donneur d'os ou de la transfusion d'os produits sélectionnés de cellules dérivées de moelle représente réellement des effets avantageux en ce qui concerne la quantité d'immunosuppression nécessaire 21 ; certains protocoles ont même fait preuve de tolérance opérationnelle sans la nécessité d'une immunosuppression basée sur la drogue 41.
Le modèle et la méthodologie montre cette publication ont donné survie de 100% à long terme animal donneur syngénique - combinaisons de bénéficiaires (figure 1), ainsi que démontré quelques motifs bien caractérisés de greffe acceptance et de rejet dans les combinaisons de souches allogéniques comme indiqué dans les figures 2 et 3. En outre, la peau comme une cible primaire visible de rejet dans VCA, suit un modèle reproductible de 4 scénarios cliniques distinctes de rejet en corrélation avec ceux de VCA humaine tel que décrit par la classification de travail Banff 2007 VCA 42, ce qui rend ce modèle particulièrement traduisible contenant peau. Ainsi, ce modèle de souris très fiable pour la transplantation reconstructive surtout introduit la disponibilité d'un système modèle polyvalent immunologique de souches de souris consanguines et transgéniques génétiquement définies qui ouvre des possibilités pour des études de diagnostic et d'intervention ayant une incidence sur translation VCA clinique.
Le besoin de compétences de microchirurgie de base avant de se lancer sur la maîtrise de la technique décrite peut être considéré comme une limitation à ce modèle, cependant, il est le même obstacle principal à tout modèle de microchirurgie de la souris. Jeus, ce protocole vidéo est principalement destinée à fournir le microsurgeon assaisonné avec une approche alternative à microvasculaire anastomose dans une souris modèle in vivo pour allotransplantation composite vascularisée. En outre, le modèle permet à la transplantation d'un composant de moelle osseuse vascularisée intact, ainsi que l'utilisation d'un modèle fonctionnel de la recherche de régénération nerveuse.
En conclusion, nous avons établi un roman, polyvalent, et le modèle de la souris fiable pour arrière orthotopique branche transplantation en utilisant une technique de manchette non-suture qui ouvre la porte à mécaniste de base, ainsi que la recherche translationnelle en rapport avec tout aspect de VCA.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'armée, la marine, NIH, Armée de l'Air, VA et des affaires de santé pour soutenir l'effort AFIRM II, sous Award No. W81XWH-13-2-0053. L'armée américaine Research Acquisition activité médicale, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21.702 à 5014 est le bureau d'acquisition attribution et l'administration. Les opinions, les interprétations, conclusions et recommandations sont celles de l'auteur et ne sont pas nécessairement ceux proposés par le ministère de la Défense.
Les auteurs tiennent à remercier Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM et Julie Watson, DVM pour leur excellent soutien vétérinaire au cours de cette étude.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suture, 6-0 Nylon | MWI | 31849 | |
| Suture, 6-0 Polysorb | MWI | 72667 | |
| Suture, 10-0 Nylon | Aero Surgical | TK-107038 | |
| Polyimide Tubing, Size 25 | Vention Medical | 141-0023 | |
| Polyimide Tubing, Size 27 | Vention Medical | 141-0015 | |
| Microvascular Clamps (Single) | Synovis | 00396 | |
| Microvascular Clamps (Double) | Synovis | 00414 | |
| Micro-Scissors | Synovis | SAS-18 | |
| Micro-Forceps | Synovis | FRS-15 RM-8 | |
| Micro-Dilators | Synovis | FRS-15 RM-8d.1 | |
| Micro-Needledriver | Synovis | C-14 | |
| Micro-Clamp Applicator | Synovis | CAF-4 | |
| Micro-Flushing Needle | Hamilton | 10MM, 30°, 33G | |
| Lactated Ringers Solution | Fisher Scientific | NC9968051 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy. | ||
| Enrofloxacin; Baytril | Bayer Health Care | 186599 | |
| Heparin | Obtained from hosptial pharmacy |
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