Summary
Dieses neuartige Modell für orthotoper hinteren Gliedmaßen Transplantation in der Maus, eine nicht-Naht Manschette Technik für supermikrovaskulären Anastomose Anwendung bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für die in-vivo-mechanistisch zu vaskularisiert Verbund Allotransplantationen bezogene immunologische Forschung (VCA).
Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health (NIH) durchgeführt und wurden von der Johns Hopkins University Animal Care und Verwenden Committee (JHUACUC) zugelassen. Die spezifischen Verfahren wurden im Rahmen der genehmigten ACUC Protokoll MO13M108 durchgeführt.
1. Spender Betrieb
- Verwalten Analgesie an der geeigneten Zeitpunkt für jeden pharmakologischen Formulierung vor der Operation. Gemäß dem genehmigten Tierpflege und Verwendung Protokoll Verwendung 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin subkutan 1 Stunde vor dem Hautschnitt.
- Sedate der Spender mit Isofluran durch eine Kammer aufgebracht auf einen Isofluran Verdampfer bei 4% befestigt; Sedierung und Anästhesie bei 2% durch ein Nasenkegel halten. Führen toe pinch Entzugs Reflexion der Narkosetiefe vor der Einleitung des Verfahrens zu überwachen.
- Tragen Masken, Einweg-Isolation Kleider und Handschuhe.
- Rasieren Sie die chirurgische area, insbesondere der hinteren Gliedmaßen und Leistengegend und die Vorbereitungs mit 10% Povidon - Jod.
- Verwenden Sie einen sterilen Bereich drapieren, autoklaviert Instrumente und eine hohe Vergrößerung Mikroskop (40x).
- Machen Leiste Hautschnitt Schere proximal bis zur Mitte des Oberschenkels mit und in Umfangsrichtung verbinden den Schnitt der hinteren Gliedmaßen aus dem Rest der Maus Körper abzugrenzen.
- Identifizieren und die Oberschenkelarterie, Vene und Nerv sezieren. Trennen Sie alle drei Strukturen mit einer Pinzette und Mikro-Schere.
- Sobald der Gefäßstiel seziert wird teilen die Schiffe auf dem Niveau des Leistenbandes mittels Micro-Schere.
- Mit einer Schere nächstes weiterhin die einzelnen ventral (gracilis und mediale Oberschenkelmuskulatur) und Rückenmuskelgruppen 20 proximal auf dem Niveau der Mitte des Oberschenkels zu unterteilen, das Transplantat aus dem Spendertier zu trennen.
- Durchschneiden den Oberschenkelknochen und schneiden in der Mitte des Oberschenkelschaft mit einer Schere.
- Euthanize Tier von Isofluran Überdosis followed durch Genickbruch. Bestätigen Einstellung von Herzschlag und Atmung.
- Spülen Sie das Glied mit 2 ml Heparin (30 IE) Kälte (4 ° C) Kochsalzlösung unter Verwendung einer 33 G Spülung Nadel auf einer Spritze befestigt (siehe Materialien Tabelle).
- Legen Sie eine Polyimid-Manschette auf die Oberschenkelvene und Arterie, respectively.
- Wickeln Transplantat in nassen Baumwollgewebe, in Petrischale und lagern bei 4 ° C bis zum Einsatz.
2. Empfänger Betrieb
- Entfernen des Hind Gliedmaßen
- Verwalten Analgesie an der geeigneten Zeitpunkt für jeden pharmakologischen Formulierung vor der Operation. Gemäß dem genehmigten Tierpflege und Verwendung Protokoll Verwendung 0,1 mg / kg Körpergewicht von Buprenorphin SC 1 Stunde vor dem Hautschnitt.
- Sedate der Spender mit Isofluran durch eine Kammer aufgebracht auf einen Isofluran Verdampfer bei 4% befestigt; Sedierung und Anästhesie bei 2% durch ein Nasenkegel halten. Führen Zehe Prise Rückzug Reflexion der Abteilung zu überwachenh der Anästhesie vor der Einleitung des Verfahrens.
- Verwenden Veterinär Salbe auf die Augen der Maus Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
- Rasieren Sie die OP-Bereich, insbesondere der hinteren Gliedmaßen und Leistengegend und prep mit 10% Povidon - Jod.
- Machen Leiste Hautschnitt Schere proximal bis zur Mitte des Oberschenkels mit und in Umfangsrichtung verbinden den Schnitt der hinteren Gliedmaßen aus dem Rest der Maus Körper abzugrenzen.
- Identifizieren und die Oberschenkelarterie, Vene und Nerv sezieren und trennen alle drei Strukturen mit einer Pinzette und Mikro-Schere.
- Sobald der Gefäßstiel seziert wird, klemmen die Oberschenkelgefäße auf der Ebene des Leistenbandes.
- Schneiden Sie die Gefäße distal auf der Ebene der oberflächlichen Oberbauchschlagader.
- Danach setzen die einzelnen ventralen (gracilis und medialen Oberschenkelmuskulatur) und Rückenmuskelgruppen 20 proximal auf Höhe der Mitte des Oberschenkels zu unterteilen die native Hinter li zu trennenmb aus den Empfängertieren mit einer Schere.
- Durchschneiden den Oberschenkelknochen in der Mitte des Oberschenkelschaft mit einer Schere.
- Cauterize zuvor durchtrennten Oberschenkelmuskulatur Entlüften der Präparation Website zu verhindern und somit Verlust Empfängerblut.
- Implantation
- Minimieren des Flüssigkeitsverlusts durch das Operationsfeld mit warmer Kochsalzlösung Bewässerung (37 ° C) und 0,3 ml warmer Kochsalzlösung Injektion vor und nach der Operation.
- Legen Sie das Transplantat auf eine Weise, die genaue anatomische Lage des Mutter hinteren Gliedmaßen reflektiert durch den Oberschenkelknochen des Empfängers ausgerichtet und das Transplantat und verbinden sie eine 20 G Spinalnadel als Markstab verwenden.
- Coapt die ventralen und dorsalen Muskelgruppen resorbierbares Nahtmaterial (6-0 Polysorb).
- Schließen Sie die Oberschenkelgefäße die nicht-Naht Manschette Technik; im Detail, die Empfängerseite des Schiffes ziehen über vorher die Handschellen an der Gefäßenden der graf montiertt. Verwenden Sie einen 10-0 Nylonfaden und führen eine umlaufende Bindung der übernehmenden Schiff auf der Manschette zu befestigen.
- Release im nächsten die Klammern. In diesem Stadium visuell Manschette Rotation und optimale Positionierung überprüfen mis-Rotation und Abknicken der Gefäße zu verhindern.
- Führen sorgfältige Blutstillung mittels Elektrokauter mit einem besonderen Fokus auf den Muskel Empfänger Geberschnittstelle und den Knochenenden.
- Schließen Sie die Haut mit nicht-resorbierbaren Nylonnähten (6-0 Ethilon).
- Stellen normothermic Bedingungen, indem man das Tier in seinem Käfig unter einer Wärmelampe zu erholen. Weiter regelmäßige Überwachung für mindestens 4 Stunden, bevor es mit dem Gehäuse Anlage zurück.
- Geben postoperative Analgesie mit Buprenorphin in einer Dosis von 0,1 mg / kg SC alle 6-8 Stunden für 3 Tage.
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Representative Results
Darstellende vaskularisierten Verbund Allotransplantation in einem Maus-Modell eine nicht-Nahtmanschette Technik ermöglicht eine ausgezeichnete und langfristige Transplantat und das Überleben der Tiere zu erzielen, wie in 1 gezeigt ist. Darüber hinaus ist es, ein zuverlässiges Verfahren zum Erhalten reproduzierbarer Ergebnisse der schrittweisen Transplantatabstoßung in vaskularisierten Verbund darstellt Allotransplantation wie durch die Bilder dokumentiert in Fig. 2 dargestellten H & E Histologie von Geweben von Tieren, unterzogen Ablehnung weiteren reproduzierbaren Dynamik der Transplantatabstoßung betont in diesem Mausmodell (Abbildung 3).
Abbildung 1. Allograft Überleben in einer Voll H2-fehlangepasst Mausstammkombination [Balb / c (H2K d) in C57BL6 (H2K b)]. Während alle syngenen Transpl9 Tage - Ameisen (n = 10) wurden langfristige, unbehandelt Transplantate (n = 10) wurden akut abgelehnt innerhalb und durchschnittlich 8 angenommen. Haut Ablehnung Grad 3 nach Banff Kriterien wurde voller Ablehnung in dieser Studie nicht berücksichtigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Klinische Ablehnung Eigenschaften und Dynamik eines Voll H2-fehlangepasst [Balb / c (H2K d) in C57BL6 (H2K b)] Murine Orthotopische Hind Gliedmaßen-Transplantation. (A) Klinische Grad 0, (B) Clinical Grade 1, ( C) Klinische Grade 2, (D) Clinical Grade 3 und (E) Klinische Grad 4 Ablehnung, (F) langfristig überlebenden Allograft (POD 100) mit einem costimul behandeltation Blockade (antiCD40 mAb + CTLA4Ig) basierten Regime. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. H & E-Färbung von Haut und Muskeln in einem syngenen Transplantation (A) und allogene Transplantation (B) auf POD 8 sowie H & E-Färbung der Footpad Haut und Muskeln in einem syngenen Transplantation (C) und allogene Transplantation auf POD 8 (D ) (Maßstab:. 0,1 um) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Vaskularisierte Verbund Allotransplantation, wie der oberen Extremitäten und im Gesicht Transplantation für den Wiederaufbau der verheerenden Gewebedefekten hat sich als eine gültige Behandlungsmöglichkeit entwickelt für Patienten, die nicht abänderbar zu herkömmlichen rekonstruktive Eingriffe. Der technische Fortschritt im Bereich der rekonstruktiven Mikrochirurgie sowie eine langjährige Erfahrung mit immunsuppressiven und immunmodulatorischen Therapien im Bereich der Organtransplantation, ermöglicht jetzt langfristige Transplantatüberleben in dieser einzigartigen Patientenpopulation 3,21. Erhebliche Nebenwirkungen von dieser Lebens erforderlich Langzeitimmunsuppression begrenzen jedoch für Allograft Wartung und das Überleben immer noch die breitere Anwendung zu verbessern, aber nicht lebensrettende rekonstruktive Modalitäten 3,22,23. Darüber hinaus hängt der Erfolg der VCAs im Gegensatz zu soliden Organtransplantationen auch auf rechtzeitige Regeneration des Empfängers Nerven in das Allotransplantat erneut Anregen sowohl Muskeln für Motorik, sowiesensorische Komponenten für Touch und Temperaturempfindung auf Funktion wiederzuerlangen. Aus immunologischer Sicht wie in allen der Transplantationsmedizin, ist das übergeordnete Ziel in der rekonstruktiven Transplantation einen Zustand der Betriebs Toleranz für die Annahme eines Allograft ohne die Notwendigkeit einer langfristigen Wartungs Immunsuppression 23 ermöglicht zu erreichen. In diesem Zusammenhang hat die Maus, um den Haupt in vivo Modellsystem in der Transplantationsimmunologie Forschung darstellen entwickelte Möglichkeiten, in einem intakten Immunsystem zu erreichen Alloantigen spezifische Toleranz zu untersuchen. Darüber hinaus gleicht die Maus H2-Komplex beobachtet die Menschen Komplex MHC. So Inzucht und Genotypisierung erlauben Mausstämmen durch den Einsatz von verschiedenen Graden der Alloantigen klinischen Szenarien von verwandten und nicht verwandten Lebens- und Leichenspender Einstellungen zur Modellierung von einem syngenen zu einer voll allogenen Stammkombination unpassende. Die Verfügbarkeit von transgenen Tieren und spezifischen Knockout Tiere zusätzlich alleows Untersuchung der Rolle und Auswirkungen von einzelnen molekularen Signalwege und Regulationsmechanismen auf Immun Akzeptanz und Ablehnung durch die Möglichkeit der selektiven Aktivierung oder Erschöpfung der Zelle oder Proteinkomponenten bereitstellt. Dies wird durch eine breite Verfügbarkeit von diagnostischen und therapeutischen Mitteln parallel (z. B. Antikörper) einzigartig für das Maussystem entwickelten für in vitro und in vivo untersucht 24. Insgesamt machen diese Aspekte des murinen System der "Goldstandard" für die Grundtransplantationsimmunologie Forschung.
Obwohl es für VCA beschriebenen verschiedenen kleinen 13,16,18,20,25,26 und Großtier 14,27-29 Modelle gewesen, wie vor kurzem von Brandacher überprüft et al. 30 nur sehr wenige sind tatsächlich anwendbar für grundlegende mechanistische immunologischen Forschung 16 , 24,30. Aufgrund der geringen Gefäßdurchmesser der Maus Femoralarterie und Vene erfordert es fortgeschrittene chirurgische und super-microsurgical Ausbildung und Fähigkeiten erfolgreich Anastomose als Schlüsselkomponente von orthotoper hinteren Gliedmaßen Transplantation durchzuführen. Während sorgfältige und schonende Präparation der anatomischen Strukturen wie kritisch relevant ist in diesem Modell als in früher veröffentlichten Modelle 20,31,32 hat die Manschette Technik eine weniger steile Lernkurve verglichen gezeigt Naht Anastomose von Sub-Millimeter-Gefäße 16,25 und kann in ein paar Monaten Training mit strengen täglichen Praxis erreicht werden. Basierend auf unserer Erfahrung, wird ein ungeübter Mikrochirurgen brauchen 30 -50 Verfahrens Versuche ausreichende und zuverlässige Fähigkeiten zu erwerben, dieses Modell mit Raten hoch Erfolg durchzuführen. Für den erfahrenen und gut ausgebildeten Mikrochirurgen 15 - 30 Versuche sollten ausreichen, um diese Manschette-basierte Maushinterbein Transplantation Modells Komplexität der hier vorgestellten Verfahren reduziert zu meistern weiter durch die Tatsache widerspiegelt, dass dieser Ansatz begrenzte Fahrzeuglänge und damit Dissektion erfordert. Wir fanden Einnahme ter Spender Schiffe auf dem Leistenband und die aufnehmenden Gefäße auf der Ebene der oberflächlichen epigastrischen Gefäße ausreichende Länge bietet, trotz der gemeinsamen Vorstellung, dass die Manschette Technik umfangreiche zusätzliche Länge erfordert anwendbar zu sein. Beispielsweise beschreibt die zu einem früheren Zeitpunkt veröffentlicht Ansatz, um die Notwendigkeit zu ernten Spendergefäße auf der Ebene der Außen Iliakalgefäße und Aufnahmegefäße auf der Ebene der Poplitealgefäße 32. Darüber hinaus mit der Manschette Technik erfordert die Anastomose an den Nahttechnik verglichen kürzerer Zeit durchführen und führt zu einer reduzierten Gesamtbetriebszeit. In erfahrenen Händen, können Spender und Empfänger Verfahren in einem Durchschnitt von 90 Minuten abgeschlossen sein. Dies ist eine signifikante Verbesserung gegenüber früher berichteten Verfahren, bei denen die Dauer des Empfängers Anästhesie verlängert ein entscheidender Faktor für den Erfolg und perioperative Überleben war; so dass die Notwendigkeit einer Zwei-Chirurg eine Voraussetzung 31-33 nähern.Darüber hinaus minimal zu keinen von den trägt weiter Anastomose zu deutlich reduzierten Verlust Blut Blutungen und verringert dadurch die Notwendigkeit einer Flüssigkeitszufuhr der Empfänger, wie in diesem Modell 33 früher als eine andere Determinante für den Erfolg beschrieben. Schließlich stellt die Manschette Technik ein Verfahren mit einem erheblichen Kostenvorteil im Vergleich zu den hohen Kosten von 11-0 Mikronahtmaterial. Somit stellt die Nicht-Nahtmanschette Technik der wichtigste Schritt des zugrunde liegenden Protokolls. In einer eleganten Studie von Tung et al., Verschiedene Muskel- und osteomyocutaneous Klappen einschließlich einer gefäß Leiste Hautlappen beschrieben wurden der Maus Oberschenkelgefäß Stiel 32 basiert. Während die hier vorgestellte Methode ausschließlich auf die Transplantation des gesamten Maushinterbein konzentriert, können die vorgestellten Prinzipien leicht auf verschiedene andere anatomische Klappe Designs übersetzt und eingesetzt werden. Bemerkenswert ist die Tatsache, dass während frühere Autoren berichten automutilationoder Autophagie des Transplantats als eine bedeutende Komplikation während der postoperativen Überlebens 31,32 dies nach unserer Erfahrung nicht beobachtet wurde. Darüber hinaus unterstreicht eine schnelle Wiederherstellung und begrenzte Beeinträchtigung des Tierfähigkeit der Fütterung und Pflege, dass die orthotoper Einsatz des transplantierten Bein nur minimal Empfänger Morbidität zufügt.
Das Modell in diesem Video Veröffentlichung beschrieben stellt zusätzlich deutliche Vorteile für die Mauseinstellung im Vergleich zu früher veröffentlichten Techniken. In erster Linie, wie zuvor von unserer Gruppe 16 gemeldet, kann die Manschette Technik mit einem Lumendurchmesser von weniger als 1 Millimeter in Behältern eingesetzt werden, beispiels orthotope Transplantation eines hinteren Gliedmaßen Allograft ermöglicht. Dieser Ansatz bildet die Grundlage für dieses Modell sowohl immunologische als auch funktionelle Untersuchungen der Nervenregeneration zu VCA 16,25 Zusammenhang kombiniert einsetzen. Nervenregeneration ist von zentraler Bedeutung für die field der rekonstruktiven Transplantation, da diese nicht-lebensrettenden Verfahren, deren Erfolg sind, wird durch die Wiederherstellung der funktionellen und ästhetischen Mängel in erster Linie bestimmt.
Die heterotope Einsatz eines osteomyocutaneous Klappe aus dem Hinterbein Ursprung ist ein weiteres Modell zur Verfügung, die Chirurgen 15. Bei diesem Ansatz jedoch chirurgische Entfernung von Strukturen von potentiellem Interesse, wie den Nägeln und der Haut des kahl Fußballen, begrenzt die Vielseitigkeit dieser Methode gegenüber dem orthotope Transplantation eines anatomisch unverändert hinteren Gliedmaßen Allograft. Dies ist von besonderem Interesse in der rekonstruktiven Transplantation, da diese Strukturen als Ziel atypischer Abstoßungsreaktionen bei Patienten zufügt mechanische Beanspruchung der Hand Allotransplantate 34 beschrieben. Von Natur aus einzigartig für eine gefäßzusammengesetzte Gewebe Allograft ist der Knochen Komponente, wie vaskularisierte Knochen tragfähige Knochenmark enthält und ein constantly Erneuerung Quelle von Komponenten und Vorstufen des Spenderimmunsystems. Während diese vorsichtig als mögliche Quelle für Transplantat-Wirt-Erkrankung (GvHD) betrachtet wurde, wurde dies nicht in beiden Tiermodellen 35,36 sowie Menschen 37 beobachtet. Ganz im Gegenteil sogar als 38-40 in präklinischen und klinischen Studien 36 gezeigt, die Kombination der Organtransplantation mit Marktransplantation Spenderknochen oder die Transfusion von ausgewählten Knochenmark abgeleiteten Zellprodukten zeigt tatsächlich vorteilhafte Effekte in Bezug auf die Menge der Immunsuppression erforderlich 21 ; Einige Protokolle wurden sogar Betriebstoleranz ohne die Notwendigkeit für Drogen-basierte Immunsuppression 41 gezeigt.
Das Modell und die Methode, die von dieser Veröffentlichung gezeigt ergab 100% langfristige Überleben der Tiere in syngenen Spender - Empfänger-Kombinationen (Abbildung 1) sowie ein gut charakterisiertes Muster von Transplantat accepta demonstriertNCE und Abstoßung bei allogenen Stammkombinationen wie in den 2 und 3 beschrieben. Darüber hinaus wird die Haut als ein sichtbares Primärziel der Abstoßung in VCA, folgt ein reproduzierbares Muster von 4 verschiedenen klinischen Szenarien der Ablehnung mit denen für den menschlichen VCA Korrelieren wie beschrieben durch das Banff 2007 Arbeits Klassifizierung der Haut haltigen VCA 42, so dass dieses Modell besonders übersetzbar. Somit ist diese sehr zuverlässige Mausmodell für die rekonstruktive Transplantationen vor allem stellt die Verfügbarkeit einer vielseitig immunologischen Modellsystem genetisch Inzucht und transgenen Mausstämme definiert, die die Möglichkeiten für diagnostische und interventionelle Studien mit translationalen Einfluss auf die klinische VCA öffnet.
Der Bedarf an Grundmikro Fähigkeiten vor der sie sich auf die beschriebene Technik meistern kann als eine Beschränkung auf dieses Modell angesehen werden, jedoch ist es dieselbe Haupthindernis für eine Mausmikromodell. Dos, ist das Video-Protokoll vor allem die erfahrenen Mikrochirurgen mit einem alternativen Ansatz zur mikrovaskulären Anastomose in einem murinen in vivo-Modell für gefäßVerbund Allotransplantationen liefern soll. Darüber hinaus ermöglicht das Modell für die Transplantation eines intakten vaskularisierten Knochenmarkkomponente sowie die Verwendung eines Funktionsmodells in Nervenregeneration Forschung.
Zusammenfassend haben wir eine neue, vielseitige und zuverlässige Mausmodell für orthotoper hinteren Gliedmaßen Transplantation eine nicht-Naht Manschette Technik, die die Tür zu grundlegenden Mechanismen zu Aspekten des VCA bezogene sowie translationale Forschung eröffnet.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Armee, Marine, NIH, Luftwaffe, VA und Health Affairs unterstützt das AFIRM II Aufwand, unter Auszeichnung Nr W81XWH-13-2-0053 zu unterstützen. Die US-Armee Medical Research Acquisition Activity, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21702-5014 ist die Vergabe und Verwaltung von Erwerb Büro. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die des Autors und nicht notwendigerweise durch das Department of Defense unterstützt.
Die Autoren möchten Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM und Julie Watson, DVM für ihre ausgezeichnete Veterinär Unterstützung während dieser Studie danken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suture, 6-0 Nylon | MWI | 31849 | |
| Suture, 6-0 Polysorb | MWI | 72667 | |
| Suture, 10-0 Nylon | Aero Surgical | TK-107038 | |
| Polyimide Tubing, Size 25 | Vention Medical | 141-0023 | |
| Polyimide Tubing, Size 27 | Vention Medical | 141-0015 | |
| Microvascular Clamps (Single) | Synovis | 00396 | |
| Microvascular Clamps (Double) | Synovis | 00414 | |
| Micro-Scissors | Synovis | SAS-18 | |
| Micro-Forceps | Synovis | FRS-15 RM-8 | |
| Micro-Dilators | Synovis | FRS-15 RM-8d.1 | |
| Micro-Needledriver | Synovis | C-14 | |
| Micro-Clamp Applicator | Synovis | CAF-4 | |
| Micro-Flushing Needle | Hamilton | 10MM, 30°, 33G | |
| Lactated Ringers Solution | Fisher Scientific | NC9968051 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy. | ||
| Enrofloxacin; Baytril | Bayer Health Care | 186599 | |
| Heparin | Obtained from hosptial pharmacy |
References
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