Summary
Questo nuovo modello per il trapianto degli arti posteriori ortotopico nel topo, applicando una tecnica bracciale non sutura per anastomosi super-microvascolare, fornisce un potente strumento per la ricerca in vivo meccanicistica immunologica relative al allotrapianto composito vascolarizzato (VCA).
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institute of Health (NIH) e sono stati approvati dal Comitato Johns Hopkins University Animal Care e Usa (JHUACUC). Le procedure specifiche sono state eseguite sotto la MO13M108 protocollo ACUC approvato.
Operazione 1. donatore
- Somministrare l'analgesia al punto momento opportuno per ogni formulazione farmacologica prima di un intervento chirurgico. Come per la cura degli animali approvato e l'uso l'uso del protocollo 0,1 mg / kg di peso corporeo di buprenorfina per via sottocutanea 1 ora prima della incisione cutanea.
- Sedare il donatore con isoflurano applicato attraverso una camera collegata ad un vaporizzatore isoflurano al 4%; mantenere la sedazione e l'anestesia al 2% attraverso un cono di naso. Eseguire punta pizzico ritiro di riflessione per monitorare la profondità dell'anestesia prima dell'inizio della procedura.
- Indossare maschere, abiti di isolamento monouso e guanti.
- Radere l'ar chirurgicaEA, in particolare l'arto posteriore e l'inguine, e preparazione con il 10% Povidone - iodio.
- Utilizzare un drappo campo sterile, strumenti in autoclave e un microscopio ad alto ingrandimento (40X).
- Rendere all'inguine incisione cutanea usando forbici prossimalmente alla metà coscia e circonferenzialmente collegare l'incisione per delimitare l'arto posteriore dal resto del corpo del mouse.
- Identificare e sezionare l'arteria femorale, vena e nervo. Separare tutte le tre strutture con pinze e micro-forbici.
- Una volta che il peduncolo vascolare è sezionato dividere i vasi a livello del legamento inguinale con le forbici micro.
- Successivamente, continuare a dividere i singoli ventrale (gracilis e muscoli della coscia mediale) e gruppi muscolari dorsali 20 prossimalmente a livello della metà coscia per separare l'innesto dal donatore con le forbici.
- Transect femore e tagliare a metà del femore con le forbici.
- L'eutanasia degli animali da isoflurano fol overdoselowed da dislocazione cervicale. Confermare la cessazione del battito cardiaco e la respirazione.
- Lavare l'arto con 2 ml eparinizzate (30 IE) fredda (4 ° C) saline utilizzando un 33 G lavaggio ago montato su una siringa (vedi Materiali Tabella).
- Posizionare un bracciale in poliimmide la vena femorale e l'arteria, rispettivamente.
- Avvolgere trapianto in garza di cotone bagnato, posto nella capsula di Petri e conservare a 4 ° C fino a quando nel riquadro.
2. Destinatario Funzionamento
- La rimozione del dell'arto posteriore
- Somministrare l'analgesia al punto momento opportuno per ogni formulazione farmacologica prima di un intervento chirurgico. Come per la cura degli animali approvato e l'uso l'uso del protocollo 0,1 mg / kg di peso corporeo di Buprenorfina SC 1 ora prima della incisione cutanea.
- Sedare il donatore con isoflurano applicato attraverso una camera collegata ad un vaporizzatore isoflurano al 4%; mantenere la sedazione e l'anestesia al 2% attraverso un cono di naso. Eseguire punta pizzico ritiro di riflessione per monitorare il repartoh di anestesia prima dell'inizio del procedimento.
- Usare pomata veterinario gli occhi del mouse per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia.
- Radere l'area chirurgica, in particolare l'arto posteriore e l'inguine e preparazione con il 10% Povidone - iodio.
- Rendere all'inguine incisione cutanea usando forbici prossimalmente alla metà coscia e circonferenzialmente collegare l'incisione per delimitare l'arto posteriore dal resto del corpo del mouse.
- Identificare e sezionare l'arteria femorale, vena e nervo e separare tutte le tre strutture con pinze e micro-forbici.
- Una volta che il peduncolo vascolare è sezionato, bloccare i vasi femorali a livello del legamento inguinale.
- Tagliare i vasi distale a livello dell'arteria epigastrica superficiale.
- Successivamente, continuare a dividere i singoli ventrale (gracilis e muscoli della coscia mediale) e dorsali gruppi muscolari 20 prossimalmente a livello della metà coscia per separare il hind li nativamb dagli animali destinatario utilizzando le forbici.
- Transect il femore nel mezzo della diafisi femorale con le forbici.
- Cauterize muscoli della coscia precedentemente sezionati per prevenire le emorragie del sito dissezione e, quindi, la perdita di sangue destinatario.
- Impianto
- Minimizzare la perdita di fluido irrigando il campo operatorio con soluzione fisiologica tiepida (37 ° C) e l'iniezione di 0,3 ml di soluzione salina calda prima e dopo l'operazione.
- Inserire l'innesto in modo da riflettere la posizione anatomica accurata dell'arto posteriore nativa allineando dell'osso femore del destinatario e l'innesto e collegate con un ago spinale 20 G come un chiodo endomidollare.
- Coapt i gruppi muscolari ventrale e dorsale con materiale di sutura riassorbibile (6-0 Polysorb).
- Collegare vasi femorali con la tecnica bracciale non suture; in dettaglio, tirare il lato ricevente della nave sui polsini precedentemente montate sulla nave estremità del graft. Utilizzare una sutura in nylon 10-0 ed eseguire una cravatta circonferenziale per fissare la nave ricevente sul bracciale.
- Successivo rilasciare le fascette. In questa fase verificare visivamente la rotazione bracciale e un posizionamento ottimale per evitare errori di rotazione e piegamento dei vasi.
- Eseguire emostasi meticolosa con cauterizzazione electro con una particolare attenzione per l'interfaccia del donatore ricevente muscolare e le estremità delle ossa.
- Chiudere la pelle con punti di sutura in nylon non assorbibili (6-0 ETHILON).
- Stabilire condizioni normotermici consentendo all'animale di recuperare nella sua gabbia sotto una lampada riscaldante. Continuare monitoraggio regolare per almeno 4 ore prima di ritornare alla struttura alloggiativa.
- Fornire analgesia post-operatoria con buprenorfina alla dose di 0,1 mg / kg SC ogni 6-8 ore per 3 giorni.
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Representative Results
Esecuzione vascolarizzato allotrapianto composito in un modello di topo usando una tecnica bracciale non sutura consente di ottenere eccellenti e lungo graft termine e animali sopravvivenza come mostrato in Figura 1. Inoltre, rappresenta un metodo affidabile per ottenere risultati riproducibili di graduale rifiuto allograft in composito vascolarizzata allotrapianto come documentato dalle immagini mostrate in figura 2. H & e istologico dei tessuti ottenuti da animali sottoposti a rifiuto sottolinea ulteriormente la dinamica riproducibili del rigetto dell'organo trapiantato in questo modello murino (Figura 3).
Figura 1. Allograft sopravvivenza in un mouse Strain combinazione completamente H2-non corrispondenti [Balb / c (H2K d) in C57BL6 (H2K b)]. Mentre tutte Transpl singeniciformiche (n = 10) sono stati accettati a lungo termine, allotrapianti non trattati (n = 10) sono stati respinti acutamente dentro e media di 8 - 9 giorni. Pelle rifiuto di grado 3 secondo i criteri di Banff è stato considerato completo rifiuto in questo studio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Caratteristiche Rifiuto clinici e la dinamica di un Fully-H2 non corrispondenti [Balb / c (H2K d) in C57BL6 (H2K b)] murino ortotopico arto posteriore trapianto. (A) Grado Clinica 0, (B) grado clinico 1, ( C) di grado clinico 2, (D) di grado clinico 3, e (e) Clinical Grade 4 rifiuto, (F) termine sopravvivere trapianto lunga (POD 100) trattati con un costimulzione blocco (antiCD40 mAb + CTLA4Ig) regime di base. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. H & E colorazione di pelle e muscoli in un trapianto Singenico (A) e trapianto allogenico (B) su POD 8 così come H & E colorazione di Footpad pelle e muscoli in un trapianto Singenico (C) e trapianto allogenico su POD 8 (D ) (bar Scala:. 0,1 micron) clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Vascolarizzato Composite allotrapianto, come ad esempio arti superiori e il trapianto di faccia per la ricostruzione di difetti del tessuto devastanti, si è evoluto come opzione di trattamento valido per i pazienti non modificabili a procedure ricostruttive tradizionali. I progressi tecnici nel campo della microchirurgia ricostruttiva, nonché una vasta esperienza con immunosoppressori potenti e le terapie modulatori del sistema immunitario a trapianto di organo solido, ora permette la sopravvivenza del trapianto a lungo termine in questa popolazione di pazienti unica 3,21. Tuttavia, significativi effetti collaterali di immunosoppressione a lungo termine necessari per la manutenzione e la sopravvivenza del trapianto limitano ancora la più ampia applicazione di questi migliorare la vita, ma non la vita di risparmio modalità ricostruttiva 3,22,23. Inoltre, il successo di VCA a differenza di trapianti di organi solidi dipende anche tempestiva rigenerazione dei nervi destinatari nella alloinnesto di ri-innervano entrambi i muscoli per la funzione motoria, nonchécomponenti sensoriali per il tatto e la sensazione della temperatura di recuperare la funzione. Dal punto di vista immunologico, come in tutti medicina dei trapianti, l'obiettivo primario nel trapianto ricostruttiva è quello di raggiungere uno stato di tolleranza operativo che consente l'accettazione di un allotrapianto senza la necessità di mantenimento a lungo termine immunosoppressione 23. A questo proposito, il topo è evoluta a rappresentare il principale sistema modello in vivo nella ricerca dei trapianti di studiare i mezzi per conseguire alloantigene tolleranza specifico in un sistema immunitario intatto. Inoltre, il complesso H2 del mouse assomiglia molto complesso MHC umana. Così, i ceppi inbred e di genotipi del mouse permettono di modellare scenari clinici di impostazioni di vita e di donatore cadavere correlate e non correlate impiegando vari gradi di alloantigene mismatching da un singenici a una combinazione ceppo completamente allogenico. La disponibilità di animali transgenici e di animali knockout specifici in aggiunta tuttiOWS indagini dei ruoli e degli effetti dei percorsi molecolari individuali e meccanismi di regolazione di accettazione immunitario e il rigetto, fornendo la possibilità di attivazione o l'esaurimento delle componenti cellulari o proteine. Questo è accompagnato da un'ampia disponibilità di agenti diagnostici e terapeutici (ad es., Anticorpi) sviluppati unicamente per il sistema di topo in vitro e in vivo studi 24. Nel complesso, questi aspetti rendono il sistema murino il "gold standard" per la ricerca di base trapianto di immunologia.
Anche se ci sono stati diversi piccoli e grandi 13,16,18,20,25,26 14,27-29 modelli animali descritti per VCA come recentemente recensito da Brandacher et al. 30 solo pochissimi sono in realtà applicabile per la ricerca immunologica meccanicistica base 16 , 24,30. A causa del piccolo diametro del vaso del mouse arteria femorale e la vena, richiede advanced chirurgica e super-miformazione e le competenze per eseguire crosurgical anastomosi successo come il componente chiave del trapianto degli arti posteriori ortotopico. Mentre dissezione meticolosa e attenta delle strutture anatomiche è criticamente rilevante in questo modello come nei modelli precedentemente pubblicati 20,31,32, la tecnica bracciale ha mostrato una curva di apprendimento meno ripida rispetto alla sutura anastomosi di vasi sub-millimetriche 16,25 e può essere realizzato in un paio di mesi di formazione con rigorosa pratica quotidiana. Sulla base della nostra esperienza, un microsurgeon inesperto avrà bisogno di 30 -50 tentativi procedurali di acquisire competenze sufficienti e affidabili per eseguire questo modello con alte percentuali di successo. Per la microsurgeon esperto e altamente qualificato 15 - 30 tentativi dovrebbero essere sufficienti a padroneggiare questo mouse arto posteriore trapianto bracciale a base model.The ha ridotto la complessità della procedura qui presentata è ulteriormente testimoniata dal fatto che questo approccio richiede lunghezza dell'imbarcazione limitata e quindi la dissezione. Abbiamo trovato prendendo tegli navi cedenti al legamento inguinale ei vasi riceventi a livello dei vasi epigastrici superficiali fornisce lunghezza sufficiente, nonostante la nozione comune che la tecnica bracciale richiede ampie lunghezza supplementare applicabile. Ad esempio, un approccio precedentemente pubblicato descrive la necessità di navi raccolto donatori a livello dei vasi iliaci e vasi riceventi esterni a livello dei vasi poplitei 32. Inoltre, con la tecnica bracciale, eseguire la anastomosi richiede meno tempo rispetto alla tecnica di sutura e porta ad un tempo di funzionamento ridotto complessiva. In mani esperte, entrambe le procedure donatore e ricevente possono essere completate in una media di 90 min. Questo è un miglioramento significativo rispetto ai metodi precedentemente riportati nel quale ha esteso la durata dell'anestesia destinatario è stato un fattore determinante per il successo e la sopravvivenza perioperatoria; rendendo la necessità di un approccio a due chirurgo un prerequisito 31-33.Inoltre, minimo a nessun sanguinamento dal anastomosi contribuisce ulteriormente alla riduzione significativa perdita di sangue e, quindi, riduce la necessità di rianimazione fluida dei destinatari, come descritto in precedenza come un altro fattore determinante per il successo in questo modello 33. Infine, la tecnica bracciale rappresenta un metodo con un significativo vantaggio di costo rispetto agli elevati costi di 11-0 materiale micro-suture. Pertanto, la tecnica bracciale non sutura rappresenta la fase più critica del protocollo sottostante. In un elegante studio di Tung et al., Vari mio- diverso e lembi osteomyocutaneous tra cui un lembo cutaneo vascolarizzato inguine sono state descritte in base al largo del peduncolo del mouse nave femorale 32. Mentre il metodo presentato qui si concentra esclusivamente sul trapianto di tutto l'arto del mouse posteriori, i principi presentati possono essere facilmente tradotti e impiegati in vari altri disegni anatomici lembo. Degno di nota è il fatto che, mentre gli autori precedenti riportano automutilazioneo autofagia dell'innesto come complicazione significativa durante sopravvivenza post-operatorio 31,32 questo non è stato osservato nella nostra esperienza. Inoltre, il rapido recupero e la perdita di valore limitato di capacità dell'animale di alimentazione e governare sottolinea che l'inserto ortotopico della gamba trapiantato infligge solo minima morbilità destinatario.
Il modello descritto in questo video pubblicazione presenta inoltre diversi vantaggi per l'impostazione del mouse rispetto alle tecniche precedentemente pubblicati. Innanzitutto, come riportato in precedenza dal nostro gruppo 16, la tecnica bracciale può essere impiegato in serbatoi con un diametro del lume inferiore ad 1 millimetro, consentendo il trapianto ortotopico di un allotrapianto dell'arto posteriore. Questo approccio fornisce la base per l'impiego di questo modello combinato sia immunologico, nonché studi funzionali di rigenerazione nervosa relative al VCA 16,25. la rigenerazione del nervo è di importanza fondamentale per la Field del trapianto ricostruttiva, in quanto questi sono procedure di risparmio non vita il cui successo è determinato principalmente dal ripristino di difetti funzionali ed estetiche.
L'inserto eterotopico di un lembo osteomyocutaneous proveniente dal dell'arto posteriore è un modello aggiuntivo a disposizione del chirurgo 15. In questo approccio tuttavia, l'asportazione chirurgica di strutture di potenziale interesse, come le unghie e la pelle glabra della zampa, limita la versatilità di questo metodo rispetto al trapianto ortotopico di un anatomicamente inalterata allotrapianto arto posteriore. Questo è di particolare interesse nel trapianto ricostruttiva come queste strutture sono state descritte come destinazione di processi rigetto atipiche in pazienti infliggendo solleciti meccanicamente i allotrapianti mano 34. Intrinsecamente unica per un trapianto di tessuto composito vascolarizzato è la componente ossea, come un osso vascolarizzato contiene midollo osseo vitale ed è un constantly rinnovando fonte di componenti e precursori del sistema immunitario donatore. Mentre questo è stato cautamente considerato come una possibile fonte di graft-versus-host disease (GvHD), questo non è stato osservato sia in modelli animali 35,36 che nell'uomo 37. Molto al contrario in realtà, come mostrato nella preclinici e clinici 36 studi 38-40, la combinazione di trapianto di organi con trapianto di midollo osseo del donatore o la trasfusione di osso selezionato derivate dal midollo prodotti cella mostra effettivamente effetti vantaggiosi per quanto riguarda la quantità di immunosoppressione necessaria 21 ; alcuni protocolli hanno addirittura dimostrato tolleranza operativa senza la necessità di immunosoppressione farmaci a base 41.
Il modello e la metodologia mostrato da questa pubblicazione ha prodotto la sopravvivenza del 100% a lungo termine animale donatore singenici - combinazioni di destinatari (figura 1), così come ha dimostrato una ben caratterizzati modelli di trapianto acceptaSNO e rifiuto nelle combinazioni deformazione allogeniche come esposto nella figure 2 e 3. Inoltre, la pelle come obiettivo primario visibile del rifiuto in VCA, segue un modello riproducibile di 4 scenari clinici distinti di rifiuto correlazione con quelli VCA umana come indicato dal la classificazione di lavoro Banff 2007 della pelle contenenti VCA 42, rendendo questo modello particolarmente traducibile. Pertanto, questo modello di topo altamente affidabile per il trapianto ricostruttiva soprattutto, introduce la disponibilità di un versatile sistema modello immunologico dei ceppi di topi inbred e transgenici geneticamente definite che apre le possibilità di studi diagnostici e interventistiche con impatto traslazionale sulla VCA clinica.
La necessità di competenze microchirurgia base prima di intraprendere controllare la tecnica descritta può essere considerato come una limitazione a questo modello, tuttavia, è la stessa principale ostacolo a qualsiasi modello di topo microchirurgico. gios, questo protocollo video è principalmente destinato a fornire al microsurgeon condito con un approccio alternativo al microvascolare anastomosi in un murino modello in vivo per vascolarizzato allotrapianto composito. Inoltre, il modello permette di trapianto di un componente di midollo osseo vascolarizzato intatto, così come l'uso di un modello funzionale in ricerca rigenerazione nervosa.
In conclusione, abbiamo stabilito un nuovo, versatile e modello affidabile del mouse per il trapianto degli arti posteriori ortotopico utilizzando una tecnica bracciale non sutura che apre la porta a meccanicistico di base, così come la ricerca traslazionale relative a qualsiasi aspetto della VCA.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Esercito, Marina, NIH, Aeronautica, VA e Health Affairs per sostenere lo sforzo AFIRM II, sotto Premio n W81XWH-13-2-0053. L'US Army Medical Research di acquisizione di attività, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21.702-5.014 è l'Ufficio acquisizione assegnazione e la gestione. Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle dell'autore e non sono necessariamente condivise dal Dipartimento della Difesa.
Gli autori desiderano ringraziare Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM e Julie Watson, DVM per il loro eccellente supporto veterinario nel corso di questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suture, 6-0 Nylon | MWI | 31849 | |
| Suture, 6-0 Polysorb | MWI | 72667 | |
| Suture, 10-0 Nylon | Aero Surgical | TK-107038 | |
| Polyimide Tubing, Size 25 | Vention Medical | 141-0023 | |
| Polyimide Tubing, Size 27 | Vention Medical | 141-0015 | |
| Microvascular Clamps (Single) | Synovis | 00396 | |
| Microvascular Clamps (Double) | Synovis | 00414 | |
| Micro-Scissors | Synovis | SAS-18 | |
| Micro-Forceps | Synovis | FRS-15 RM-8 | |
| Micro-Dilators | Synovis | FRS-15 RM-8d.1 | |
| Micro-Needledriver | Synovis | C-14 | |
| Micro-Clamp Applicator | Synovis | CAF-4 | |
| Micro-Flushing Needle | Hamilton | 10MM, 30°, 33G | |
| Lactated Ringers Solution | Fisher Scientific | NC9968051 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy. | ||
| Enrofloxacin; Baytril | Bayer Health Care | 186599 | |
| Heparin | Obtained from hosptial pharmacy |
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