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Ortotópico Hind Limb Transplantation no mouse

Published: February 12, 2016 doi: 10.3791/53483
* These authors contributed equally

Summary

Este novo modelo de transplante de membro posterior ortotópico em ratos, aplicando uma técnica manguito não sutura para a anastomose super-microvascular, fornece uma ferramenta poderosa para in vivo pesquisa imunológica mecanicista relacionadas com alotransplante composta vascularizado (VCA).

Protocol

Todos os experimentos foram conduzidos de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde (NIH) e foram aprovados pela Comissão de Johns Hopkins University animal Cuidado e Uso (JHUACUC). Os procedimentos específicos foram realizados sob a MO13M108 protocolo ACUC aprovado.

Operação 1. Donor

  1. Administrar analgesia no ponto de tempo adequado para cada formulação farmacológica antes da cirurgia. De acordo com a cuidar dos animais aprovados e uso de uso de protocolo 0,1 mg / kg de peso corporal por via subcutânea de buprenorfina 1 hora antes da incisão na pele.
  2. Sedar o doador com isoflurano aplicado através de uma câmara ligada a um vaporizador de isoflurano a 4%; manter a sedação e anestesia em 2% por meio de um cone do nariz. Realizar dedo retirada pitada reflexão para monitorizar a profundidade da anestesia antes do início do procedimento.
  3. Usar máscaras, batas de isolamento descartáveis ​​e luvas.
  4. Raspar o ar cirúrgicaea, em particular a dos membros posteriores e na virilha, e prep com 10% de Povidona - Iodo.
  5. Use uma cortina de campo estéril, instrumentos autoclavados e um microscópio de alta ampliação (40x).
  6. Adicione virilha incisão na pele com uma tesoura proximalmente para a área do meio da coxa e circunferencialmente ligar a incisão para delimitar o membro posterior a partir do resto do corpo do rato.
  7. Identificar e dissecção da artéria femoral, veias e nervos. Separe todas as três estruturas usando fórceps e micro-tesoura.
  8. Uma vez que o pedículo vascular é dissecado dividem os vasos no nível do ligamento inguinal utilizando micro tesouras.
  9. Em seguida, continuar a dividir os individuais ventral (gracilis e os músculos da coxa medial) e grupos de músculo dorsal 20 proximalmente ao nível do meio da coxa para separar o enxerto a partir do animal dador com uma tesoura.
  10. Transecto do fêmur e cortado no meio da haste femoral com uma tesoura.
  11. Eutanásia de animais por fol overdose isofluranolowed por deslocamento cervical. Confirmar cessação do batimento cardíaco e respiração.
  12. Lavar o membro com 2 ml heparinizados (30 IE) frio (4 ° C) de solução salina usando uma agulha 33 G de lavagem montado sobre uma seringa (ver Materiais Tabela).
  13. Coloque um manguito poliimida na veia femoral e da artéria, respectivamente.
  14. Enrole enxerto em gaze de algodão molhado, coloque em placa de petri e armazenar a 4 ° C até inserção.

2. Destinatário Operação

  1. A remoção do membro posterior
    1. Administrar analgesia no ponto de tempo adequado para cada formulação farmacológica antes da cirurgia. De acordo com a cuidar dos animais aprovados e uso de uso de protocolo 0,1 mg / kg de peso corporal de Buprenorfina SC 1 hora antes da incisão na pele.
    2. Sedar o doador com isoflurano aplicado através de uma câmara ligada a um vaporizador de isoflurano a 4%; manter a sedação e anestesia em 2% por meio de um cone do nariz. Execute toe retirada pitada reflexão para monitorar o depth de anestesia antes do início do procedimento.
    3. Use pomada veterinária sobre os olhos do mouse para evitar a secura e sob anestesia.
    4. Raspar a área cirúrgica, em particular a dos membros posteriores e na virilha e prep com 10% de Povidona - Iodo.
    5. Adicione virilha incisão na pele com uma tesoura proximalmente para a área do meio da coxa e circunferencialmente ligar a incisão para delimitar o membro posterior a partir do resto do corpo do rato.
    6. Identificar e dissecção da artéria femoral, veia e nervo e separar todas as três estruturas usando fórceps e micro-tesoura.
    7. Uma vez que o pedículo vascular é dissecado, apertar os vasos femorais ao nível do ligamento inguinal.
    8. Cortar os vasos distais ao nível da artéria epigástrica superficial.
    9. Em seguida, continuar a dividir os individuais ventral (gracilis e músculos da coxa medial) e grupos musculares dorsais 20 proximal ao nível do meio da coxa para separar o li traseira nativamb dos animais receptores usando uma tesoura.
    10. Transecto fêmur no meio do eixo femoral com uma tesoura.
    11. Cauterizar músculos da coxa anteriormente transeccionados para evitar sangramento do local de dissecção e, portanto, a perda de sangue destinatário.
  2. Implantação
    1. Minimizar a perda de fluido por irrigação do campo operatório com solução salina quente (37 ° C) e injectando 0,3 ml de solução salina quente antes e depois da operação.
    2. Coloque o enxerto de uma forma que reflete a posição anatômica precisa do membro posterior nativa alinhando o osso do fémur do destinatário e do enxerto e conectá-los usando uma agulha espinhal 20 G como uma haste intramedular.
    3. Coapt os grupos musculares ventral e dorsal, utilizando material de sutura absorvível (6-0 Polysorb).
    4. Ligue os vasos femorais, utilizando a técnica do manguito não sutura; em detalhe, puxar para o lado do receptor do recipiente sobre os punhos anteriormente montado no recipiente de termina do Graft. Use um Nylon sutura 10-0 e realizar uma ligação periférica para corrigir o navio receptor para o manguito.
    5. Próximo liberar as braçadeiras. Nesta fase, verificar visualmente rotação punho e posicionamento ideal para evitar mis-rotação e dobras dos vasos.
    6. Execute hemostasia meticulosa usando cautério electro com um foco particular na interface doador destinatário muscular e as extremidades ósseas.
    7. Feche a pele usando suturas de nylon não-absorvíveis (6-0 ethilon).
    8. Estabelecer condições normotermicos, permitindo que o animal a se recuperar em sua gaiola sob uma lâmpada de aquecimento. Continue acompanhamento regular por pelo menos 4 horas antes de retornar para a instalação de habitação.
    9. Proporcionar analgesia pós-operatória com buprenorfina na dose de 0,1 mg / kg SC cada 6-8 horas durante 3 dias.

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Representative Results

Executando alotransplante compósito vascularizada num modelo de ratinho utilizando uma técnica não-sutura braçadeira permite atingir uma excelente e de longa sobrevivência do enxerto prazo e animal, tal como mostrado na Figura 1. Além disso, representa um método confiável para a obtenção de resultados reprodutíveis de rejeição de aloenxertos gradual no compósito vascularizado alotransplante como documentado por as imagens mostradas na Figura 2. H & e histologia dos tecidos obtidos a partir de animais submetidos a rejeição sublinha ainda mais a dinâmica reprodutíveis da rejeição do enxerto neste modelo de murino (Figura 3).

figura 1
Figura 1. Allograft Survival em um mouse Strain Combinação totalmente incompatíveis-H2 [Balb / c (H2K d) em C57BL6 (H2K b)]. Embora todos transpl singênicaformigas (n = 10) foram aceites a longo prazo, aloenxertos não tratados (n = 10) foram rejeitados agudamente dentro e média de 8 - 9 dias. Pele rejeição Grau 3 de acordo com critérios de Banff foi considerado rejeição completa neste estudo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Características Rejeição clínicos e Dinâmica de um totalmente incompatíveis-H2 [Balb / c (H2K d) em C57BL6 (H2K b)] murino ortotópico Hind Limb Transplant. (A) Grau Clinical 0, (B) Votação Clínico 1, ( C) Votação clínico 2, (D) Votação Clínica 3, e (e) Clinical Grau 4 rejeição, (F) termo sobrevivente do enxerto longa (POD 100) tratados com uma costimulbloqueio ção (anti-CD40 mAb + CTLA4Ig) regime baseado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. H & E coloração de pele e músculo em um Transplant Singênico (A) e alogênico transplante (B) sobre POD 8, bem como H & E coloração da pata pele e músculo em um Transplant Singênico (C) e alogénicos Transplant em POD 8 (D ) (barra de escala:. 0,1 mm) por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Vascularizado Composite Alotransplante, como membro superior e transplante de rosto para reconstrução de defeitos de tecidos devastadores, tem evoluído como uma opção de tratamento válida para pacientes não alterada para procedimentos reconstrutivos convencionais. Os avanços técnicos no campo da microcirurgia reconstrutiva, bem como uma vasta experiência com potente terapêuticas imunossupressoras e imunomoduladoras em transplante de órgãos sólidos, agora permite a sobrevivência do enxerto a longo prazo nesta população de doentes único 3,21. No entanto, efeitos colaterais significativos de imunossupressão a longo prazo necessários para a manutenção do enxerto e sobrevivência ainda limitar a aplicação mais ampla de reforço, mas salva-vidas não modalidades de reconstrução 3,22,23 estes vida. Além disso, o sucesso da VCAs em contraste com os transplantes de órgãos sólidos depende também oportuna regeneração de nervos receptores para o aloenxerto para re-inervam ambos os músculos para a função motora, bem comocomponentes sensoriais para toque e sensação de temperatura para recuperar a função. Do ponto de vista imunológico, tal como em toda a medicina de transplantes, o objectivo primordial na transplantação de reconstrução é a de atingir um estado de tolerância operacional permitindo a aceitação de um enxerto, sem a necessidade de imunossupressão a longo prazo de manutenção 23. A este respeito, o rato tem evoluído para representar a principal no sistema de modelo in vivo de transplante de imunologia na investigação para investigar maneiras de alcançar aloantigénio tolerância específica em um sistema imune intacto. Além disso, o complexo H2 rato assemelha-se de perto o complexo MHC humana. Assim, as estirpes puras e genotipados rato permitem modelar cenários clínicos de definições de vida e doador cadáver relacionados e não-relacionados, empregando vários graus de aloantígeno descasamento de um singênica a uma combinação de tensão totalmente alogênico. A disponibilidade de animais transgênicos e animais knockout específicos, além disso tudoinvestigação uxos dos papéis e efeitos das vias moleculares individuais e mecanismos reguladores sobre a aceitação imunológico e rejeição, fornecendo a possibilidade de activação selectiva ou esgotamento dos componentes celulares ou proteína. Isto é acompanhado por uma ampla disponibilidade de agentes de diagnóstico e terapêuticos (por exemplo., Anticorpos) desenvolvidos de forma única para o sistema de ratinho para in vitro e estudos in vivo em 24. No geral, estes aspectos tornam o sistema murino o "padrão ouro" para a pesquisa básica transplante imunologia.

Embora tenha havido várias pequenas 13,16,18,20,25,26 e grandes animais 14,27-29 modelos descritos para VCA como recentemente revisto por Brandacher et al. 30, muito poucos são realmente aplicável para pesquisa imunológica mecanicista básica 16 , 24,30. Devido ao pequeno diâmetro dos vasos da artéria femoral e da veia do rato, ele requer avançada cirúrgica e super-miformação e competências crosurgical para realizar anastomose bem sucedido como o componente chave do transplante dos membros posteriores ortotópico. Enquanto dissecção meticulosa e cuidadosa das estruturas anatômicas é como criticamente relevante neste modelo, como em modelos previamente publicados 20,31,32, a técnica cuff mostrou uma curva de aprendizagem menos íngreme em comparação com anastomose sutura de vasos sub-milimétricas 16,25 e pode ser conseguida de uma formação de dois meses com a prática diária rigorosa. Com base em nossa experiência, uma microsurgeon destreinado terá 30 -50 tentativas processuais para adquirir habilidades suficientes e confiáveis ​​para executar esse modelo com altas taxas de sucesso. Para o microsurgeon experiente e altamente treinada 15 - 30 tentativas deve ser suficiente para dominar este transplante de rato dos membros posteriores com base em punho model.The reduzida complexidade do procedimento aqui apresentado está também reflectida pelo fato de que esta abordagem exige comprimento do navio limitada e, portanto, dissecção. Encontramos tomando tele navios dadores no ligamento inguinal e os vasos receptores em nível dos vasos epigástrica superficial fornece comprimento suficiente, apesar da noção de que a técnica comum punho requer grande comprimento adicional para ser aplicável. Por exemplo, uma abordagem anteriormente publicado descreve a necessidade de vasos de dadores colheita ao nível dos vasos ilíacos e vasos destinatário externo ao nível dos vasos poplíteos 32. Além disso, com a técnica de punho, de executar a anastomose requer menos tempo em comparação com a técnica de sutura e leva a um tempo de operação total reduzida. Em mãos experientes, ambos os procedimentos doadores e receptores pode ser concluído em uma média de 90 min. Esta é uma melhoria significativa em comparação com os métodos anteriormente relatados em que se estenderam duração da anestesia destinatário tiver sido um factor determinante para o sucesso e sobrevivência perioperatória; tornando a necessidade de um dois-cirurgião se aproximar de um pré-requisito 31-33.Além disso, o mínimo de sangramento da anastomose contribui ainda mais para reduzir significativamente a perda de sangue e, assim, reduz a necessidade de reanimação com líquidos dos destinatários, como descrito anteriormente como outro fator determinante para o sucesso neste modelo 33. Finalmente, a técnica de manguito representa um método com uma vantagem de custo significativo comparado com os custos elevados de 11-0 material micro-sutura. Assim, a técnica não-sutura manguito representa a etapa mais crítica do protocolo subjacente. Em um elegante estudo por Tung et al., Vários miocárdio diferente e abas osteomyocutaneous incluindo um retalho de pele na virilha vascularizado foram descritos baseado fora do pedículo do rato navio femoral 32. Enquanto o método aqui apresentado centra-se exclusivamente no transplante de todo o membro do mouse traseira, os princípios apresentados podem ser facilmente traduzidas e empregados em vários outros projetos de aba anatômicas. Destaca-se o fato de que enquanto autores anteriores relatam automutilationou autofagia do enxerto como uma complicação significativa durante a sobrevivência pós-operatória 31,32 isto não tem sido observada em nossa experiência. Além disso, a recuperação rápida e comprometimento limitado de capacidade de alimentação e higiene do animal sublinha que a inserção ortotópico da perna transplantado inflige apenas o mínimo de morbidade destinatário.

O modelo descrito nesta publicação vídeo introduz adicionalmente vantagens distintas para a configuração do rato em comparação com técnicas previamente publicadas. Em primeiro lugar e acima de tudo, como relatado anteriormente pelo nosso grupo 16, o manguito técnica pode ser utilizada em vasos com um diâmetro de lúmen menor do que um milímetro, para permitir que o transplante ortotópico de um aloenxerto do membro posterior. Esta abordagem fornece a base para empregar este modelo combinado em ambas imunológico, bem como estudos funcionais de regeneração do nervo relacionadas com VCA 16,25. Regeneração nervosa é de importância fundamental para a field do transplante de reconstrução, já que estes são processos de memorização não-vida, cujo sucesso é determinado principalmente pela restauração de defeitos funcionais e estéticos.

A inserção heterotópico de uma aba osteomyocutaneous proveniente do membro posterior é um modelo adicional disponível para o cirurgião 15. Nesta abordagem, no entanto, a remoção cirúrgica das estruturas de interesse potencial, tais como os pregos e a pele glabra da almofada da pata, limita a versatilidade do presente método em comparação com o transplante ortotópico de um aloenxerto do membro traseiro anatomicamente inalterado. Isto é de particular interesse no transplante reconstrutiva vez que estas estruturas têm sido descritos como o alvo de processos de rejeição atípicos em pacientes infligindo esforço mecânico aos seus aloenxertos de mão 34. Inerentemente única de um aloenxerto de tecido vascularizado composto é o componente do osso, tal como osso vascularizado contém medula óssea viável e é um constantlY renovando fonte de componentes e precursores do sistema imune doador. Enquanto esta foi cuidadosamente considerado como uma possível fonte para a doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), esta não foi observado em ambos os modelos animais 35,36, bem como seres humanos 37. Muito pelo contrário, na verdade, como demonstrado em estudos pré-clínicos e clínicos 38-40 36, a combinação de transplante de órgãos com transplante de medula óssea do dador ou a transfusão de produtos de células derivadas de medula óssea seleccionado na verdade, mostra efeitos vantajosos sobre a quantidade necessária de imunossupressão 21 ; alguns protocolos têm mesmo mostrado tolerância operacional sem a necessidade de imunossupressão baseada em drogas 41.

O modelo e metodologia mostrado por esta publicação originou 100% de sobrevivência a longo prazo dos animais no dador singénico - combinações de receptores (Figura 1), bem como demonstrado um padrões bem caracterizado de aceitabilidade enxertoNCE e rejeição nas combinações de deformação alogénicas como delineado nas Figuras 2 e 3. Além disso, a pele como um alvo primário visível da rejeição no VCA, segue um padrão reprodutível de 4 cenários clínicos distintos de rejeição correlacionando-se com aqueles para VCA humana, conforme descrito por a classificação de trabalho Banff 2007 do VCA 42, tornando este modelo particularmente traduzível contendo pele. Assim, este modelo de ratinho altamente fiável para transplante reconstrutiva, acima de tudo, apresenta a disponibilidade de um sistema versátil modelo imunológica de estirpes de ratinhos consanguíneos e transgénicos geneticamente definidas que abre possibilidades para os estudos de diagnóstico e intervenção com impacto de translação em VCA clínica.

A necessidade de técnicas de microcirurgia básicos antes de embarcar em dominar a técnica descrita pode ser considerado como uma limitação a este modelo, no entanto, é o mesmo principal obstáculo a qualquer modelo de rato microcirúrgica. Quis, este protocolo de vídeo destina-se principalmente para fornecer o microsurgeon temperado com uma abordagem alternativa para a anastomose microvascular em um murino modelo in vivo para alotransplante composta vascularizado. Além disso, o modelo permite a transplantação de medula óssea de um componente vascularizado intactas, bem como a utilização de um modelo funcional na pesquisa a regeneração do nervo.

Em conclusão, nós estabelecemos um romance, versátil e confiável modelo do rato para o transplante ortotópico membro posterior usando uma técnica manguito não sutura que abre a porta para mecanicista básico, bem como a investigação translacional relacionadas com qualquer aspecto da VCA.

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Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Exército, Marinha, NIH, Força Aérea, VA e Assuntos de Saúde para apoiar o esforço afirm II, sob concessão No. W81XWH-13-2-0053. O Medical Research Aquisição Atividade Exército dos EUA, 820 Chandler Street, Fort Detrick MD 21702-5014 é o escritório de aquisição de adjudicação e administração. Opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as do autor e não são endossados ​​pelo Departamento de Defesa.

Os autores gostariam de agradecer Jessica Izzi, DVM, Caroline Garrett, DVM e Julie Watson, DVM pelo seu excelente apoio veterinário durante este estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Suture, 6-0 Nylon MWI 31849
Suture, 6-0 Polysorb MWI 72667
Suture, 10-0 Nylon Aero Surgical TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25 Vention Medical 141-0023
Polyimide Tubing, Size 27 Vention Medical 141-0015
Microvascular Clamps (Single) Synovis 00396
Microvascular Clamps (Double) Synovis 00414
Micro-Scissors Synovis SAS-18
Micro-Forceps Synovis FRS-15 RM-8
Micro-Dilators Synovis FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver Synovis C-14
Micro-Clamp Applicator Synovis CAF-4
Micro-Flushing Needle Hamilton 10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution Fisher Scientific NC9968051
Buprenorphine DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril Bayer Health Care 186599
Heparin Obtained from hosptial pharmacy

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