Summary
超微小血管吻合のための非縫合カフ技術を適用したマウスにおける同所後肢移植のためのこの新規モデルは、血管新生複合同種移植（VCA）に関連したin vivoでのメカニズムの免疫学的研究のための強力なツールを提供します。
Protocol
全ての実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針（NIH）に従って行ったし、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会（JHUACUC）によって承認されました。具体的な手順は、承認されたACUCプロトコルMO13M108下で行いました。
1.ドナー操作
- 手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の世話のとおりと前皮膚切開にブプレノルフィン皮下に1時間の0.1ミリグラム/キログラムBWプロトコルの使用を使用します。
- イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。手続きの開始に先立って麻酔深度を監視するためにつま先ピンチ撤退反射を実行します。
- マスク、使い捨ての分離ガウンと手袋を着用してください。
- 外科的ARを剃りますEA、特に後肢と鼠径部、および10％のポビドンで準備を - ヨウ素。
- 滅菌野ドレープ、オートクレーブ処理機器や高倍率顕微鏡（40X）を使用します。
- 半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。
- 大腿動脈、静脈や神経を特定し、解剖。鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を分離します。
- 血管茎を解剖したら、マイクロはさみを使用して、鼠径靱帯のレベルで血管を分割します。
- 次に、はさみを使用して、ドナー動物からの移植片を分離するために半ば腿のレベルで近位個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群20を分割し続けます。
- 大腿骨を横断し、はさみを使用して大腿骨シャフトの中間で切断。
- イソフルラン過剰摂取FOLにより動物を安楽死させます頚椎脱臼が続き。心拍や呼吸の停止を確認してください。
- 注射器に取り付けられた33のGフラッシング針を使用してヘパリン化2ミリリットル（30 IE）の冷（4℃）生理食塩水で手足をフラッシュ（材料表を参照してください）。
- それぞれ、大腿静脈と動脈に1ポリイミドカフを配置します。
- インセットまで湿った綿ガーゼ、4℃でペトリ皿や店舗内の所定の場所に移植片をラップします。
2.受信者の操作
- 後肢の除去
- 手術前に各薬理学的製剤のための適切な時点で鎮痛を管理します。承認された動物の管理と使用プロトコルを使用ブプレノルフィンSC 1時間前に皮膚切開の0.1ミリグラム/ kg体重あたりとして。
- イソフルランで落ち着いたドナーは4％でイソフルラン気化器に取り付けられた室を通って適用しました。ノーズコーンを介して2％で鎮静や麻酔を維持します。 DEPTを監視するために、つま先のピンチ撤退の反射を行います手続きの開始に先立って麻酔の時間。
- 麻酔下ながら乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医の軟膏を使用してください。
- 特に、10％ポビドンと後肢と脚の付け根と準備を手術領域を剃る - ヨウ素。
- 半ば腿領域に近位にはさみを使用して、脚の付け根の皮膚切開を行い、円周方向にマウス本体の残りの部分から後肢を画定するために切開部を接続します。
- 鉗子とマイクロはさみを使用して、すべての3つの構造を特定し、大腿動脈、静脈や神経を解剖し、分離します。
- 血管茎を解剖したら、鼠径靱帯のレベルで大腿血管をクランプします。
- 浅腹壁動脈のレベルで遠位血管をカットします。
- 次に、ネイティブ後肢リチウムを分離するために、近位に半ば腿のレベルで個々の腹側（薄と大腿内側の筋肉）と背側の筋肉群20を分割し続けますはさみを使用して、レシピエント動物からMB。
- はさみを使用して大腿骨シャフトの中央に大腿骨を横断。
- 切開部位の出血、したがってレシピエントの血液損失を防止するために、以前に離断大腿部の筋肉を焼灼。
- 移植
- 温かい生理食塩水（37°C）で術野を灌漑し、操作の前と後の0.3ミリリットル暖かい生理食塩水を注入することにより、流体の損失を最小限に抑えます。
- 受信者の大腿骨と移植片を整列させることによって、ネイティブ後肢の正確な解剖学的位置を反映し、髄内ロッドとして20 G脊髄針を使用してそれらを接続する方法で、移植片を置きます。
- 吸収性縫合糸材料（6-0ポリソーブ）を使用して癒合腹側と背側の筋肉群。
- 非縫合カフ技術を用いて大腿血管を接続します。詳細に、以前グラーフの容器端部に取り付けられたカフの上に容器の受信者側を引っ張りますトン。 10-0ナイロン縫合糸を使用し、袖口に受信者の容器を固定するために、円周ネクタイを行います。
- 次のクランプを解放します。この段階で視覚的にカフ回転および血管の誤回転やねじれを防止するための最適な位置を確認します。
- 筋肉の受信者ドナーインターフェースと骨の両端を中心とした電気メスを使用して細心の止血を行います。
- 非吸収性ナイロン縫合糸（6-0 Ethilon）を用いて皮膚を閉じます。
- 動物は加熱ランプの下で、そのケージに回復できるようにすることで、正常体温条件を確立します。住宅施設に戻す前に、少なくとも4時間、定期的なモニタリングを続けます。
- 3日間は0.1mg / kgをSC毎に6-8時間の用量でブプレノルフィンと術後鎮痛を提供します。
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Representative Results
非縫合カフ技術を用いて、マウスモデルにおいて血管新生複合同種移植を行うと、 図1に示すように優れ、長期間の移植および動物の生存を達成することができる。また、血管新生合成の緩やかな同種移植片拒絶反応の再現可能な結果を得るための信頼できる方法を表します。などの同種移植は、 図2に示されている画像によって文書化。拒絶を受けた動物から得られた組織のH＆E組織学はさらに、このマウスモデル（ 図3）に同種移植片拒絶反応の再現性のダイナミクスを強調しています。
すべての同系transplながら[C57BL6（H2K b）はへのBalb / C（H2K d）は]完全H2-不一致マウス系統の組み合わせ図1.同種移植片の生存。9日 - アリ（N = 10）は、長期的、未処理の同種移植片（N = 10）急性以内に拒否され、8の平均したが受け入れられました。バンフの基準に従って皮膚拒絶グレード3は、本研究では、完全な拒絶反応と考えられていた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マウス同所性後肢移植[C57BL6（H2K b）はへのBalb / C（H2K d）は図2.臨床拒否機能と完全H2-ミスマッチのダイナミクス。（A）臨床グレード0、（B）臨床グレード1、（ C）costimulで処理された臨床グレード2、（D）臨床グレード3、および（E）臨床グレード4拒絶、（F）長期存続同種移植（POD 100）エーション遮断（抗CD40モノクローナル抗体+のCTLA4Ig）ベースのレジメン。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. POD 8と同様に皮膚や筋肉同系移植における（A）と同種移植（B）のH＆E染色POD 8上の同系移植（C）と同種移植におけるフットパッドの皮膚と筋肉のH＆E染色（D ）（スケールバー：0.1μm）と 、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このような壊滅的な組織欠損の再建のための上肢と顔面移植などの血管新生したコンポジット同種移植は、従来の再建手続きに修正可能ではない患者に対する有効な治療法の選択肢として発展してきました。マイクロサージャリーの分野における技術の進歩だけでなく、強力な免疫抑制および固形臓器移植における免疫調節療法と豊富な経験は、今、このユニークな患者集団3,21の長期同種移植片の生存を可能にします。しかし、同種移植片の維持および生存のために必要な長期的な免疫抑制の重大な副作用は、まだ3,22,23救命再建モダリティを強化ではなく、これらの生命のより広い適用を制限します。また、固形臓器移植とは対照的に、のVCAの成功はまた、運動機能のための両方の筋肉を神経支配再ならびにする同種移植に受信者の神経のタイムリーな再生に依存タッチと機能を回復する温度感覚のための感覚のコンポーネント。免疫学的な観点から、移植医療のすべてのように、再建移植における包括的な目標は、長期維持免疫抑制23を必要とせずに同種移植片の受け入れを可能にする運用寛容の状態を達成することです。この点において、マウスは、無傷の免疫系における特異的寛容をアロ抗原達成する方法を調査するために、移植免疫学研究のインビボモデル系において主に表現するために進化してきました。さらに、マウスH2複合体は密接にヒトMHC複合体に似ています。このように、近交系および遺伝子型を同定マウス系統は完全に同種異系の歪みの組み合わせに同系から不整合アロ抗原の様々な程度を採用することにより、関連および非関連のリビングと死体ドナー設定の臨床シナリオをモデル化することができます。さらに、すべてのトランスジェニック動物および特定のノックアウト動物の可用性細胞やタンパク質の構成要素の選択的活性化または枯渇の可能性を提供することにより、免疫受容と拒絶上の個々の分子経路と調節機構の役割と効果のOWS調査。これは、独自に、インビトロのマウス系およびインビボ研究 24 で開発幅広い診断および治療 薬の利用可能性（ 例えば 、抗体）と並行します。全体的に、これらの側面はマウス系の基本的な移植免疫学の研究のための「ゴールドスタンダード」を作ります。
最近Brandacherらによって検討されるようVCAのために記載された様々な13,16,18,20,25,26小規模および大規模な動物14,27-29モデルがありましたが。30ごく少数が実際に基本的なメカニズムの免疫学研究16に適用可能です、24,30。マウス大腿動脈と静脈の小血管径に、それは、高度な外科的および超マイルが必要です同所性後肢移植のキーコンポーネントとして成功した吻合を実行するためのcrosurgicalトレーニングやスキル。解剖学的構造の細心かつ慎重な解剖が以前に発行されたモデル20,31,32のように、このモデルのように批判的に関連性がある一方で、カフ技術は、サブミリメートル容器16,25をとの縫合吻合に比べて少ない急な学習曲線を示しています厳格な毎日の練習と結合ヶ月の訓練で達成することができます。私たちの経験に基づいて、訓練を受けていないマイクロ手術の専門医は、高い成功率でこのモデルを実行するための十分かつ信頼性の高いスキルを習得するために30 -50手続きの試行が必要になります。経験豊富で高度な訓練を受けたマイクロ手術の専門医のために15から30までの試みはmodel.Theがここに提示手順の複雑さを低減し、このカフベースのマウス後肢移植を習得するのに十分でなければならない、さらに、このアプローチは限られた血管の長さ、したがって切開を必要とするという事実によって反映されています。我々はトンを取って見つかりました浅上腹部血管のレベルで彼鼠径靱帯におけるドナー血管および受信者の船は、カフの技術が適用できるように広範な追加の長さを必要とするという一般的な概念にもかかわらず、十分な長さを提供します。例えば、1以前に公開されたアプローチは、膝窩動脈の血管32のレベルで外部腸骨血管および受信者の血管のレベルでの収穫ドナー血管への必要性を説明しています。また、カフ技術を用いて、吻合を行うこと縫合技術に比べてより少ない時間を必要とし、全体的な減少稼働時間につながります。経験豊富な手の中に、両方のドナーとレシピエントの手順は、90分の平均で完了することができます。これは成功と周術期の生存のための重要な決定した受信者の麻酔の持続時間を延長する以前に報告された方法と比較して有意な改善です。 2-外科医のアプローチの必要前提条件31-33作ります。このモデル33で成功するための別の決定要因として、前述したようにまた、さらに吻合部からの出血に最小限のは、大幅に血液損失を低減し、これにより、受信者の蘇生液の必要性を低減するために貢献しています。最後に、カフ技術は11-0マイクロ縫合材料の高コストに比べて大幅なコスト優位性を持つメソッドを表します。したがって、非縫合カフ技術は、基礎となるプロトコルの最も重要なステップです。桐らによるエレガントな研究では、様々な異なるミオと血管新生化鼠径部の皮膚弁を含むosteomyocutaneousフラップは、マウス大腿血管茎32のオフに基づいて記載されています。ここで紹介する方法は、全体のマウスの後肢の移植のみに焦点を当てているが、提示された原理を簡単に翻訳され、様々な他の解剖学的フラップデザインで使用することができます。注目すべきは、以前の著者がautomutilationを報告しながら、という事実でありますあるいは、これは我々の経験では観察されていない31,32術後生存率の間に有意な合併症として移植片のオートファジー。さらに、急速な回復と給電とグルーミングの動物の能力の限られた障害は、移植された脚部の同所挿入図は、最低限の受信者の罹患率を与えていることを強調しています。
このビデオ公報に記載されたモデルは、さらに、以前に公開された技術と比較し、マウスの設定に明確な利点を紹介します。私たちのグループ16によって以前に報告されているようにまず第一に、カフ技術は、後肢の同種移植片の同所移植を可能にする、内腔の直径よりも小さい1ミリメートルと容器内で使用することができます。このアプローチは、両方の免疫学的に組み合わせたこのモデルを採用するだけでなく、VCA 16,25に関連する神経再生の機能研究のための基礎を提供します。神経再生をfに極めて重要です再建移植のield、これらが成功主に機能と審美的な欠陥の回復によって決定された非救命の手順も同様です。
後肢から発信osteomyocutaneousフラップの異挿入図は、外科医15に利用可能な追加モデルです。しかし、このアプローチでは、このような爪や足蹠の無毛皮膚などの潜在的な関心の構造の外科的除去は、解剖学的に改変されていない後肢同種移植片の同所移植と比較して、このメソッドの汎用性を制限します。これらの構造は手同種移植片34への機械的ストレスを負わ患者における非定型拒絶プロセスの対象として記載されているように、これは、再建移植において特に重要です。血管新生した複合組織同種移植片に対して本質的にユニークな血管新生骨が実行可能な骨髄が含まれており、constantlであるように、骨の成分であり、ドナーの免疫系の成分と前駆体ソースを更新Y。これは慎重に移植片対宿主病（GVHD）の可能なソースとしたが、これは両方の動物モデル35,36ならびにヒト37で観察されていません。 36前臨床および臨床試験38〜40に示されるように反対の多くは、実際に、ドナー骨髄移植と臓器移植との組み合わせ、または選択された骨髄由来細胞産物の輸血は、実際に免疫抑制量21を必要とに関する有利な効果を示します;いくつかのプロトコルも、薬物に基づく免疫抑制41を必要とせずに動作許容範囲を示しています。
この公報で示されたモデルと方法論は、同系のドナーで100％の長期動物の生存が得られた-受信者の組み合わせ（ 図1）と同様にグラフトacceptaのよく特徴付けられたパターンを示しました同種異系の歪みの組み合わせでNCEと拒絶反応を図2＆3で概説されるように。また、VCAにおける拒絶反応の可視主なターゲットとしての皮膚は、人間のVCAのものと相関拒絶反応の4つの異なる臨床シナリオの再現可能なパターンに従うことによって概説されるようにこのモデルは、特に、翻訳すること皮膚含有VCA 42のバンフ2007年の作業の分類、。したがって、上記のすべての再建移植のためのこの信頼性の高いマウスモデルは、臨床VCAに翻訳インパクトのある診断と介入研究のための可能性を開く遺伝学的に定義された近交系およびトランスジェニックマウス系統の多目的な免疫学的モデルシステムの可用性を紹介します。
記載された技術の習得に着手する前に、基本的な顕微手術技術の必要性は、このモデルの制限とみなすことができるが、それは任意のマウス顕微モデルに同じ主な障害です。木Sは、このビデオプロトコルは、主に血管新生複合同種移植のための生体内モデルにおけるマウスにおける微小血管吻合術に代わるアプローチで味付けマイクロ手術の専門医を提供することを目的とします。さらに、モデルは、無傷の血管新生骨髄成分の移植、ならびに神経再生研究の機能モデルの使用を可能にします。
結論として、我々は、非縫合カフ基本的な機序への扉を開く技術だけでなく、VCAのあらゆる側面に関連したトランスレーショナルリサーチを使用して、同所性後肢移植のための新規な、汎用性、および信頼性の高いマウスモデルを確立しました。
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Acknowledgments
この作品は賞号W81XWH-13-2-0053の下で、AFIRM II努力をサポートするために、陸軍、海軍、NIH、空軍、VAおよび保健省によってサポートされていました。米陸軍医学研究買収活動、820チャンドラーストリート、フォート・デトリックMD 21702から5014までは表彰および管理取得オフィスです。ご意見、解釈、結論と勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省によって承認されていません。
著者らは、この研究の間に、その優れた獣医のサポートのためにジェシカイッチ、DVM、キャロライン・ギャレット、DVMとジュリー・ワトソン、DVMに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Suture, 6-0 Nylon | MWI | 31849 | |
| Suture, 6-0 Polysorb | MWI | 72667 | |
| Suture, 10-0 Nylon | Aero Surgical | TK-107038 | |
| Polyimide Tubing, Size 25 | Vention Medical | 141-0023 | |
| Polyimide Tubing, Size 27 | Vention Medical | 141-0015 | |
| Microvascular Clamps (Single) | Synovis | 00396 | |
| Microvascular Clamps (Double) | Synovis | 00414 | |
| Micro-Scissors | Synovis | SAS-18 | |
| Micro-Forceps | Synovis | FRS-15 RM-8 | |
| Micro-Dilators | Synovis | FRS-15 RM-8d.1 | |
| Micro-Needledriver | Synovis | C-14 | |
| Micro-Clamp Applicator | Synovis | CAF-4 | |
| Micro-Flushing Needle | Hamilton | 10MM, 30°, 33G | |
| Lactated Ringers Solution | Fisher Scientific | NC9968051 | |
| Buprenorphine | DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy. | ||
| Enrofloxacin; Baytril | Bayer Health Care | 186599 | |
| Heparin | Obtained from hosptial pharmacy |
References
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