Orthotopic bakbenen Transplantation i musen

Summary

Denna nya modell för orthotopic bakbenen transplantation hos mus, applicera en icke-sutur manschetten teknik för supermikrovaskulär anastomos, ger ett kraftfullt verktyg för in vivo mekanistisk immunologisk forskning relaterad till vaskulariserad kompositallotransplantation (VCA).

Protocol

Alla experiment utfördes i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur i National Institute of Health (NIH) och godkändes av Johns Hopkins University Djurvård och användning kommittén (JHUACUC). De särskilda förfaranden utfördes under det godkända ACUC protokoll MO13M108.

1. Donator Drift

1. Administrera analgesi vid lämplig tidpunkt för varje farmakologisk formulering före operation. Enligt den godkända djurvård och använda protokoll användning 0,1 mg / kg kroppsvikt av buprenorfin subkutant en timme före hudsnitt.
2. Stillsam givaren med isofluran appliceras genom en kammare ansluten till en isofluran förångare vid 4%; upprätthålla sedering och anestesi på 2% genom en noskon. Utför tå nypa tillbakadragande reflektion för att övervaka djupet av anestesi före inledandet av förfarandet.
3. Bär masker, engångsisoleringsrockar och handskar.
4. Raka den kirurgiska area, i synnerhet bakbenet och ljumske, och prep med 10% povidon - jod.
5. Använd ett sterilt område duk, autoklaveras instrument och en hög förstoring mikroskop (40X).
6. Göra ljumske hudsnitt med sax proximalt till området mitten av låret och periferiellt förbinda snittet för att avgränsa bakbenet från resten av musen kroppen.
7. Identifiera och dissekera lårbensartären, ven och nerv. Separera alla tre strukturer med hjälp av pincett och mikro-sax.
8. En gång den vaskulära pediculus dissekeras dela kärlen vid nivån för inguinal ligament använder mikro sax.
9. Därefter fortsätter att dela de enskilda ventrala (gracilis och mediala lårmusklerna) och ryggmuskelgrupper ²⁰ proximalt i nivå med mitten av låret för att separera transplantatet från donatordjuret med sax.
10. Transekt lårbenet och skär i mitten av lårbensskaftet med sax.
11. Avliva djur med isofluran överdos followed genom cervikal dislokation. Bekräfta upphörande av hjärtslag och andning.
12. Spola lemmen med 2 ml hepariniserade (30 IE) kallt (4 ° C) saltlösning med användning av en 33 G spolningsnålen monterad på en spruta (se Material tabell).
13. Placera en polyimid manschetten på lårbensvenen och artären, respektive.
14. Wrap transplantat i våt gasväv, plats i petriskål och förvara vid 4 ° C tills infälld.

2. Mottagare Drift

1. Avlägsnande av Hind Limb
   1. Administrera analgesi vid lämplig tidpunkt för varje farmakologisk formulering före operation. Enligt den godkända djurvård och använda protokoll användning 0,1 mg / kg kroppsvikt av Buprenorfin SC 1 timme före hudsnitt.
   2. Stillsam givaren med isofluran appliceras genom en kammare ansluten till en isofluran förångare vid 4%; upprätthålla sedering och anestesi på 2% genom en noskon. Utför tå nypa tillbakadragande reflektion för att övervaka avdh av anestesi före inledandet av förfarandet.
   3. Använd veterinär salva på ögonen på musen för att förhindra torrhet under narkos.
   4. Raka operationsområdet, i synnerhet bakbenen och ljumske och prep med 10% povidon - jod.
   5. Göra ljumske hudsnitt med sax proximalt till området mitten av låret och periferiellt förbinda snittet för att avgränsa bakbenet från resten av musen kroppen.
   6. Identifiera och dissekera lårbensartären, ven och nerv och separera alla tre strukturer med hjälp av pincett och mikro-sax.
   7. När kärl pediculus dissekeras, klämma lårbens fartyg på samma nivå som inguinal ligament.
   8. Skär fartyg distalt i nivå med den ytliga epigastrisk artär.
   9. Därefter fortsätter att dela de enskilda ventrala (gracilis och mediala lårmusklerna) och ryggmuskelgrupper ²⁰ proximalt i nivå med mitten av låret för att separera den nativa hind limb från de mottagande djuren med hjälp av sax.
   10. Transekt lårbenet i mitten på den femorala benpipan med sax.
   11. Bränna tidigare avskurna lårmusklerna för att förhindra blödning av dissektion plats och därmed mottagarens blodförlust.
2. Implantation
   1. Minimera vätskeförlust genom bevattning operationsfältet med varm saltlösning (37 ° C) och injicering av 0,3 ml varm saltlösning före och efter operationen.
   2. Placera graften på ett sätt som återspeglar den exakta anatomiska läget för den nativa bakbenet genom inriktning av lårbenet hos mottagaren och transplantatet och ansluta dem med hjälp av en 20 G spinalnål såsom en intramedullär stav.
   3. Coapt de ventrala och dorsala muskelgrupper med hjälp av absorberbara suturmaterial (6-0 Polysorb).
   4. Anslut lårbens fartyg som använder den icke-sutur manschetten teknik; i detalj, dra mottagaren fartygssidan över manschetterna tidigare monterad på fartyget ändar graft. Använd en 10-0 Nylon sutur och utföra en omkrets slips att fixa det mottagande fartyget på manschetten.
   5. Nästa frigöra klämmorna. I detta skede visuellt kontrollera manschetten rotation och optimal placering för att förhindra felaktig rotation och snor av fartygen.
   6. Utför noggrann hemostas med hjälp av elektro diatermi med särskild inriktning på muskeln mottagaren donatorgränssnitts och benändarna.
   7. Stäng huden med hjälp av icke-absorberbara Nylon suturer (6-0 Ethilon).
   8. Fastställa normotermisk villkor genom att låta djuret att återhämta sig i sin bur under en värmelampa. Fortsätt regelbunden övervakning under minst fyra timmar innan den släpps ut i bostadsanläggning.
   9. Ge postoperativ smärtlindring med buprenorfin vid en dos av 0,1 mg / kg SC varje 6-8 h under 3 dagar.

Representative Results

Utföra vaskulariserad kompositallotransplantation i en musmodell med hjälp av en icke-sutur manschetten teknik gör det möjligt att uppnå utmärkt och lång sikt transplantat och djuröverlevnad som visas i figur 1. Dessutom är det en tillförlitlig metod för att erhålla reproducerbara resultat av gradvis allograftavstötning i vaskulariserad komposit allotransplantation som dokumenterats av bilderna som visas i figur 2. H & E histologi av vävnader från djur som genomgår avstötning understryker reproducerbara dynamiken i allograftavstötning i denna musmodell (Figur 3) ytterligare.

Figur 1. allograftöverlevnad i en helt H2-inkompatibla musstam Kombination [Balb / c (H2K ^d) i C57BL6 (H2K ^b)]. Även om alla syngen Transplmyror (n = 10) godtogs långsiktigt obehandlade allotransplantat (n = 10) var akut avvisade inom och genomsnitt 8 - 9 dagar. Hud avslag grad 3 enligt Banff kriterier ansågs helt avslagits i denna studie. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Kliniska Avslag Funktioner och dynamik en helt H2-inkompatibla [Balb / c (H2K ^d) i C57BL6 (H2K ^b)] Murin Orthotopic bakbenen transplantation. (A) Clinical Grade 0, (B) Klinisk Grade 1 ( C) klinisk grad 2, (D) klinisk grad 3, och (E) klinisk grad 4 avstötning, (F) på lång sikt överlevande allogena transplantatet (POD 100) behandlades med en costimulation blockad (antiCD40 mAb + CTLA4Ig) baserade behandlingen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. H & E färgning av hud och muskler i en syngen transplantation (A) och allogen transplantation (B) på POD 8 samt H & E färgning av trampdynan hud och muskler i en syngen transplantation (C) och allogent transplantat på POD 8 (D ) (Skala bar. 0,1 pm) klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Vaskulariserade Composite allotransplantation, såsom de övre extremiteterna och ansiktet transplantation för återuppbyggnaden av förödande vävnadsdefekter, har utvecklats som ett giltigt behandlingsalternativ för patienter som inte som kan ändras konventionella rekonstruktiv förfaranden. Tekniska framsteg inom området för rekonstruktiv mikro samt en omfattande erfarenhet med potent immunsuppressiv och immunmodulerande behandlingar i fast organtransplantation, gör det nu möjligt långtids allograftöverlevnad i denna unika patientpopulation ^3,21. Men betydande biverkningar av långvarig immunsuppression som krävs för allograft underhåll och överlevnad fortfarande begränsar bredare tillämpning av dessa liv öka men inte livräddande rekonstruktiv modaliteter ^3,22,23. Vidare framgång VCA enheter i motsats till fasta organtransplantat beror också på tid förnyelse av mottagande nerver i allograft att åter innerverar båda musklerna för motorik, samtsensoriska komponenter för beröring och temperatur sensation att återfå funktionen. Ur en immunologisk perspektiv, som i alla transplantationsmedicin, är det övergripande målet i rekonstruktiv transplantation för att uppnå ett tillstånd av operativ tolerans möjliggör för godkännande av ett allograft utan behov av långsiktigt underhåll immunosuppression ^23. I detta avseende har musen utvecklats för att representera de viktigaste in vivo modellsystem inom transplantationsimmunologi forskning för att undersöka sätt att uppnå alloantigenspecifik tolerans i ett intakt immunsystem. Dessutom mus H2 komplexet liknar den mänskliga MHC-komplexet. Således, inavlade och genotypade musstammar tillåter att modellera kliniska scenarier av relaterade och icke-relaterade levande och avliden donator inställningar genom att använda olika grader av alloantigen obalansen från en syngen till en fullt allogen stam kombination. Tillgången av transgena djur och specifika knockoutdjur dessutom allaöden undersökning av rollerna och effekterna av enskilda molekylära vägar och regleringsmekanismer på immun acceptans och avvisande genom att tillhandahålla möjligheten av en selektiv aktivering eller utarmning av cell eller proteinkomponenter. Detta parallellt med en bred tillgång till diagnostiska och terapeutiska medel (t.ex.., Antikroppar) unikt utvecklade för mus system för in vitro och in vivo-studier ^24. Sammantaget dessa aspekter gör det murina systemet "gold standard" för grundläggande transplantation immunologi forskning.

Även om det har varit olika små ^{13,16,18,20,25,26} och stora djur ^14,27-29 modeller som beskrivs för VCA som nyligen granskats av Brandacher et al. ³⁰ endast mycket få är faktiskt gäller för grund mekanistisk immunologisk forskning ^{16 , 24,30.} Grund av den lilla kärldiameter av musen femoral artär och ven, det kräver avancerade kirurgiska och super-microsurgical utbildning och kompetens för att utföra framgångsrika anastomos som nyckelkomponent i orthotopic bakbenen transplantation. Medan noggrann och noggrann dissektion av de anatomiska strukturerna är så kritiskt relevant i denna modell som i tidigare publicerade modeller ^20,31,32, har manschetten tekniken visat en mindre brant inlärningskurva jämfört med sutur anastomos av sub-millimeter fartyg ^16,25 och kan uppnås på ett par månaders utbildning med rigorösa dagliga praktiken. Baserat på vår erfarenhet, kommer en otränad microsurgeon behöver 30 -50 förfarande försök att förvärva tillräckliga och tillförlitliga kompetens för att utföra den här modellen med höga andelen framgångsrika. För den erfarna och välutbildade microsurgeon 15 - 30 försök borde räcka för att bemästra denna manschett baserade musens bakben transplantation model.The minskad komplexitet i förfarandet som presenteras här är ytterligare återspeglas av det faktum att denna metod kräver begränsad fartygets längd och därmed dissektion. Vi fann att ta than levererande fartyg på inguinal ligament och mottagande fartyg på samma nivå som de ytliga epigastrisk fartyg ger tillräcklig längd, trots den gemensamma uppfattningen att manschetten tekniken kräver omfattande extra längd för att kunna tillämpas. Till exempel, beskriver en tidigare publicerad metod nödvändigheten att skörda levererande fartyg på samma nivå som den yttre höft fartyg och mottagande fartyg på samma nivå som de Poplietallymfknutor fartyg ^32. Dessutom med manschetten teknik, utför anastomosen kräver mindre tid jämfört med suturen tekniken och leder till en total minskad drifttid. I erfarna händer, kan både givare och mottagare förfaranden slutföras i genomsnitt 90 minuter. Detta är en betydande förbättring jämfört med tidigare rapporterade metoder där utökade varaktigheten av mottagarens anestesi var en avgörande faktor för framgång och perioperativ överlevnad; vilket gör behovet av en två-kirurg närmar sig en förutsättning ^31-33.Dessutom minimal eller ingen blödning från anastomos ytterligare bidrar till kraftigt minskad blodförlust och därmed minskar behovet av vätsketillförsel av mottagarna, som beskrivits tidigare som en annan faktor för framgång i denna modell ^33. Slutligen representerar manschetten tekniken en metod med en betydande kostnadsfördel jämfört med de höga kostnaderna för 11-0 mikro suturmaterial. Således representerar den icke-sutur manschetten teknik det mest kritiska steget i det underliggande protokollet. I en elegant studie av Tung et al., Olika olika myo- och osteomyocutaneous flikar inklusive en vaskulariserad ljumske hudflik har beskrivits baserat bort av musen lårbens fartyget pedicle ^32. Medan metod som presenteras här fokuserar enbart på transplantation av hela musens bakben, kan de presenterade principer lätt översättas och användas i olika andra anatomiska lock design. Anmärkningsvärt är det faktum att medan tidigare författare rapporterar automutilationeller autophagy av transplantatet som en betydande komplikation vid postoperativ överlevnad ^31,32 detta har inte observerats i vår erfarenhet. Dessutom understryker snabb återhämtning och begränsad försämring av djurets förmåga att utfodring och grooming att orthotopic indrag det transplanterade benet orsakar endast minimal mottagare sjuklighet.

Den modell som beskrivs i den här videon publikation dessutom införs tydliga fördelar för inställningen mus jämfört med tidigare publicerade tekniker. Först och främst, som tidigare rapporterats av vår grupp ^16, manschetten tekniken kan användas i kärl med en lumendiameter mindre än en millimeter, vilket möjliggör orthotopic transplantation av en bakbenet allograft. Denna metod utgör grunden för att använda denna modell kombineras i både immunologiska samt funktionella studier av nervregeneration relaterade till VCA ^16,25. Nervregeneration är av central betydelse för field rekonstruktiv transplantation, eftersom dessa är spar procedurer för icke-livs vars framgång bestäms främst av återställandet av funktionella och estetiska defekter.

Den heterotopisk indrag en osteomyocutaneous klaff som härrör från bakbenet är en ytterligare modell tillgänglig för kirurgen ^15. Vid detta tillvägagångssätt emellertid kirurgiskt avlägsnande av strukturer av potentiellt intresse, såsom spikar och kal huden på fotsulan, begränsar mångsidigheten hos denna metod jämfört med orthotopic transplantation av en anatomiskt obearbetat bakbens allograft. Detta är av särskilt intresse för rekonstruktiv transplantation eftersom dessa strukturer har beskrivits som mål för atypiska avstötningsprocesser hos patienter utsätter mekanisk spänning till sin hand allografter ^34. Naturligt är unik för en vaskulariserad vävnad allograft kompositen är benet komponenten, som vaskulariserad ben innehåller livskraftig benmärg och är en constantly förnya källa av komponenter och prekursorer av givarimmunsystemet. Även om detta var försiktigt betraktas som en möjlig källa för graft versus host disease (GvHD), inte har observerats i både djurmodeller ^35,36 liksom människor ^37. Mycket till motsatsen faktiskt, såsom visas i prekliniska ³⁶ och kliniska studier ^38-40, kombinationen av organtransplantation med donatorbenmärgstransplantation eller transfusion av utvalda benmärgshärledda celler som faktiskt visar fördelaktiga effekter när det gäller mängden immunsuppression behövs ²¹ ; vissa protokoll har även visat operativa tolerans utan behov av läkemedels immunsuppression ^41.

Modellen och metoden framgår av denna publikation gav 100% långsiktig djuröverlevnad i syngena donator - mottagande kombinationer (Figur 1) samt visade en väl karakteriserade mönster av transplantat Acceptaiou och avslag i allogena stammen kombinationer som beskrivs i figurerna 2 och 3. Dessutom huden som en synlig primära målet för avslag i VCA, följer ett reproducerbart mönster av 4 olika kliniska scenarier för avstötning korrelerar med de för human VCA som beskrivs av Banff 2007 arbets klassificering av huden innehåller VCA ^42, vilket gör den här modellen särskilt översättnings. Således, denna mycket tillförlitlig musmodell för rekonstruktiv transplantation framför allt introducerar tillgång till en mångsidig immunologiskt modellsystem av genetiskt definierade inavlade och transgena musstammar som öppnar möjligheter för diagnostiska och interventionella studier med translationella inverkan på klinisk VCA.

Behovet av grundläggande mikro färdigheter innan man börjar på att behärska den beskrivna tekniken kan betraktas som en begränsning till denna modell, men det är samma främsta hindret för varje mus mikro modell. torss, är den här videon protokoll i första hand avsedd att ge den rutinerade microsurgeon med ett alternativ till mikrovaskulär anastomos i en mus in vivo modell för kärlkompositallotransplantation. Vidare medger för transplantation av en intakt vaskulariserad benmärgs komponenten, såväl som användningen av en funktionell modell i nervregeneration forskning modellen.

Sammanfattningsvis har vi etablerat en ny, mångsidig och tillförlitlig musmodell för orthotopic bakbenen transplantation med hjälp av en icke-sutur manschetten teknik som öppnar dörren till grundläggande mekanistisk, samt translationell forskning med anknytning till någon aspekt av VCA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Suture, 6-0 Nylon	MWI	31849
Suture, 6-0 Polysorb	MWI	72667
Suture, 10-0 Nylon	Aero Surgical	TK-107038
Polyimide Tubing, Size 25	Vention Medical	141-0023
Polyimide Tubing, Size 27	Vention Medical	141-0015
Microvascular Clamps (Single)	Synovis	00396
Microvascular Clamps (Double)	Synovis	00414
Micro-Scissors	Synovis	SAS-18
Micro-Forceps	Synovis	FRS-15 RM-8
Micro-Dilators	Synovis	FRS-15 RM-8d.1
Micro-Needledriver	Synovis	C-14
Micro-Clamp Applicator	Synovis	CAF-4
Micro-Flushing Needle	Hamilton		10MM, 30°, 33G
Lactated Ringers Solution	Fisher Scientific	NC9968051
Buprenorphine			DEA Number required; Obtained from hosptial pharmacy.
Enrofloxacin; Baytril	Bayer Health Care	186599
Heparin			Obtained from hosptial pharmacy