Introduction
Çok hücreli 3D sferoidler ancak birçok katı kanser için bir in vitro model olarak daha yaygın hale gelmiş ancak son zamanlarda, on bir tümör modeli olarak bilinmektedir. Bunlar giderek daha karmaşık, pahalı ve zaman alıcı in vivo modellerde ve basit, düşük maliyetli 2D tek tabakalı modeli 1-6 arasında bir ara ürün olarak yüksek verimli ilaç keşif ekranlarında kullanılmaktadır. 2B kültüründe çalışmalar genellikle in vivo olarak çoğaltılması mümkün değildir. Birçok kanser tiplerinin Sferoid modelleri büyüme karakteristiklerine, ilaç duyarlılığı, ilaç nüfuzu, hücre-hücre etkileşimi, katı tümörler 6-11, in vivo görülür oksijen ve besin maddeleri ve nekroz gelişiminin kısıtlı durumu taklit etmek mümkündür. Sferoidler sfero 7 periferisinde bir nekrotik çekirdeği, bu çekirdeği soran sakin ya da G1 tutuklandı bölge ve çoğalan hücreleri geliştirme. Bu bölgelerin gelişimiHücre yoğunluğu, proliferasyon hızı ve küremsi 12 boyutuna bağlı olarak değişebilir. Bu farklı alt bölgelerde görülen hücresel heterojenite kanser tedavisi direnci 13,14 katkıda bulunabileceği öne sürülmüştür. Bu nedenle, bu bölgelerdeki hücrelerin analiz yeteneği ayrı anlayış tümör ilaç yanıtları için çok önemlidir.
Hücre döngüsünün 15 farklı aşamalarında bozulmuş olan Cdt1 ve geminin floresan etiketleme, - ve yeşil (AG Azami Green) - floresan ubikitinasyon hücre döngüsü göstergesi (Fucci) sistemi kırmızı (KO Kusabira Turuncu) dayanmaktadır. Böylece hücre çekirdekleri erken S sarı, G1 kırmızı ve S / G2 / M fazında yeşil görünür. Biz burada iki tamamlayıcı yöntemler tarif hem hücreler G1 tutuklandı merkezi veya dış proliferatin ikamet olup olmadığını belirlemek için görüntüleme yazılımı veya tahlil sitometri bir boya difüzyon akışı kullanımı ile birlikte, hücre döngüsünü belirlemek için Fucci kullanarakg halkası ve sfero kenarından tek tek hücrelerin mesafe. Ve / veya hedeflenen terapilerin mevcudiyetinde uzun bir süre için durması G1 kalması mümkün ve yeniden olabilir Bu yöntemler, biz sfero merkezinde hipoksik bölgelerinde bu melanoma hücreleri göstermiştir önceki yayında, geliştirilmiştir daha elverişli şartlar ortaya çıktığında 7 hücre döngüsü girin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fucci Transdüksiyonu ve Hücre Kültürü
- Fucci iletimi
- Stabil Fucci ifade eden hücre hatları oluşturmak, daha önce 7 açıklandığı gibi lentivirüs ko-transdüksiyonunun kullanarak mKO2-hCdt1 (30-120) ve MAG-hGem (1-100) 15 oluşturur.
Not: Fucci sistemi şimdi ticari olarak elde edilebilir. - Tek hücreli sıralama ile parlak floresan ile alt klonları oluşturun. Bir 96-yuvalı plaka içine flüoresan aktifleşmiş hücre sıralaması ile AG ve KO (sarı) hem pozitif Sıralama, tek hücreler, daha önce tarif edildiği 7,16.
- Stabil Fucci ifade eden hücre hatları oluşturmak, daha önce 7 açıklandığı gibi lentivirüs ko-transdüksiyonunun kullanarak mKO2-hCdt1 (30-120) ve MAG-hGem (1-100) 15 oluşturur.
- Melanom hücre kültürü
- Kültür C8161 insan melanoma hücresi, daha önce tarif edildiği 7,17.
2. 3B küre formasyonu (daha önce tarif edilen 3,9)
- Agaroz plaka hazırlığı
- Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya fosfat Buffere, 100 ml% 1.5 agaroz (ya da asal agar) çözündürünGirdap şeklinde karıştırarak 3-5 dakika süreyle mikrodalgada kaynatılarak d salin (PBS). Agaroz tamamen çözülmüş olduğundan emin olun.
- Derhal bir çok kanallı pipet kullanarak, düz tabanlı 96 oyuklu doku kültürü plakası oyuk başına agaroz çözeltisi 100 ul dağıtmak.
Not: Agaroz, kısa bir süre sonra ipuçları katılaşabilir birden fazla agaroz levhası yapmak, bu sorun, uçları plakalar arasında değiştirilmelidir üstesinden gelmek için. - En az 1 saat süre ile agaroz sertleşmeye düz bir yüzeye 96 oyuklu plaka bırakın.
- Agaroz üzerine Hücre hazırlanması ve bindirme
- T75 şişesi içinde% 80 karışacak hücreleri büyütün. HBSS, 10 ml ile yıkayınız.
- Normal ortam, 10 ml% 0.05 tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve tekrar süspansiyon 1.5 ml kullanarak hücreleri ayırın.
- Hemasitometre 18 veya diğer otomatik sayım yöntemi kullanılarak hücre sayımı.
- Normunda 25.000 hücre / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar yeniden süspanse hücrelerinal ortamı.
- Oyuk başına 5000 hücre nihai sayıda hücre süspansiyonu 200 ul agaroz kuyu Yerleşimi.
- Hücre kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 ve 37 ° C) geri plakaları üzerinde yaklaşık olarak 3 gün küreler oluşturma.
Not: bir küremsi oluşturulması için geçen zaman, farklı hücre hatları arasında değişir. Bazı hücre çizgileri de bu yöntemi kullanarak sferoidler oluşturmazlar. - 4x objektif ve bir faz kontrast filtresi kullanılarak bir inverted mikroskop ile görüntü sfero morfolojisi. Başarılı bir şekilde sferoidler, kompakt, kabaca küre şeklindeki hücre agrega üretecek ve oyuk başına sadece bir küremsi olmalıdır oluşturan bir hücre çizgisi.
Not: İsteğe bağlı: sferoidler oluşturmuşlardır sonra, bu büyüme ve invazyon 3,7,17 ve daha fazla analiz için kolajen ya da diğer matris içine transplante edilebilir. Kollajen spher için yeterli çözünene kadar 37 ° C 'de 2 mg / ml kollajenaz 500 ul ile tedavi, kollajen sferoidler kaldırmak içinOID'ler medya (yaklaşık 30 dakika) içine serbest gelmek. Yavaşça 1 ml pipet kullanarak parçacıklarının kaldırın. - Kesit için / görüntüleme (kollajen izole edilmiş ya da agaroz üzerinde 3-5 gün için büyütülmüştür olarak)% 10 nötr tamponlu formalin içinde düzeltme sferoidler (DİKKAT: Formol bir çeker ocak kullanılmalıdır), oda sıcaklığında en az 2 saat boyunca (RT) 4 ° C'de ya da gece (O / N). Sferoidler birkaç gün 4 ° C'de HBSS depolanabilir.
3. Sfero Vibratome Kesit
- Mikrodalgada 500 ml'lik bir cam şişeye HBSS 100 ml düşük erime noktasına sahip agaroz 5 g çözündürülür. Dönen bir orta ısı ayarını kullanın. DİKKAT: Basınç serbest böylece çözüm kaynar zaman gevşek kapağı tutun. Sıcak cam şişe tutarken yanık elleri korumak için koruyucu ısıya dayanıklı eldiven kullanın.
- Agaroz hafifçe soğuyana kadar bekleyin - bu yüzden şişe elleri yakmadan dokundu edilebilir.
- Approxima dökünbir Coulter sayacı fincan ya da benzeri plastik kalıp tabanına agaroz tely 2 mi. Hemen sıvı mümkün olan en küçük hacimde 1 ml pipet kullanılarak (bakınız bölüm 2.2.8) sabit sfero aspire. Agaroza sfero ekleyin. (10'a kadar) bir kaç sferoidler fincan başına eklenebilir.
- Agaroz 2 mi daha fazla parçacıklarının örtün. İkinci katman eklenmeden önce agaroz sertleşmesini önlemek için hızlı bir şekilde yapın.
- Agaroz, en az 3 saat süreyle karanlıkta oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Bu noktada bardak 2-3 4 ° C'de kısa bir süre için muhafaza edilebilir HBSS ml su kaybını önlemek için üst üste.
- Bardaktan agaroz çıkarın. O Vibratome metal blok üzerine oturur ve sferoidler agaroz üstüne yakın şekilde parçacıklarının içeren agaroz Trim. Sferoidler agaroz içindeki küçük beyaz nesneler olarak görülebilir. Süper blok agaroz tutkal.
- Damıtılmış su ile doldurun ve Vibratome vibratome blok monte edin. Yı kurVibratome düşük hızda (ayar 2) ve yüksek titreşim (8 ayar) kullanarak 100 mikron bölümleri kesmek için. 16 ° kesme bıçağı açısını ayarlayın. , Vibratome aç vibratome ışığını açmak ve 100 mikron sfero kesitler kesilir kadar agaroz üst bölümleri kesmek. 24 oyuklu bir plaka içerisinde HBSS kesilmiş sferoid bölümleri yerleştirin.
- Görüntü analizi için orta bölümleri seçin. Cımbız kullanarak slayt üzerine bölüm düz transfer ederek slaytlar Mount bölümleri. Vakum yağ ile bir 10 ml'lik bir şırınga gövdesi içinde doldurmak; slayt kenarları kapalı çalışan montaj medya önlemek ve lamel altında bölümüne mühür yardımcı olmak amacıyla bölümünün kenarlarında vakum gres ince bir çizgi ekleyin. Montaj orta ve bir lamel ile bölüm örtün. Oje ile lamel kenarları mühür. Mağaza görüntüleme önce 4 ° C'de slaytlar.
4. Konfokal Resim Alma
- Bir 10X kullanarak bir orta Fucci küremsi bölümünün z-dilim görüntü almakveya 20X objektif olarak önceden 7 nitelendirdi. Çakışma ya da karışma Kusabira ORANGE2 ve Azami Green arasında meydana emin olun. Birden sfero bölümleri arasındaki görüntü analizi karşılaştırarak ise, lazer gücü ve diğer ayarları örnekler arasında aynı tutmak.
Akış Sıralama için 5. Hoechst Dye Difüzyon Deneyi
- 15 ml tüp canlı parçacıklarının (agaroz tohumlama sonrası 3-5 gün) aktarın. Sferoidler yerçekimi tüpün dibine dinlendiriniz. Birkaç sferoidler tüp başına lekeli olabilir. Yaklaşık 20 sferoidler akış sitometrisi için yeterli hücre sayıları elde etmek için ihtiyaç duyulmaktadır.
- Aşırı orta çıkarın ve normal ortam içinde seyreltilmiş 10 uM Hoechst 1 ml. Yaklaşık 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin parçacıklarının. Inkübasyon sırasında bir veya iki kez parçacıklarının tekrar süspansiyon hafif iterek kullanın.
Not: Kuluçka süresi Hoechst boya küremsi nüfuz ne kadar değiştirilmesi için değiştirilebilir. Bu göre değişirküremsi boyutu, yoğunluğu ve hücre çizgisi. Bazı büyük / yoğun küremsiler için% 100'den daha az olan maksimum bir boya penetrasyonu olabilir. - Gravite çökelmesi ile 5 ml HBSS ile hafifçe sferoidler yıkayın.
- İsteğe bağlı: boya penetrasyonu görüntüleme için: 4 ° C'de oda sıcaklığında veya O / N, en az 2 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin ile parçacıklarının sabitleyin. , Vibratome bölümleri hazırlayın Yukarıdaki adımlarda 3 ve 4'te açıklandığı gibi konfokal slaytlar ve görüntü üzerinde monte edin.
- Birbirinden sferoidler kırmak için her 10 dakikada bir iterek yaklaşık 30 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.05 tripsin / EDTA, 1 ml sitometrisi trypsinize sferoidler akışı için hücreleri hazırlamak için.
Not: sferoitlerin tek bir hücre süspansiyonu içine almak zor koşullar optimize edilmesi gerekebilir. Bu işlemden sonra C8161 4 günlük küremsi Canlılık yaklaşık 95% 'dir. - Üreticilerin protokole göre bir yakın kızıl ötesi canlı / ölü boyası ile Leke hücreleri. Daha sonra, 1 ile düzeltmek HBSS ile yıkayınyaklaşık 30 dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin mi. Hücreler akış analizden önce birkaç gün süreyle 4 ° C'de HBSS depolanabilir.
Hoechst Lekeli Fucci sferoidlerin 6. Akım Sitometri Analizi
- Sağlamak hücreler, bir hücre süzgecinden geçirilmesiyle clumped değildir. Hoechst 1-5 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda (% 5 fetal dana serumu ile PBS) buz gibi soğuk FACS yıkama Fucci sferoidler lekeli yeniden süspanse edin. Yuvarlak 5 ml alt tüpler numune 200 ul aktarın.
- 6.1 açıklandığı gibi aşağıdaki tek renk kontrol örnekleri hazırlayın: un lekeli melanoma hücreleri; Yapışkan melanom hücrelerinin 1 saat boyunca 10 uM Hoechst ile boyandı; Azami Green, sadece melanoma hücreleri ifade edilmesi; ve Kusabira Turuncu yalnızca melanoma hücreleri sentezleyen.
Not: Tek renkli kontrol haftalar ya da aylar boyunca 4 ° C 'de,% 0.1 sodyum azid ile yıkama formalin içinde sabitlenmiş ve FACS depolanabilir. - Run tek hücre süspansiyonları oDaha önce olduğu gibi uygun lazerler ve tek renkli / boyanmamış denetimleri ile analizör sitometri na akışı 7,16 nitelendirdi.
- Aşağıdaki gibi dış sfero hücreleri vs iç analiz etmek gibi FlowJo gibi ticari sitometri yazılımını kullanın:
- İleri Dağınık Işık Yan Dağınık Işık (SSC) karşı (FSC) ana hücre popülasyonu üzerinde yolluk pislikleri temizleyin.
- FSC vs FSC (Alan) (Yükseklik) kullanan tek hücreler üzerinde yolluk çiftleri kaldır
- Canlı / ölü düşük nüfus yolluk canlı hücreler için Kapısı.
- Hoechst "dış" hücreleri olarak Hoechst ile boyanmış yapışık hücrelere olumlu sinyale göre kapılı yüksek hücreler, tanımlayın.
- "Iç" hücreleri gibi, un-boyanmış kumanda sinyaline dayalı kapılı Hoechst düşük ya da negatif hücreler, tanımlayın.
- Iç ve dış nüfusta geçildikten sonra, hücreler daha da Fucci yeşil kırmızı (G1), sarı (erken S), (S / G2 / M) veya negatif (erken G1) için kapı olabilir.
Not: Ctek renk kontrollerini kullanarak ompensation düzgün Fucci, kırmızı, sarı, yeşil ve negatif popülasyonları tanımlamak için gerekli olabilir.
- Deney optimize edilmiş ve Hoechst penetrasyon konfokal mikroskopi ile doğrulandıktan sonra, daha önce canlı hücre alt-popülasyonlarının daha fazla analiz için 7,16 tarif edildiği gibi bir akış hücre sıralayıcı üzerine sabitlenmesi hücrelere çalıştırın.
Fucci Sfero Bölüm 7. Görüntü Analizi
- Açık yazılım, örneğin. Volocity, miktar tayini SADECE yapılandırmayı seçin.
- Yeni bir kitaplık oluşturun. Kütüphaneye konfokal ham veri dosyası sürükleyerek yazılımı içine Fucci sfero konfokal görüntü dosyasını içe aktarın. Alternatif olarak, Dosya> İçe Aktar komutunu kullanın.
- Bir görüntü analizi protokolü oluşturmak için ölçümler sekmesine gidin. Protokol sürükleyip protokol penceresinde aşağıdaki gibi doğru sırayla uygun komutları bırakarak inşa edilmiştir.
- Obj bulECTS yeşil kanal: find protokol penceresine ('Bulma' bulundu) komutu nesneleri sürükleyin ('Processing' bulunan) bir açık komutu protocol.Add bulmak nesneleri doğru kanal, daha sonra ayrı bir dokunaklı nesneleri seçmek Komut ('Processing' bulundu - Bu hücreleri ayıracak). Boyutu <50 um Nesneleri Hariç Tut ('Filtreleme' bulundu - bu küçük hücresel olmayan nesneleri hariç tutar).
Not: find eşiği, açık yineleme sayısını nesneleri değişkenler gibi, nesnelerin büyüklüğü ayrılacak ve nesne maskeleri görüntüyü eşleştirmek kadar dışlamak için nesnelerin büyüklüğü elle optimize edilmelidir. - Kırmızı kanal nesneleri bulun: Kırmızı kanal için yukarıdaki gibi nesneleri bulmak Tekrar. Yeşil ve kırmızı protokoller ayrı ayrı ayarlanması gerekebilir.
Not: çekirdekler G2 olmak nedeniyle, yeşil çekirdekler genellikle biraz daha büyüktür. - Bulunan nesneleri doğru onaylayın: Kırmızı onaylayın ve yeşil nesneleri maçkapatarak ve protokol tarafından bulundu kırmızı ve yeşil maskeleri görüntülerken (hide veya göstermek kanal komutunu kullanarak) yeşil ve kırmızı kanallarda görüntüde kırmızı ve yeşil çekirdekler. Görüşleri seçenekleri (Ölçümler> Geri Bildirim seçenekleri) nesne maskelerine görünümünü değiştirmek için kullanılabilir.
- Sarı nesneleri (erken S fazı hücreleri) bul: sarı hücreleri bulmak ('birleştiren' bulundu) komutu yeşil hücreler kırmızı bir Bilgisayar'ı ekleyin. Herhangi bir küçük olmayan hücreli nesneler dışlamak için ('Filtreleme' bulundu <50 mikron) boyutuna göre nesneleri hariç.
- (G1 faz hücreleri) münhasıran kırmızı nesneleri bulun: ('birleştiren' bulunan) kırmızı hücrelerin sarı hücreler, sadece kırmızı çekirdekleri bulmak çıkartmak için. Oluşturulan küçük hücresel olmayan nesneleri kaldırmak için ('Filtreleme' bulundu) boyutu <50 um, nesneleri hariç tut.
- Münhasıran yeşil nesneleri (S / G2 / M faz hücreleri) bulun: sadece yeşil bulmak yeşil kanal için tekrarlayın.
Hayırte: hala kalan hücresel olmayan nesneler varsa, bir filtre nüfus komutu sadece korumak için ('Filtreleme' bulundu) Özel yeşil veya özel kırmızı protokollere eklenebilir 0.25 daha büyük bir şekil faktörü ile nesneleri. Bu dairesel olmayan nesneleri kaldırır. - Sfero anahat bul: Bir bulmak kullanarak sfero anahat bulun (sfero kenarında daha hücreleri vardır hangisi) yeşil veya kırmızı kanalı ('Bulma' bulundu) komutu nesneleri. Bir çok alt eşik (find bulunan değişkenleri nesneleri) bireysel hücrelere kıyasla sfero anahat bulmak için kullanılan gerekecektir.
- Daha sonra nesneleri gürültü çıkarmak ('Filtreleme' bulunan) ince bir filtre kullanmak, daha sonra ('Processing' bulundu) nesneler delikleri doldurmak ('Processing' bulundu) nesneler katılmak için close komutunu kullanın. Son olarak, küçük nesneleri (sfero boyutuna bağlı olarak) <30,000 um kaldırmak için boyutuna göre nesneleri dahil değildir.
Not: Bu protokol sfero anahat doğru dek elle optimize edilmesi gerekecektir. Kullanılacak gerekecektir ancak bu genellikle daha az hassas bir sfero bölüm ve ('birleştiren' bulunan) bir ters komutu ile bir - bir aydınlık görüntü de kullanılabilir.
- Daha sonra nesneleri gürültü çıkarmak ('Filtreleme' bulunan) ince bir filtre kullanmak, daha sonra ('Processing' bulundu) nesneler delikleri doldurmak ('Processing' bulundu) nesneler katılmak için close komutunu kullanın. Son olarak, küçük nesneleri (sfero boyutuna bağlı olarak) <30,000 um kaldırmak için boyutuna göre nesneleri dahil değildir.
- Dan olması gereken asgari mesafeler görselleştirmek outline.To sfero kenarına hücre sentroidinden, sarı münhasıran yeşil ve münhasıran kırmızı toplumlarından ('İlişkin' bulundu) Tedbir mesafeleri: sfero anahat çekirdeklerin mesafeleri ölçmek En yakın sfero kenarına hücre, geribildirim seçenekleri (Ölçümler> Geri Bildirim seçenekleri> İlişkiler) 'de ilişkileri sekmesinde gösteri mesafelerde açın.
- Protokolü kaydedin. Bu protokol Ölçümleri kullanılarak diğer görüntülere yeniden uygulanabilir> protokol komutunu geri yükleyin.
- Bir ölçümler öğe oluşturun (Ölçümler> Ölçüm Item). Veri analizi kullanılarak analiz edilebilirfonksiyonlar.
- Ölçümler kalemindeki analiz sekmesine gidin. Analiz menüsüne gidin (Analiz> Analiz) ve sfero kenarına (yeşil veya sarı kırmızı) hücre sentroidinden, sayı ile özetlenmiş ve nüfus tarafından düzenlenen minimum mesafeyi analiz.
- Kenarından belirli bir mesafede bulunan hücrelerin sayısını saymak için bir filtre (Analiz> Filtre) oluşturmak. Şekil 2'de asgari mesafe için filtre (örn asgari mesafe 80 "dış" nüfus verir az olduğu) Hoechst penetrasyon dayanmaktadır. Alternatif olarak, daha fazla analiz için bir elektronik tabloya ihracat ham veri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tümör parçacıklarının üretilmesi için çeşitli yöntemler bu protokol hücreleri agar veya agaroz 3,7,9 kültürlenir yapışmayan bir büyüme yöntemi kullanır vardır. 1 agar üzerinde 3 gün sonra, bir C8161 melanoma sfero bir örneğini göstermektedir. C8161 sferoidler 500 çaplı normal büyüklükte sferoidler oluştururlar - 600 mikron 3 gün sonra (= 565, SD = 19, n = 3 ortalama). Sferoidler oluşturacak diğer melanoma hücre hatları şunlardır: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205Lu (bu, bir hücre hattı ile oluşturulan sferoidler, düzensiz ve 19 daha az yoğun).
3D küremsi modeli içinde tek tek hücrelerin hücre döngüsünün görselleştirmek için, C8161 melanoma hücreleri Fucci sistemi 7,15 ile transdüse edilmiştir. Nedeniyle sferoidlerin büyük bir boyuta (kadar agaroz üzerinde 3 gün sonra, çapı 1 mm ile C8161 için kollagen 24 saat büyümeye), kesit sfero merkezinde hücreleri görselleştirme için en iyi seçenektir. Bütün(canlı ya da sabit olarak) sferoidler konfokal mikroskobu ile görüntülü olabilir, bununla birlikte konfokal görüntüleme nedenle sfero orta optik bir dilim 300 um'den daha küçük bir çapa sahip sferoidler elde edilebilir, yaklaşık 150 um 'e kadar nüfuz sadece edebilmektedir. Şekil 2A, B ve C, bir C8161 Fucci sfero geçen bir kesitin bir örneğini göstermektedir. Dış tabakaların içinde çoğalan hücrelerin gradyanı ile G1 tutuklandı hücreler tarafından çevrelenmiş bir nekrotik çekirdek, belirgindir. Küremsi ve hücre döngüsü durumu konumlarına göre hücreleri belirlemek ve ölçmek için, yarı-otomatik bir görüntü analiz Şekil 2B, Fucci hücre maske ve sfero hatlarını göstermektedir. Yapıldı ve Şekil 2E kırmızı numaralarının miktarının (G1) göstermektedir ve yeşil veya sarı (S / G2 / M) hücreler ya sfero (dış hücreleri) ya da sferoit kenarının (iç hücreleri) 'den daha büyük, 80 mikron kenarından az 80 um. Bu quantificatibeklendiği gibi G1 kırmızı kan hücrelerinin büyük ölçüde sfero iç bölgesinde zenginleştirilmiş olduğu gösterileri.
Sfero kendi hücre döngüsü durumu ve pozisyonuna göre hücreleri tanımlamak ve potansiyel olarak sıralamak için, Fucci sistemi ile bir arada bir Hoechst boya difüzyon deneyi kullanıldı. Hoechst boya sonuçları ile bütün küremsi kuluçka boya sınırlı bir difüzyon bunların içine sfero dış katmanları, bu olumsuz iç sferoid hücreleri akış sitometrisi ile Hoechst'den Hoechst pozitif dış tabaka hücreleri ayırmak için kullanılabilir. Şekil 2F, yaklaşık 80 um sferoid kenarından kadar Hoechst penetrasyonu gösterir. Hoechst penetrasyon yakın büyük ölçüde daha az bulunan dış katmanlarında çoğalan hücreleri (belirgin şekilde kenarından 80 um Hoechst pozitif mesafesi sferoid bölümler ve boya konsantrasyonu ve inkübasyon süresinin optimizasyonu görsel analizi ile elde edilmiştirkenarından 80 um) az, ve G1 nüfuz etmediği Hoechst ile area.The inkübasyon süresi derin veya daha sığ nüfuz etmesini sağlamak için değiştirilebilir tutuklandı. Şekil 4C, D Fucci, kırmızı, sarı ve yeşil hücreler için yolluk gösterir ise, Şekil 3'de gösterilen zaman içinde Hoechst nüfuz değişen bir örnektir. Şekil 4A, Hoechst yüksek ve düşük popülasyonlar için yolluk bir örneğini göstermektedir. Şekil 4B gösterir kırmızı (G1) sayısı ve yeşil veya sarı (S / G2 / M) hücreler ya Hoechst yüksek (dış hücrelerde) veya Hoechst düşük (iç hücreler) için miktar. Yine bu teknik, G1, kırmızı hücrelerin büyük ölçüde küremsi iç bölgesinde zenginleştirilmiş olduğu (cf. Benzerlik Şekil 2E'de görüntü analizine) görülmektedir.
Rakam1:. C8161 Sfero Temsilcisi faz kontrastlı görüntü agar üzerinde 3 gün kültürden sonra C8161 sfero 10X büyütmede çekilen. Ölçek çubuğu 100 mikron eşittir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. C8161 Fucci Sferoid Görüntü Analizi Bir C8161 Fucci temsili görüntüsü 20X büyütmede alınmış vibratome bölümü küremsi. Sferoid agaroz üzerinde üç gün, kollajen matris içinde daha sonra 24 saat boyunca kültürlenmiştir. (A) Azami Green, (B) Kusabira ORANGE2 ve (C) Fucci bindirme Konfokal z-dilim. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Gri sfero taslak ile Volocity oluşturulan (D) Kırmızı ve Yeşil nesne maskeleri. ArSatır sfero kenarından 80 mikron mesafeyi gösterir. (E) iç içinde kırmızı (G1) sayıları ve yeşil / sarı (S / G2 / M) hücrelerin Niceleme (steoid kenardan> 80 mikron) ve dış bölgelerinde (sfero kenar itibaren <80 mikron). Hata çubukları 2 bağımsız deneyden 4 sfero bölümlerden SD temsil etmektedir. 1,5 saat inkübe edildikten sonra 10 uM Hoechst boya (F) Penetrasyon. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3:. C8161 Sfero Hoechst Boya Difüzyon Zaman Kursu bütün C8161 ortasında Temsilcisi konfokal z dilimli görüntüleri belirtilen zamanlar için 4 gün boyunca agaroz kültüre ve 10 uM Hoechst ile kuluçkaya küremsilerin. 10X büyütmede alınmıştır. Beyaz çubuklar yaklaşık Hoechst penetrasyon derinliğini göstermektedir. Bu C8161 agaroz sferoidler aynı zaman noktasında nüfuz boya az sonuçlanan Şekil 2'de 24 saat kollajen implante edilmiş C8161 sferoitlerin daha yoğun olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. 10 uM Hoechst ile 20 sferoidlerin inkübasyondan sonra Hoechst yüksek ve düşük gating C8161 Fucci Sferoid Akış Analizi (A) Örnek. Mavi çizgi lekesiz kontrolü, yeşil hat tamamen lekeli Hoechst kontrolünü olduğunu gösterir. İç (Hoechst düşük) ve dış (Hoechst yüksek) p olan kırmızı ve sarı / yeşil hücrelerin sayısı (B) Nicelemeopulations. Hata çubukları (canlı sıralama ve sabit hücre analizi de dahil olmak) 8 bağımsız deneyden SD temsil etmektedir. İç (C) için yolluk Fucci ve dış (D) sfero popülasyonlarının örneği. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yarı otomatik bir görüntü analiz sferoid iç G1 tutuklandı bölgeyi tanımladık ve dış tabakalar çoğalan. Bu yöntem, bir optik bölümünde kullanılarak canlı küremsiler de kullanılabilir, ya da sabit küremsi bölümlerde, bu farklı bölgelerde hücre döngüsü, ancak (immünofloresan ile) belirteç ekspresyonu, hücre ölümü veya hücre morfolojisi, sadece değişiklikleri tespit etmek. Farklı sfero bölgeler içinde hücre motilitesi de sayısal olabilir - hücre izleme görüntü analizi aşaması ile birlikte canlı konfokal zaman atlamalı görüntüleme eklenirse. Görüntü analizi Kritik, yüksek kaliteli z dilim konfokal görüntüleri yüksek çözünürlüklü görüntüler hücrelerin daha iyi tanınmasını sağlayacak, elde edilmesidir. Görüntü analizi ile bir sınırlama çekirdeklerinin çok yoğun eğer doğru her hücreyi bulmak mümkün olmadığı, ya da kırmızı ve yeşil yoğunluğu çok fazla varyasyon varsa. (Erken G1) Fucci negatif hücreler, bu görüntü analizi yöntemi, sadece kırmızı (G1) ile bulunabilir mümkün değildirSarı (erken S fazı) ve yeşil (S / G2 / M). Burada anlatılan görüntü tabanlı analiz yönteminin bir diğer dezavantajı dikkate sferoidlerinin tamamen 3D doğasını almaz olmasıdır. Volocity yazılımı z yığın görüntüleri kullanarak 3D ölçümleri gerçekleştirmek rağmen, konfokal mikroskopi sayesinde büyüklüğü için tüm sfero nüfuz edemiyor ve görüntüdür. Bazı sferoidler bu yöntemle ile görüntü tüm sferoidler için çok büyük olabilir, ancak çoklu foton görüntüleme, bu teknoloji kadar um 500 girmesini sağlamaktadır 3D ölçümler 7 için bütün sfero z-yığını elde etmek için kullanılabilir. Bütün sfero görüntüleme için bir başka seçenek farklı açılardan sfero görselleştirme sağlar ve büyük sferoitler 20,21 içinde 200 mikron kadar nüfuz ışık sayfalık tabanlı mikroskop vardır. Görüntüleme strateji seçimi sferoid boyutu, hücre paketleme yoğunluğu ve hücre tipi tarafından etkilenebilir.
Hoechst boya diffusioAkış sitometrisi aracılığı ile çok-sfero iç ve dış hücre ayrılması için n yöntemi ilk 1982 22 içinde tarif edilmiştir. Bu yöntem, dış hücreler önce lekelenmeye karşı olan Hoechst boya sfero yavaş yavaş nüfuz gerçeğine dayanır. Burada açıklanan protokol G1 tutuklandı hücrelerin iç halka ile ilgili iç ve dış küremsi hücrelerinin ayrılmasını değil, aynı zamanda Hoechst penetrasyon görselleştirme sadece sağlar Fucci sistemi 15 ile Hoechst metodu içerir. Bu sfero G1 tutuklanan bölgenin doğru ayrılmasını verir. Dış çoğalan hücreler de G1 hücreleri içeren verilen bir sfero, iç G1 tutuklanan hücrelerin ayrılması, izin vermez yalnız Fucci kullanma. Bir sınırlama bu yöntem sadece iki bölgede ("dış" Hoechst pozitif ve "içsel" Hoechst negatif) içerisine sfero ham ayrılmasını olanak sağlamasıdır. Görüntü analizi üzerine bu yöntemin yararı, bu fDüşük sitometrisi birden belirteçler seferde test edilmesine imkan verir, ve bu tür gen veya protein ekspresyonu, farklı çevresel koşullar, ilaç tedavileri ya da diğer analizler yeniden kültür olarak, daha aşağıda analiz için canlı hücre fiziksel olarak ayrılması.
Akış sitometrisi ve resim analizi ile kombinasyon halinde Fucci küremsi sistemi nekrotik çekirdeği çevreleyen G1 tutuklandı hücrelerin bir iç halka tanımlanmasını ve çoğalan hücrelerin bir dış katmanı sağlar. Sfero merkezinde bulunan nekroz ve G1 tutuklama oksijen ve besin eksikliği nedeniyle ve sfero boyutu büyüdükçe gelişir. Daha önce, ve diğerleri G1 tutuklandı küremsi merkezi 7,23 ile pimonidazol hipoksi işaretleyici ko-lokalizasyonunu göstermiştir. Biz de bu çoğalma büyük ölçüde yaklaşık 100 mikron sfero kenarından içinde ortaya çıkar göstermektedir. Bu sferoidler 12,23,24 önceki çalışmaları maçları, hem de d ile ilişkilidirvivo 25,26 en yakın damar çoğalan hücrelerin istance.
Akış sitometrisi ya da diğer analizler için sfero konumlan göre hücreleri ayırmak için kullanılabilir Alternatif bir yöntem, sıralı tripsinizasyon 24,27 olup. Bu yöntemde, sfero ardışık "kabuklar" düşük sıcaklıklarda tripsin ile kısa sıralı inkübasyon süreleri ile uzaklaştırılır. Bununla birlikte, bu yöntem kullanılarak bu Hoechst penetrasyon şirketinden görüntülendi ve ölçülebilir Hoechst boya difüzyon yöntemi ile karşılaştırıldığında kaldırılır (um kalınlığında), dış kabuğun tam boyutunu tespit etmek daha da zordur.
Boya yayımında ve / veya görüntü analizi ile "iç" ve "dış" hücreleri ayırmak farelerde Fucci tümör ksenograftlarının çalışmalara uzatılabilir. Bununla birlikte, in vivo koşullarında, hücre döngüsü analizi için, damar varlığı da ta olmalıdırdikkate ken, bir tümör hücreleri orta bölgelerinde damar oksijen ve besin erişmek mümkün olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
- Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
- Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
- Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
- Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
- Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
- Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
- Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
- Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
- Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).
