Introduction
Многоклеточные 3D сфероидов были известны как модели опухоли на протяжении десятилетий, однако это только недавно, что они пришли в более общем использовании в качестве модели в пробирке для многих солидных раков. Они все чаще используются в высокой пропускной экранов обнаружения наркотиков в качестве промежуточного между сложный, дорогостоящий и трудоемкий в моделях естественных условиях и простой, низкая стоимость 2D модели монослоя 1-6. Исследования, проведенные в 2D культуре часто не в состоянии быть воспроизведены в естественных условиях. Сфероид модели многих видов рака способны имитировать характеристики роста, лекарственной чувствительности, проникновение наркотиков, межклеточных взаимодействий, ограниченное наличие кислорода и питательных веществ и развития некроза, что видели в естественных условиях в твердых опухолях 6-11. Сфероидов разработать некротический стержень, покоя или G1 арестованного область, окружающую сердцевину, и пролиферирующих клеток на периферии сфероида 7. Развитие этих регионахможет изменяться в зависимости от плотности клеток, пролиферации и скоростью размера сфероида 12. Она была выдвинута гипотеза, что сотовый неоднородность видел в этих различных субрегионов может способствовать рака сопротивления терапии 13,14. Поэтому умение анализировать клетки в этих регионах отдельно важно ответов наркотиков опухолевых понимание.
Система показатель клеточного цикла флуоресценции убиквитинирования (Fucci) основан на красный (Kusabira Orange - нокаутом) и зеленый (Green Адзами - А.Г.) флуоресцентного мечения Cdt1 и geminin, которые деградировали в разных фазах клеточного цикла 15. Таким образом, клеточные ядра появляются красные в G1, желтый в начале S и зеленый в S / G2 / M фазе. Здесь мы опишем два дополнительных методов и с помощью Fucci определить клеточный цикл, вместе с использованием обработки изображений или диффузионного потока красителя цитометрии для определения, находятся ли клетки в G1 задержаны центра или внешней proliferatinг кольцо, а расстояние отдельных клеток от края сфероида. Эти методы были разработаны в нашей предыдущей публикации, где мы показали, что клетки меланомы в гипоксических регионов в центре сфероида и / или в присутствии целенаправленной терапии могут оставаться в G1 сердца в течение длительных периодов времени, и может повторно введите клеточного цикла, когда более благоприятные условия возникают 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fucci Трансдукция и клеточной культуры
- Fucci трансдукции
- Создать клеточные линии, стабильно экспрессирующие Fucci строит mKO2-hCdt1 (30-120) и MAG-hGem (1-100) 15, используя лентивирус сотрудничество трансдукции, как описано ранее 7.
Примечание: Система Fucci теперь коммерчески доступны. - Создание суб-клонов с яркой флуоресценции по одной сортировки клеток. Порядок отдельные клетки положительные как для AG и Ко (желтый) с помощью флуоресцентной сортировки клеток с возбуждением в 96-луночный планшет, как описано выше 7,16.
- Создать клеточные линии, стабильно экспрессирующие Fucci строит mKO2-hCdt1 (30-120) и MAG-hGem (1-100) 15, используя лентивирус сотрудничество трансдукции, как описано ранее 7.
- Меланома культуры клеток
- Культура C8161 человека клетки меланомы, как описано выше 7,17.
2. 3D Сфероид Формирование (как описано ранее 3,9)
- Агарозном подготовка плиты
- Растворить 1,5% агарозном (или благородный агар) в 100 мл раствора Хенкса сбалансированном солевом (HBSS) или фосфат buffereд физиологический раствор (PBS), путем кипячения в микроволновой печи в течение 3-5 мин с закрученной. Убедитесь, что в агарозном полностью растворяется.
- Сразу внесите 100 мкл раствора агарозы в хорошо с плоским дном 96-луночного планшета для культуры ткани с помощью пипетки многоканальный.
Примечание: в агарозном может затвердеть в кончиках после короткого периода времени, чтобы преодолеть эту проблему советы должны быть изменены, если между пластинами делает более одного агарозном пластины. - Оставьте 96-луночного планшета на плоской поверхности для упрочнения агарозы, по крайней мере 1 часа.
- Подготовка клеток и наложения на агарозы
- Рост клеток до приблизительно 80% слияния в колбе Т75. Промыть 10 мл HBSS.
- Отделить клетки с помощью 1,5 мл 0,05% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и ресуспендируют в 10 мл среды нормальной.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра 18 или другой метод автоматизированного подсчета.
- Ресуспендируют клеток до конечной концентрации 25000 клеток / мл в нормеаль среднего.
- Перекрытие агарозном скважин с 200 мкл клеточной суспензии для окончательного числа 5000 клеток на лунку.
- Возврат пластины к клеточной культуры инкубатор (5% CO 2 и 37 с), чтобы сформировать более сфероидов примерно 3 дня.
Примечание: Время, необходимое для формирования сфероида варьируется от различных клеточных линий. Некоторые клеточные линии, не образуют сфероидов, используя этот метод вообще. - Изображение сфероид морфология с помощью инвертированного микроскопа, используя цель 4X и фазового контраста фильтра. Клеточная линия, которая успешно формирует сферические будет производить компактные, примерно сферические агрегаты клеток, и там должно быть только одно сфероид на лунку.
Примечание: Дополнительно: После того, как сфероиды сформированы, они могут быть пересажены в другой коллагена или матрицы для дальнейшего анализа роста и вторжения 3,7,17. Чтобы удалить сфероидов из коллагена, лечения с 500 мкл 2 мг / мл коллагеназы при 37 ° С до тех пор, коллаген не растворится достаточно для СФЕРOIDs прийти бесплатно в средствах массовой информации (примерно 30 мин). Аккуратно снимите сфероидов, используя 1 мл пипетки. - Для секционирования / визуализации исправить сфероиды (либо выделенные из коллагена или выращенные в течение 3-5 дней на агарозном) в 10% нейтральном забуференном формалине (ВНИМАНИЕ: Формалин должны быть использованы в вытяжном шкафу) в течение не менее 2 ч при комнатной температуре (RT) , или на ночь (O / N) при 4 ° С. Сфероиды могут быть сохранены в HBSS при 4 ° С в течение нескольких дней.
3. Сфероид Vibratome Секционирование
- Растворяют 5 г низкой температурой плавления агарозы в 100 мл HBSS в стеклянной бутылке 500 мл в микроволновой печи. Используйте параметр среднем огне с закрученной. ВНИМАНИЕ: Храните крышку свободно при кипячении раствора, так что давление может быть освобожден. Используйте защитные перчатки жаростойкие, чтобы защитить руки от ожогов при контакте с горячим бутылку стекла.
- Подождите, пока не остынет агарозном немного - так бутылка может быть коснулся без сжигания руки.
- Налейте приближенииДЕТАЛЬ 2 мл агарозы в нижней части счетчика частиц чашки или аналогичной пластиковые формы. Сразу аспирации фиксированную сфероид (смотри раздел 2.2.8) с использованием 1 мл пипетки в наименьший объем жидкости возможно. Добавить сфероид агарозы. Несколько сфероидов (до 10) могут быть добавлены в чашку.
- Обложка сфероидов с 2 мл более агарозы. Для этого быстро, чтобы избежать агарозы упрочнение, прежде чем второй слой будет добавлен.
- Разрешить агарозном затвердевать при комнатной температуре в темноте в течение не менее 3 ч. В этот момент чашки могут храниться в течение короткого времени при 4 ° С с 2-3 мл HBSS наложены, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Удалить агарозы из чашки. Обрезка агарозы, содержащий сфероиды, так что он подходит на vibratome металлического блока и сфероиды близко к верхней агарозы. Сфероидов можно увидеть в виде небольших белых объектов внутри агарозы. Супер клей агарозы к блоку.
- Заполните vibratome с дистиллированной водой и установите блок в vibratome. Установитьvibratome сократить 100 мкм разделы, используя низкую скорость (настройка 2) и высокой вибрации (установка 8). Установите угол резания лезвия 16 °. Включите vibratome, включите в vibratome света и не сократить разделы из верхней агарозы до 100 мкм сферические участки вырезают. Поместите сократить сфероидами секций в HBSS в 24-луночного планшета.
- Выберите разделы для среднего анализа изображений. Mount разделы на слайдах по передаче раздел квартиру на слайде с помощью пинцета. Заполните шприца 10 мл вакуумной смазки; добавить тонкую линию вакуумной смазки по краям секции для того, чтобы предотвратить монтажную СМИ от бежать края слайда и помочь запечатать раздел под покровное. Обложка раздел с монтажной среды и покровное. Печать края покровного стекла с лаком для ногтей. Магазин скользит при 4 ° С перед визуализации.
4. конфокальной Image Acquisition
- Возьмите г-ломтик файл сфероида разделе средний Fucci используя 10Xили 20X цель, как описано ранее 7. Убедитесь, что нет перекрытия или перекрестных помех не возникает между Kusabira Orange2 и Адзами Грин. Если сравнении анализ изображения между несколькими разделами сфероидных, держать мощность лазера и другие параметры того же между образцами.
5. Hoechst краситель диффузия Анализ на Flow Сортировка
- Передача живые сфероидов (3-5 дней после посева) агарозном к 15 мл пробирку. Пусть сфероиды тяжести оседают на дно пробирки. Несколько сфероиды могут быть окрашены в трубке. Примерно 20 сфероидов, необходимых для получения достаточного количества клеток для проточной цитометрии.
- Удалите излишки среду и добавить 1 мл 10 мкМ Hoechst разводненной в нормальном среды. Инкубируйте сфероидов при 37 ° С в течение приблизительно 1 ч. Используйте нежный стряхивая ресуспендировать сфероидов один или два раза во время инкубации.
Примечание: Время инкубации может изменяться для изменения, как далеко краситель Hoechst проникает в сфероидов. Это зависит отразмер сфероид, плотность и клеточная линия. Для некоторых крупных плотных сфероидов / может быть максимальное проникновение краситель, который составляет менее 100%. - Вымойте сфероидов осторожно 5 мл HBSS с использованием гравитационного осаждения.
- Дополнительно: Для визуализации проникновения красителя: Фикс сфероидов с 10% нейтральном забуференном формалине в течение не менее 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Подготовка vibratome разделы, смонтировать на слайдах и изображения на конфокальной, как описано в шагах 3 и 4 выше.
- Чтобы подготовить клеток для проточной цитометрии, Trypsinize сфероидов 1 мл 0,05% трипсина / EDTA при 37 ° С в течение приблизительно 30 мин с щелкая каждые 10 мин, чтобы разорвать сфероидов друг от друга.
Примечание: сфероиды трудно получить в суспензии отдельных клеток, условия могут должны быть оптимизированы. Жизнеспособность C8161 4-дневных сфероидов после этого процесса составляет примерно 95%. - Пятно клетки с ближней инфракрасной живой / мертвый пятно в соответствии с протоколом производителя. Промыть ССРХ затем исправить с 1мл 10% нейтральный буферный формалин примерно 30 мин. Клетки могут быть сохранены в HBSS при 4 ° С в течение нескольких дней до анализа потока.
6. проточной цитометрии Анализ Hoechst Витражи Fucci сфероидов
- Обеспечить клетки не слипаются вместе, передавая их через ячейки сетчатого фильтра. Ресуспендируют Hoechst окрашенных Fucci сфероидов в ледяной FACS (PBS стирки с 5% фетальной телячьей сыворотки) в концентрации 1-5 × 10 6 клеток / мл. Передача 200 мкл образца по 5 мл с круглым дном трубки.
- Подготовьте следующие отдельные контрольные образцы цвета, как описано в 6.1: Во-окрашенных клеток меланомы; прилипшие клетки меланомы окрашивали 10 мкМ Hoechst в течение 1 ч; Азами Зеленый только выразить клетки меланомы; и Kusabira Оранжевый только выразить клеток меланомы.
Примечание: Одиночные управления цветом может быть фиксировали в формалине и хранится в FACS промывают 0,1% азида натрия при 4 ° С в течение нескольких недель или даже месяцев. - Запуск суспензии клеток вывода одиночныена проточной цитометрии анализатора с соответствующими лазеров и одного цвета / неокрашенных управления, как описано выше 7,16.
- Используйте коммерческое программное обеспечение цитометрии например FlowJo анализировать внутренний против внешнего сфероида клетки следующим образом:
- Удалите мусор с помощью стробирования на главной клеточной популяции в прямом рассеянного света (FSC) против бокового светорассеяния (SSC).
- Удалить дублеты по стробирования на отдельных клеток с использованием FSC (область) против FSC (высота)
- Ворота для живых клеток по стробирования на живой / мертвый низкой населения.
- Определить Hoechst высокие клетки, закрытый на основе положительного сигнала от прилипшие клетки окрашивали Hoechst, как «внешних» клеток.
- Определить Hoechst низкие или отрицательные клетки, закрытый на основе сигнала от контроля не-окрашенных, так как "внутренних" клеток.
- После стробирования для внутренних и наружных популяций, клетки могут быть дополнительно закрытого для Fucci красный (G1), желтого (в начале S), зеленого (S / G2 / M) или отрицательный (ранней G1).
Примечание: Compensation используя отдельные элементы управления цветовой может потребоваться, чтобы должным образом определить Fucci красные, желтые, зеленые и отрицательные населения.
- После того, как анализ был оптимизирован и проникновение Hoechst подтверждено с помощью конфокальной микроскопии, запустите клетки без фиксации на мобильный поток сортировщика, как описано ранее 7,16 для дальнейшего анализа живых клеток субпопуляций.
Анализ 7. Изображение Fucci сфероида разделах
- Открытое программное обеспечение, например,. Volocity, выбрать только конфигурацию количественного определения.
- Создать новую библиотеку. Импорт Fucci сфероид файл конфокальной изображения в программное обеспечение с помощью перетаскивания файла исходных данных из конфокальной в библиотеку. В качестве альтернативы, используйте команду Файл> Импорт.
- Перейдите на вкладку измерений построить протокол анализа изображений. Протокол построен с помощью перетаскивания соответствующие команды в правильном порядке, следует в окне протокола.
- Найти OBJECTS в зеленом канале: Перетащите команду Найти (находится в "нахождения") в окне протокола объекты, выберите правильный канал в объектах Найти protocol.Add открытый команду (находится в 'обработки'), то отдельные трогательные объекты Команда (находится в '' обработки - это отдельные клетки). Исключение объектов по размеру <50 мкм (находится в '' Фильтрация - это исключит малые непористые объектов).
Примечание: переменные, такие как поиск объектов порог, количество открытых итераций, размер объектов, чтобы отделить и размер объектов, чтобы исключить необходимо вручную оптимизированы, пока объект не маски соответствовать изображению. - Найти объекты в красном канале: Повтор найти объекты, как описано выше для красного канала. Зеленые и красные протоколы, возможно, потребуется отрегулировать отдельно.
Примечание: Из-за ядра находятся в G2, зеленые ядра часто немного больше. - Подтвердите предметы, найденные точны: Подтвердите красные и зеленые объекты соответствоватькрасные и зеленые ядра в изображении путем выключения и на зеленых и красных каналов (с помощью скрыть или показать командную канал) во время отображения красный и зеленый маски, найденные в протоколе. Обратная связь варианты (Измерения> Обратная связь опции) может быть использована для изменения внешнего вида масок объектов.
- Найти желтые предметы (ранняя фаза S клетки): Чтобы найти желтые клетки, добавить красный пересекаются с зелеными клетками команду (найден в "Объединение"). Исключение объектов по размеру (<50 мкм, найденные в «Фильтрация»), чтобы исключить какие-либо небольшие непористые объектов.
- Найти исключительно красные объекты (G1 фазе клетки): Чтобы найти исключительно красные ядра, вычесть желтые клетки от эритроцитов (находится в 'Объединение'). Исключение объектов по размеру <50 мкм, (находится в 'фильтрации'), чтобы удалить любые небольшие непористые объекты, созданные.
- Найти исключительно зеленые объекты (фаза клетки S / G2 / M): Повторить для зеленого канала, чтобы найти исключительно зеленый.
НетTe: Если есть еще не-клеточные объекты Остальные, команда население фильтра могут быть добавлены к исключительной зелеными или красными эксклюзивные протоколов (находится в "Filtering") только сохранить объекты с коэффициентом формы более 0,25. Это позволит удалить некруглое объектов. - Найти сфероида контур: Найти сфероида контур, используя команду Найти (находится в "нахождения") с зеленой или красной (в зависимости от канала имеет больше клеток по краю эллипсоида) объектов. Гораздо ниже порога (находится в находке объекты переменные) должны быть использованы, чтобы найти сфероида план по сравнению с отдельными клетками.
- Используйте команду на объекты, чтобы присоединиться (находится в 'обработки'), а затем заполнить дыры в объектах (находится в 'обработки'), а затем использовать фильтр тонкой очистки (находится в 'фильтрации "), чтобы удалить шум от объектов. Наконец, исключить объекты по размеру, чтобы удалить мелкие объекты <30000 мкм (в зависимости от размера сфероидов).
Заметка: Этот протокол необходимо будет оптимизирован вручную до сфероид контур является точной. Светлое изображение также может быть использован - однако, это, как правило, менее точны с сфероида секции, и команды инвертный (находится в 'Объединение') должны быть использованы.
- Используйте команду на объекты, чтобы присоединиться (находится в 'обработки'), а затем заполнить дыры в объектах (находится в 'обработки'), а затем использовать фильтр тонкой очистки (находится в 'фильтрации "), чтобы удалить шум от объектов. Наконец, исключить объекты по размеру, чтобы удалить мелкие объекты <30000 мкм (в зависимости от размера сфероидов).
- Измерение расстояний ядер в сфероида чертах: Измерение расстояний (находится в 'Относительно') из желтых, зеленых и исключительно исключительно красными населения из клеточной центра тяжести до края сфероида outline.To визуализации минимальные расстояния, которые должны быть из клеток до ближайшего края сфероида, включите шоу расстояний на вкладке отношений в настройках обратной связи (измерения> Обратная связь> Отношения вариантов).
- Сохранить протокол. Этот протокол может быть вновь применен к другим изображениям с использованием измерений> Восстановить команду протокола.
- Создать измерений пункт (Измерения> Сделать измерения пункт). Данные могут быть проанализированы с помощью анализафункции.
- Перейдите на вкладку анализа в измерениях пункта. Перейти к меню Analysis (Анализ> Анализ) и анализировать минимальное расстояние от центра тяжести ячейки (красный, зеленый или желтый), чтобы сфероида края, кратко и по количеству населения, организованной.
- Чтобы подсчитать количество клеток, обнаруженных на некотором расстоянии от края создать фильтр (анализ> Фильтр). Фильтр для минимального расстояния на рисунке 2 основан на проникновении Hoechst (например, минимальное расстояние составляет менее 80 дает «внешний» население). Кроме того, экспорт необработанных данных в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Есть несколько способов получения сфероидов опухоли, этот протокол использует неадгезированных метод роста, когда клетки культивируют на агаре или агарозном 3,7,9. На рисунке 1 показан пример C8161 меланомы сфероида после 3 дней на агар. C8161 сфероидов формировать регулярные размера сфероидов с диаметром 500 - 600 мкм (средний = 565, SD = 19, N = 3) через 3 дня. Другие клеточные линии меланомы, которые образуют сфероидов включают в себя: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (сферические, образованные с этой клеточной линии нерегулярны и менее плотной 19).
Для того, чтобы визуализировать клеточный цикл отдельных клеток в 3D-модели сфероида, C8161 клетки меланомы трансдуцировали системы Fucci 7,15. Из-за большого размера сфероидов (до 1 мм в диаметре после 3 дней на агарозы и 24 ч роста в коллагена для C8161), секционирование является наилучшим вариантом для визуализации клеток в центре сфероида. Всесфероидов (живые или фиксированные) может быть отображена с помощью конфокальной микроскопии, однако конфокальный изображений только способны проникать до приблизительно 150 мкм, поэтому средний оптический срез сфероида могут быть получены только в сфероидов с диаметром, меньшим, чем 300 мкм. 2А, В и С показан пример разрез сфероида C8161 Fucci. Некротический стержень, окруженный G1 задержаны клеток, с градиентом пролиферирующих клеток в наружных слоях очевидна. Для выявления и количественной оценки элементов на основе их положения в сфероида и клеточного цикла статуса, полу-автоматизированный анализ изображений проводили. Рис 2D показывает Fucci клеточные маски и сфероид план, а на рис 2Е показывает количественное определение числа красный (G1) и зеленый или желтый (S / G2 / M) клетки либо менее 80 мкм от края сфероида (наружные клетки) или больше, чем 80 мкм от кромки сфероида (внутренние клетки). Это quantificatiна показывает, что эритроциты в G1 значительно обогащенных во внутренней области сфероида, как и ожидалось.
Для того чтобы идентифицировать и потенциально сортировки клеток на основе их положения клеточного цикла и положение в сфероида, был использован Hoechst диффузии красителя анализа в комбинации с системой Fucci. Инкубации весь сфероидов с результатами Hoechst красителя в ограниченном диффузии красителя в наружные слои сфероида, это может быть использован для разделения Hoechst положительные внешние клетки слоя от Hoechst отрицательные внутренние сферические клетки с помощью проточной цитометрии. рис 2F показывает проникновение Hoechst до примерно 80 мкм от кромки сфероида. Положительности расстояния Hoechst 80 мкм от края был получен посредством визуального анализа сфероида секций и оптимизации концентрации красителя и инкубации времени, так что проникновение Hoechst тесно отмечены пролиферирующих клеток в наружных слоях (которые расположены в основном меньшечем 80 мкм от кромки), и не проникают в G1 задержаны area.The время инкубации с Hoechst может варьироваться, чтобы получить более глубокое проникновение или меньшую. Пример различной проникновение Hoechst с течением времени в показано на рисунке 3. 4А показан пример стробирования для Hoechst высоких и низких популяций, а фиг.4С и D демонстрирует стробирования для Fucci красного, желтого и зеленого клеток. 4В показывает Количественное для числа красный (G1) и зеленый или желтый (S / G2 / M) клеток либо в высоких (внешних клеток) Hoechst или Hoechst низким (внутренних клеток). Снова эта методика показывает, что эритроциты в G1 значительно обогащен внутренней области сфероида (ср. Сходство с помощью анализа изображения на рис 2Е).
Фигура1:. C8161 Сфероид представитель фазового контраста изображения принято на 10-кратным увеличением в C8161 сфероида после 3 дней культуры на агар. Масштабная линейка равна 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2:. C8161 Fucci Сфероид Анализ изображения представитель изображение C8161 Fucci сфероида vibratome раздел принятое на 20-кратным увеличением. Сфероид культивировали в течение трех дней на агарозном, то еще 24 ч в коллагеновой матрице. Конфокальной г-ломтик (A) Адзами Грин, (B) Kusabira Orange2 и (C) Fucci наложения. Масштаб бар = 100 мкм. (D) красный и зеленый объект маски, созданные в Volocity, с сфероида чертах в серый. Арканзасрядок показывает 80 мкм расстояние от сфероида края. (Е) Количественная оценка числа красный (G1) и зеленый / желтый (S / G2 / M) клеток в внутренний (> 80 мкм от края сфероида) и внешний (<80 мкм от края сфероид) областях. Усы представляют SD от 4 сфероида секций от 2 независимых экспериментов. (F) Проникновение 10 мкМ Hoechst красителя после инкубации 1,5 ч. Масштаб бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. C8161 Сфероид Hoechst краситель время диффузии курс Представитель конфокальной Z-срезов изображения из середины всей C8161 сфероидов культивировали на агарозе в течение 4 дней и инкубировали с 10 мкМ Hoechst течение указанных промежутков времени, Взятые на 10-кратным увеличением. Белые полосы означают приблизительное Hoechst глубину проникновения. Обратите внимание, что C8161 агарозные сфероидов плотнее, чем C8161 сфероидов, которые были имплантированы в коллагена в течение 24 часов на рисунке 2, в результате чего меньше красить проникновение в тот же момент времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4:. C8161 Fucci Сфероид потока Анализ (А) Пример Hoechst высокого и низкого стробирования после инкубации 20 сфероидов с 10 мкМ Hoechst. Синяя линия указывает на то, незапятнанным контроль, зеленая линия показывает полностью окрашенных Hoechst контроль. (Б) Количественная оценка числа красных и зеленый / желтый клеток в пределах внутренней (Hoechst низкой) и внешней (Hoechst высокого) рopulations. Столбики ошибок обозначают SD от 8 независимых экспериментов (в том числе как живой сортировки и анализа фиксированной клеток). Пример Fucci стробирования для внутреннего (C) и внешних (D) населения сфероидных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Полу-автоматизированный анализ изображений определили сфероида внутренний G1 арестован регион и пролиферирующих внешние слои. Этот метод может быть использован на живых сфероидов с помощью оптического сечение, или в фиксированных участках сфероида, чтобы определить изменения в не только клеточного цикла, но экспрессия маркеров (через иммунофлюоресценции), гибели клеток, или клеточной морфологии в этих различных регионах. Сотовый подвижность в различных регионах сфероидных также может быть количественно - если жить конфокальной промежуток времени визуализации наряду с шагом анализа изображений отслеживания клетка добавил. Важнейшее значение для анализа изображений, что высокое качество Z- ломтик конфокальные изображения получаются более высокие разрешение изображения позволяют лучше идентифицировать клетки. Одно ограничение с анализом изображения, что это не возможно, чтобы правильно найти каждую клетку, если ядра слишком плотная, или, если есть слишком много различия в красной и зеленой интенсивности. Fucci отрицательные клетки (в начале G1) не могут быть найдены с помощью этого метода анализа изображений, только красный (G1),желтый (ранняя фаза S) и зеленый (S / G2 / M). Еще один недостаток метода анализа изображений на основе описанной здесь является то, что он не принимает во внимание полный 3D характер сфероидов. Хотя программное обеспечение может выполнять Volocity 3D измерения с помощью изображений г-стека, конфокальной микроскопии не может проникнуть и изображения по всей сфероида из-за большого размера. Изображений Многофотонная могут быть использованы для получения Z-стек целого сфероида для 3D измерений 7, как эта технология позволяет проникновение до 500 мкм, хотя некоторые сфероиды могут все еще быть слишком большим, чтобы изображения целых сфероидов через этот метод. Еще один вариант для визуализации весь сфероид свет-лист на основе микроскопии, которая позволяет визуализировать сфероида с разных углов и проникает до 200 мкм в крупных сфероидов 20,21. Выбор стратегии формирования изображения может зависеть от размера сфероидов, плотности клеток и упаковочной типа клеток.
Diffusio краситель HoechstМетод п для разделения внутренней и наружной клетки в многоклеточных сфероида с помощью проточной цитометрии был впервые описан в 1982 году 22. Этот метод основан на том факте, что краситель Hoechst медленно диффундирует в сфероида, в котором наружные клетки окрашивали быть первым. Протокол, описанный здесь, сочетает в себе метод Hoechst с системой Fucci 15, что позволяет не только разделение внутреннего и внешнего сфероида клетки, но также визуализацию проникновения Hoechst по отношению к внутреннему кольцу G1 задержаны клеток. Это позволяет точно разделение G1 задержаны области сфероида. Использование Fucci одиночку не позволяют разделение внутренний G1 арестованных клеток от сфероида, учитывая, что внешние пролиферирующие клетки также содержат клетки в G1. Ограничение в том, что этот метод позволяет только сырой разделение сфероида в двух регионах ("внешний" Hoechst положительной и "внутренней" Hoechst негатива). Преимущество этого метода по сравнению анализа изображений, что Fнизкого цитометрии позволяет несколько маркеров для тестирования сразу, а физическое разделение живых клеток для анализа далее вниз по течению, такие как ген или белок, выражение повторной культивирования в различных условиях окружающей среды, лекарственной терапии или другого анализа.
Система сфероид Fucci в комбинации с проточной цитометрии и анализа изображения позволяет идентифицировать внутреннего кольца G1 задержаны клеток, окружающих некротический стержень, и внешний слой пролиферирующих клеток. Некроз и G1 арест находится в центре сфероида из-за отсутствия кислорода и питательных веществ, и развивается как сфероид увеличивается в размере. Ранее мы и другие показали совместную локализацию в pimonidazole гипоксии маркера с G1 арестован сфероида центра 7,23. Мы также показали, что распространение значительной степени происходит в течение примерно 100 мкм от края сфероида. Это соответствует ранее исследования в сфероидов 12,23,24, а также коррелирует с Distance пролиферирующих клеток от ближайшего сосудистой в естественных условиях 25,26.
Альтернативный метод, который может быть использован для разделения элементов на основе их положения в сфероида для проточной цитометрии или другого анализа является последовательным трипсинизации 24,27. В этом методе последовательные "оболочки" сфероида удаляют коротких последовательных периодов инкубации с трипсином при низких температурах. Однако с помощью этого метода это более трудно установить точный размер внешней оболочки (с толщиной мкм), который удаляется по сравнению с методом диффузии красителя Hoechst, где проникновение Hoechst может быть непосредственно визуализировать и измерить.
Разделение "внутренних" и "внешних" клетки от диффузии красителя и / или анализа изображения может быть продлен до исследований Fucci опухолевых ксенотрансплантатов у мышей. Тем не менее, для анализа клеточного цикла в естественных условиях, наличие сосудистой также должны быть таКен учетом, а клетки опухоли могут иметь доступ кислорода и питательных веществ из сосудов в центральных областях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
- Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
- Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
- Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
- Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
- Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
- Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
- Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
- Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
- Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).
