Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Imaging- och flödescytometri-baserad analys av cell Position och cellcykeln i 3D Melanom Sfäroider

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53486
* These authors contributed equally

Introduction

Flercellig 3D sfäroider har varit känd som en tumörmodell i årtionden, men det är först nyligen som de har kommit in i mer allmänt bruk som en förebild för många fasta cancer in vitro. De används alltmer i hög genomströmning läkemedelsforskning skärmar som en intermediär mellan komplexa, dyra och tidsödande in vivo-modeller och enkel, billig 2D monolager modell 1-6. Studier i 2D kultur är ofta inte kan replikeras in vivo. Sfäroid modeller av många typer av cancer kan efterlikna egenskaper tillväxt, läkemedelskänslighet, läkemedelspenetrations, cell-cell interaktioner, begränsad tillgänglighet av syre och näringsämnen och utveckling av nekros som ses in vivo i solida tumörer 6-11. Sfäroider utvecklar en nekrotisk kärna, en vilande eller G1 arrested område som omger kärnan, och prolifererande celler vid periferin av den sfäroid 7. Utvecklingen av dessa regionerkan variera beroende på celldensiteten, proliferationshastighet och storleken på den sfäroid 12. Det har antagits att den cellulära heterogeniteten ses i dessa olika delregionerna kan bidra till cancerterapi motstånd 13,14. Därför förmåga att analysera celler i dessa regioner är separat avgörande att förstå tumörläkemedelssvar.

Fluorescens ubikvitinering cellcykelindikator (Fucci) Systemet bygger på den röda (Kusabira Orange - KO) och grön (Azami Green - AG) fluorescerande märkning av Cdt1 och geminin, som bryts ned i olika faser av cellcykeln 15. Således cellkärnor visas rött i G1, gul i början av S och grön i S / G2 / M-fasen. Vi beskriver här två komplementära metoder både med användning Fucci att identifiera cellcykeln, tillsammans med användning av bildgivande programvara eller en färgdiffusion flödescytometri analys för att bestämma huruvida celler är bosatta i G1 arrested centrum eller det yttre proliferating ring, och avståndet av enskilda celler från kanten av sfäroid. Dessa metoder har utvecklats i vår tidigare offentliggörande, där vi visat att melanomceller i hypoxiska regioner i mitten av sfäroid och / eller i närvaro av riktade behandlingar kan vara kvar i G1 gripande under längre tidsperioder, och kan åter ange cellcykeln när mer gynnsamma förhållanden uppstår 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fucci Transduction och Cell Culture

  1. Fucci transduktion
    1. Skapa cellinjer som stabilt uttrycker Fucci konstruerar mKO2-hCdt1 (30-120) och MAG-hGem (1-100) 15 med användning av lentivirus co-transduktion som tidigare beskrivits 7.
      Obs: Fucci system är nu kommersiellt tillgängliga.
    2. Skapa under kloner med ljusa fluorescens av encelliga sortering. Sortera enstaka celler var positiva för både AG och KO (gul) genom fluorescensaktiverad cellsortering i en 96-brunnar såsom beskrivits tidigare 7,16.
  2. Melanom cellodling
    1. Kultur C8161 humana melanomceller, såsom tidigare beskrivits 7,17.

2. 3D Sfäroid Formation (som tidigare beskrivits 3,9)

  1. Agarosplatta beredning
    1. Lös 1,5% agaros (eller ädelagar) i 100 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) eller fosfat Buffered saltlösning (PBS) genom kokning i mikrovågsugn under 3-5 minuter med virvlande. Se till agarosen är helt upplöst.
    2. Omedelbart dispensera 100 pl av agaroslösningen per brunn till en flatbottnad 96-brunnars vävnadsodlingsplatta med användning av en multikanalpipett.
      Obs: Agaros kan stelna i spetsarna efter en kort tidsperiod, för att övervinna detta problem spetsar måste ändras mellan plattor om att göra mer än en agarosplatta.
    3. Lämna 96-brunnar på en plan yta för att härda agarosen under minst en timme.
  2. Cell förberedelse och overlay på agaros
    1. Odla celler till ungefär 80% konfluens i en T75-flaska. Tvätta med 10 ml HBSS.
    2. Drag av celler med användning av 1,5 ml 0,05% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och återsuspendera i 10 ml normalt medium.
    3. Räkna celler med användning av en hemocytometer 18 eller annan automatiserad räkningsmetod.
    4. Resuspendera celler till en slutlig koncentration på 25.000 celler / ml i normenal-medium.
    5. Overlay agaros brunnar med 200 pl av cellsuspensionen för en slutlig antal 5000 celler per brunn.
    6. Return plåtarna vid cellodlingsinkubator (5% CO2 och 37 C) för att bilda sfäroider över ungefär tre dagar.
      Obs: Den tid det tar för att bilda en sfäroid varierar mellan olika cellinjer. Vissa cellinjer bildar inte sfäroider med den här metoden alls.
    7. Bild sfäroid morfologi med ett inverterat mikroskop med hjälp av en 4X mål och en fas kontrast filter. En cellinje som framgångsrikt bildar sfäroider kommer att producera kompakta, ungefär sfäriska cellaggregat, och det bör finnas bara en sfäroid per brunn.
      Obs: Tillval: När sfäroider har bildats, kan de transplanteras in kollagen eller andra matris för vidare analys av tillväxt och invasion 3,7,17. För att ta bort sfäroider från kollagen, behandla med 500 pl av 2 mg / ml kollagenas vid 37 ° C tills kollagenet löses tillräckligt för spherOID att komma fri i medierna (ca 30 min). Försiktigt bort sfäroider med hjälp av en 1 ml pipett.
    8. För sektione / avbildning fix sfäroider (antingen isolerade från kollagen eller odlas under 3-5 dagar på agaros) i 10% neutral buffrad formalin (FÖRSIKTIGHET: Formalin bör användas i dragskåp) i minst 2 h vid rumstemperatur (RT) , eller över natten (O / N) vid 4 ° C. Sfäroider kan förvaras i HBSS vid 4 ° C under flera dagar.

3. Spheroid Vibratome Sektione

  1. Lös 5 g lågsmältande agaros i 100 ml HBSS i en 500 ml glasflaska i en mikrovågsugn. Använd en medelvärme miljö med virvlande. VARNING: Håll locket löst vid kokning av lösningen så att trycket kan frigöras. Använd skyddshandskar värmebeständiga handskar för att skydda händerna från brännskador vid hantering av heta glasflaska.
  2. Vänta tills agarosen svalnar något - så att flaskan kan röras utan att bränna händerna.
  3. Häll approximabart 2 ml agaros i botten av en Coulter-räknare kopp eller liknande plastform. Omedelbart aspirera en fast sfäroid (se avsnitt 2.2.8) under användning av en 1 ml pipett i den minsta vätskevolym möjliga. Lägg sfäroid till agarosen. Några sfäroider (upp till 10) tillsättas per kopp.
  4. Täck sfäroiderna med 2 ml mer av agaros. Gör detta snabbt för att undvika agarosen härdning innan det andra skiktet tillsätts.
  5. Låt agarosen att hårdna vid RT i mörker under åtminstone 3 timmar. Vid denna punkt koppar kan lagras under en kort tid vid 4 ° C med 2-3 ml HBSS överdrog att förhindra uttorkning.
  6. Ta agaros från koppen. Trimma agarosen innehåller sfäroiderna så att den passar på vibratome metallblocket, och sfäroider är nära toppen av agarosen. Sfäroider kan ses som små vita föremål i agarosen. Superlim agarosen till blocket.
  7. Fyll vibratome med destillerat vatten och montera blocket i vibratome. Ställvibratome att skära 100 ìm sektioner med reducerad hastighet (inställning 2) och vibrationer (inställning 8). Ställ in skärbladvinkeln till 16 °. Vänd vibratome på, slå på vibratome ljus och skär sektioner från toppen av agarosen tills 100 pm sfäroida sektioner skärs. Placera skurna sfäroida sektioner i HBSS i en 24-brunnar.
  8. Välj mittsektionerna för bildanalys. Mount avsnitt om bilderna genom att överföra avsnittet lägenhet på bilden med hjälp av pincett. Fyll en 10 ml sprutcylinder med vakuum fett; lägg en tunn linje av vakuum fett runt kanterna av sektionen för att förhindra montering media från att köra bort kanterna på bilden och hjälpa täta avsnittet under täck. Täck sektionen med monteringsmedium och ett täckglas. Täta kanterna på täck med nagellack. Butiks glider vid 4 ° C före avbildning.

4. Confocal Image Acquisition

  1. Ta en z-skiva bilden av en mitt Fucci sfäroid sektionen med hjälp av en 10Xeller 20X objektiv som tidigare beskrivits 7. Se till att ingen överlappning eller överhörning sker mellan Kusabira Orange2 och Azami Green. Om man jämför bildanalys mellan flera sfäroida sektioner hålla lasereffekt och andra inställningar på samma mellan prover.

5. Hoechst Dye Diffusion analys för Flow Sortering

  1. Överför levande sfäroider (3-5 dagar efter agaros sådd) till ett 15 ml rör. Låt sfäroider gravitationen sedimenterar till botten av röret. Flera spheroids kan färgas per rör. Det behövs ungefär 20 sfäroider för att få tillräckligt cellantal för flödescytometri.
  2. Ta bort överflödigt medium och tillsätt 1 ml 10 iM Hoechst utspätt i normalt medium. Inkubera sfäroider vid 37 ° C i ungefär en timme. Använd mild snärta att suspendera sfäroiderna en eller två gånger under inkubation.
    Obs: Inkubationstiden kan varieras för att förändra hur långt Hoechst färgämne penetrerar in sfäroiderna. Detta kommer att variera beroende påsfäroiddiametern storlek, densitet och cellinje. För vissa stora / täta sfäroider kan det finnas en maximal färgpenetration som är mindre än 100%.
  3. Tvätta sfäroiderna försiktigt med 5 ml HBSS använder gravitationssedimentering.
    1. Valfritt: För avbildning av färgpenetration: Fix sfäroider med 10% neutral buffrad formalin under åtminstone 2 h vid RT eller O / N vid 4 ° C. Förbered vibratome sektioner, montera på diabilder och bild på konfokala som beskrivs i steg 3 och 4 ovan.
  4. För att framställa celler för flödescytometri, trypsinize sfäroider med 1 ml 0,05% trypsin / EDTA vid 37 ° C under ca 30 min med snärta varje 10 min för att bryta sfäroiderna isär.
    Obs: Sfäroider är svårt att komma in encellssuspension får villkor måste optimeras. Viabiliteten av C8161 4 dagar gamla sfäroider efter denna process är ca 95%.
  5. Stain celler med en nära infraröda levande / död fläck enligt tillverkarens protokoll. Tvätta med HBSS sedan fixa med enml 10% neutral buffrad formalin under cirka 30 minuter. Celler kan lagras i HBSS vid 4 ° C under flera dagar före flödesanalys.

6. Flödescytometrianalys av Hoechst Stained Fucci Sfäroider

  1. Se till celler är inte hopklumpade samman genom att passera dem genom ett cellfilter. Resuspendera Hoechst färgade Fucci sfäroider i iskall FACS tvätt (PBS med 5% fetalt kalvserum) i en koncentration av 1-5 x 10 6 celler / ml. Överför 200 pl prov till 5 ml rundbottnade rör.
  2. Förbered följande enkla färgkontrollprover som beskrivs i 6.1: un-färgade melanomceller; vidhäftande melanomceller färgades med 10 | iM Hoechst för en h; Azami Grön endast uttrycker melanomceller; och endast Kusabira Orange uttryckande melanomceller.
    Obs: enfärgade kontroller kan fixeras i formalin och lagrades i FACS tvätta med 0,1% natriumazid vid 4 ° C i veckor eller månader.
  3. Kör enkelcellsuspensioner ona flödescytometri analysator med lämpliga laser och enda färg / ofärgade kontroller som tidigare beskrivits 7,16.
  4. Använd kommersiella cytometri program som FlowJo att analysera inre kontra yttre sfäroida celler enligt följande:
    1. Ta bort skräp genom grind på huvudcellpopulationen i framåt spridda ljus (FSC) mot sidan av spritt ljus (SSC).
    2. Ta bort dubbletter genom grind på enstaka celler genom att använda FSC (Area) vs. FSC (höjd)
    3. Gate för levande celler genom grind på levande / döda låg befolknings.
    4. Definiera Hoechst höga celler, gated baserat på den positiva signalen från de vidhäftande cellerna färgade med Hoechst, som "yttre" celler.
    5. Definiera Hoechst låga eller negativa celler, gated baserat på signalen från FN-färgade kontroll, som "inre" celler.
    6. Efter grind för de inre och yttre populationer kan celler gated ytterligare för Fucci red (G1), gul (tidig S), grön (S / G2 / M) eller negativ (tidig G1).
      Obs: Compensation med hjälp av enfärgade kontroller kan erfordras för att korrekt definiera Fucci rött, gult, grönt och negativa populationer.
  5. När analysen har optimerats och Hoechst penetration valideras via konfokalmikroskopi, köra celler utan uppsättning på en flödescellsorterare som tidigare beskrivits 7,16 för ytterligare analys av levande celler subpopulationer.

7. Bildanalys av Fucci Spheroid Sektioner

  1. Öppen programvara, t.ex.. Volocity väljer Kvantifiering ENDAST konfigurationen.
  2. Skapa ett nytt bibliotek. Importera Fucci sfäroid konfokala bildfil i mjukvaran genom att dra rådatafilen från konfokala i biblioteket. Alternativt kan du använda Arkiv> Importera kommandot.
  3. Gå till fliken mätningar för att bygga ett bildanalysprotokoll. Protokollet är byggt genom att dra och släppa lämpliga kommandon i rätt ordning på följande sätt i protokollet fönstret.
  4. Hitta objjekt i den gröna kanalen: Dra hitta objekt kommandot (finns i "Hitta") i protokollfönstret, välja rätt kanal i hitta objekt protocol.Add en öppen kommandot (finns i "Processing"), sedan en separat vidröra objekt kommandot (finns i "Processing" - detta kommer att skilja celler). Uteslut objekt efter storlek <50 m (finns i "Filtrering" - detta kommer att undanta små icke-cellulära objekt).
    Obs: Variabler såsom hittar objekt tröskelvärde, antalet öppna iterationer, till storleken på föremålen separeras och storleken på objekt att utesluta måste manuellt optimeras tills objektmasker matcha bilden.
  5. Hitta föremål i den röda kanalen: Upprepa hitta objekt som ovan för den röda kanalen. Gröna och röda protokoll kan behöva justeras separat.
    Obs: På grund av kärnor är i G2, gröna kärnor är ofta något större.
  6. Bekräfta föremål som hittats är korrekta: Bekräfta röda och gröna objekt matcharröda och gröna kärnor i bilden genom att stänga av och på de gröna och röda kanaler (med huden eller visa kanal kommando) när de visar de röda och gröna masker hittats av protokollet. Feedback alternativ (Mätningar> Feedback alternativ) kan användas för att ändra utseendet på objektmasker.
  7. Hitta gula föremål (tidig S-fas-celler): För att hitta gula celler, lägga till en skärnings röd med gröna celler kommandot (finns i "kombinera"). Uteslut objekt efter storlek (<50 pm, som finns i "filtrering") att utesluta små icke-cellulära objekt.
  8. Hitta enbart röda objekt (G1 fasceller): För att hitta enbart röda kärnor, subtrahera de gula cellerna från de röda blodkropparna (som finns i "kombinera"). Uteslut objekt efter storlek <50 um, (finns i "filtrering") för att avlägsna eventuella små icke-cellulära objekt skapade.
  9. Hitta uteslutande gröna föremål (S / G2 / M-fas-celler): Upprepa för den gröna kanalen för att hitta uteslutande gröna.
    Nejte: Om det fortfarande finns icke-cellulära objekt kvar, en filterbefolknings kommando kan tillsättas till den exklusiva gröna eller exklusiva röda protokoll (som finns i "filtrering") att endast spara objekt med en formfaktor som är större än 0,25. Detta kommer att avlägsna icke-cirkulära objekt.
  10. Hitta sfäroid kontur: Hitta sfäroiden kontur med hjälp av ett fynd objekt kommandot (finns i "Hitta") med den gröna eller röda kanalen (det som har fler celler runt kanten av sfäroid). En betydligt lägre tröskel (som finns i hitta objekt variabler) kommer att behöva användas för att hitta sfäroid kontur jämfört med enskilda celler.
    1. Använd en nära kommando för att ansluta sig till objekt (som finns i "Processing"), fyll sedan hål i objekt (som finns i "Processing"), använd sedan ett fint filter (finns i "filtrering") för att ta bort brus från föremål. Slutligen utesluta objekt efter storlek för att avlägsna mindre föremål <30.000 pm (beroende på sfäroid storlek).
      Notera: Detta protokoll måste optimeras manuellt till sfäroiddiametern konturen är korrekt. En bright bild kan också användas - men detta är vanligtvis mindre exakt med en sfäroid sektion och en vändkommando (som finns i "kombinera") kommer att behöva användas.
  11. Mäta avstånd av kärnor till sfäroid kontur: Mäta avstånd (som finns i "relatera") från de gula, uteslutande gröna och uteslutande röda befolkningar från celltyngd till kanten av sfäroid outline.To visualisera minimiavstånd, som bör vara från cell till närmaste sfäroid kanten, aktiverar visar avstånd i fliken relationer återkopplingsalternativ (Mätningar> Feedback alternativ> Förhållanden).
  12. Spara protokollet. Detta protokoll kan åter tillämpas på andra bilder genom att använda Mätningar> Återställ protokoll kommandot.
  13. Skapa en mätningar objekt (Mätningar> Gör Measurement Post). Data kan analyseras med hjälp av analysfunktioner.
    1. Gå till fliken analysen i mätningarna posten. Gå till Analys menyn (Analys> Analysera) och analysera det minsta avståndet från celltyngd (röd, grön eller gul) till sfäroiddiametern kanten, summerade per räkning och organiseras av befolkningen.
    2. För att räkna antalet celler som finns på ett visst avstånd från kanten skapa ett filter (Analys> Filter). Filtret för minsta avstånd i figur 2 är baserad på Hoechst penetration (t.ex. minsta avståndet är mindre än 80 ger "yttre" population). Alternativt, export rådata till ett kalkylblad för vidare analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det finns flera metoder för framställning av tumör sfäroider, detta protokoll använder icke-vidhäftande tillväxtmetod, där celler odlas på agar eller agaros 3,7,9. Figur 1 visar ett exempel på en C8161 melanom sfäroid efter 3 dagar på agar. C8161 spheroids bildar normalstora sfäroider med en diameter på 500-600 pm (medelvärde = 565, SD = 19, n = 3) efter 3 dagar. Andra melanomcellinjer som kommer att bilda sfäroider omfattar: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (sfäroider bildats med denna cellinje är oregelbundna och mindre tät 19).

För att visualisera cellcykeln av enskilda celler inom 3D sfäroid modellen var C8161 melanomceller transduceras med Fucci systemet 7,15. På grund av den stora storleken på sfäroiderna (upp till 1 mm i diameter efter 3 dagar på agaros och 24 tim tillväxt i kollagen för C8161), är snitt det bästa alternativet för att visualisera celler i mitten av sfäroid. Helasfäroider (levande eller fixerade) kan förses med bild genom konfokalmikroskopi, den konfokal avbildning är emellertid endast i stånd att penetrera upp till ungefär 150 | im, därför endast kan erhållas ett mitt optisk skiva av sfäroid i sfäroider med en diameter mindre än 300 | im. Figur 2A, B och C visar ett exempel på ett snitt genom en C8161 Fucci sfäroid. En nekrotisk kärna, omgiven av G1 arrested celler, med en gradient av prolifererande celler i de yttre skikten är uppenbar. Att identifiera och kvantifiera celler baserat på deras position i sfäroid och cellcykeln status, var halvautomatisk bildanalys utförs. Figur 2D visar Fucci cell masker och sfäroid kontur, och figur 2E visar kvantifiering av antalet röda (G1) och gröna eller gula (S / G2 / M) celler antingen är mindre än 80 | j, m från kanten av den sfäroid (yttre cellerna) eller större än 80 ^ m från sfäroid kant (inre celler). Denna quantificatipå visar att röda celler i G1 är kraftigt anrikade på den inre regionen av sfäroid, som förväntat.

För att identifiera och potentiellt sortera celler baserat på deras cellcykel status och position i sfäroid ades en Hoechst färgdiffusion analys i kombination med Fucci system som används. Inkubation av hela sfäroider med Hoechst dye resulterar i en begränsad diffusion av färgämnet i de yttre skikten av den sfäroid, kan detta användas för att separera Hoechst positiva yttre skiktceller från Hoechst negativa inre sfäroida celler via flödescytometri. Figur 2F visar penetrationen av Hoechst upp till ungefär 80 | j, m från sfäroid kant. Hoechst positivitet avstånd av 80 ^ m från kanten erhölls genom visuell analys av sfäroida avsnitt och optimering av tid färgämneskoncentrationen och inkubering så att Hoechst penetrationen märkt noga prolifererande celler i de yttre skikten (som till stor del har hittats mindreän 80 | j, m från kanten), och inte tränga in i G1 arrested area.The inkubationstid med Hoechst kan varieras för att erhålla djupare eller grundare penetreringen. Ett exempel på varierande Hoechst penetrering över tid i visas i figur 3. Figur 4A visar ett exempel på gating för Hoechst höga och låga populationer, medan figur 4C och D visar grindnings för Fucci röda, gula och gröna celler. Figur 4B visar kvantifiering för antalet röda (G1) och gröna eller gula (S / G2 / M) celler antingen i Hoechst hög (yttre cellerna) eller Hoechst låg (inre celler). Återigen denna teknik visar att röda blodkroppar i G1 är berikat i den inre regionen av sfäroid (jfr. Likhet med bildanalys i fig 2E).

Figur 1
Figur1:. C8161 Sfäroid representant faskontrastbild tagen vid 10x förstoring av en C8161 sfäroid efter 3 dagars odling på agar. Skala bar är lika med 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2:. C8161 Fucci Sfäroid bildanalys representativ bild av en C8161 Fucci sfäroiden vibratome snitt vid 20X förstoring. Sfäroid odlades under tre dagar på agaros, sedan ytterligare 24 h i kollagenmatrisen. Confocal z-skiva (A) Azami Green, (B) Kusabira Orange2 och (C) Fucci overlay. Skalstreck = 100 | am. (D) Röda och gröna objektmasker skapats i Volocity, med sfäroid kontur i grått. Arraden indikerar 80 ^ m bort från sfäroid kant. (E) Kvantifiering av antalet röda (G1) och grön / gul (S / G2 / M-celler) i den inre (> 80 ^ m från sfäroid kant) och yttre (<80 | am från sfäroid kant) regioner. Felstaplar representerar SD från 4 sfäroida sektioner från 2 oberoende experiment. (F) Penetration av 10 iM Hoechst färgämne efter 1,5 timmars inkubation. Skala bar = 100 um. Klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3:. C8161 Sfäroid Hoechst färgdiffusion Tidsförlopp Representativa konfokala z-skiktbilder från mitten av hela C8161 sfäroider odlades på agaros i 4 dagar och inkuberades med 10 pM Hoechst under de angivna tiderna. Taget på 10x förstoring. Vita staplar anger den ungefärliga Hoechst penetrationsdjupet. Observera att C8161 agaros sfäroider är tätare än C8161 sfäroider som har implanteras i kollagen under 24 timmar i figur 2, vilket resulterar i mindre färgnings vid samma tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4:. C8161 Fucci Sfäroid Analys (A) Exempel på Hoechst hög och låg grind efter inkubation av 20 sfäroider med 10 iM Hoechst. Blå linjen visar ofärgade kontroll, grön linje indikerar en helt färgade Hoechst kontroll. (B) Kvantifiering av antalet röda och gröna / gula celler i den inre (Hoechst låg) och yttre (Hoechst hög) populations. Felstaplar representerar SD från 8 oberoende experiment (inklusive både live sortering och fast cellanalys). Exempel på Fucci grind för det inre (C) och yttre (D) sfäroida populationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Halvautomatisk bildanalys identifierade sfäroid inre G1 greps regionen, och prolifererande yttre skikt. Denna metod kan användas på levande sfäroider med hjälp av en optisk avsnitt, eller i fasta sfäroida sektioner, för att identifiera förändringar i inte bara cellcykeln men markör uttryck (via immunofluorescens), celldöd, eller cellmorfologin i dessa olika områden. Cellmotiliteten inom olika sfäroida regioner kan också kvantifieras - om levande konfokal time lapse avbildning tillsammans med en spårning cell bildanalys steg tillsätts. Avgörande för bildanalys är att skiva konfokala bilder av hög kvalitet Z- erhålls högre upplösning möjliggöra en bättre identifiering av celler. En begränsning med bildanalys är att det inte är möjligt att hitta varje cell korrekt om kärnorna är alltför tät, eller om det finns för mycket variation i rött och grönt intensitet. Fucci negativa celler (i tidig G1) inte kan hittas med denna bildanalysmetod, bara rött (G1),gul (tidig S-fas) och grön (S / G2 / M). En annan nackdel med den bildbaserade analysmetod som beskrivs här är att det inte tar hänsyn till full 3D karaktär sfäroiderna. Fastän Volocity programvara kan utföra 3D mätningar med hjälp av z-stack bilder, är konfokalmikroskopi oförmögen att penetrera och bilden genom hela sfäroid grund av den stora storleken. Multi-photon avbildning kan användas för att erhålla ett z-stack en hel sfäroid för 3D mätningar 7 som denna teknik möjliggör penetration av upp till 500 um, även om vissa spheroids kan fortfarande vara för stor att avbilda hela spheroids via denna metod. Ett annat alternativ för avbildning hela sfäroid är ljus ark baserad mikroskopi, vilket möjliggör visualisering av sfäroid från flera vinklar och tränger upp till 200 um inuti stora sfäroider 20,21. Val av avbildningsstrategin kan påverkas av sfäroiddiametern storlek, cellpackningstäthet och celltyp.

Hoechst-färgämne diffusion förfarande för separering av inre och yttre celler i en multicellulär sfäroid via flödescytometri beskrevs första gången 1982 22. Denna metod grundar sig på det faktum att Hoechst färgämnet diffunderar långsamt i sfäroid, med de yttre cellerna färgades först. Protokollet som beskrivs här kombinerar Hoechst metod med Fucci systemet 15, som gör det möjligt inte bara separation av inre och yttre sfäroida celler, utan även visualisering av Hoechst penetrering i förhållande till den inre ringen av G1-arrested celler. Detta möjliggör exakt separation av G1 arrested regionen av sfäroid. Använda Fucci enbart tillåter inte separation av de inre G1 arrested celler från en sfäroid, med tanke på att de yttre prolifererande celler innehåller också celler i G1. En begränsning är att denna metod medger endast en rå separation av sfäroid i två regioner ("yttre" Hoechst positiv och "inre" Hoechst negativ). Fördelen med denna metod över bildanalys, är att flåg cytometri gör att flera markörer som ska testas på en gång, och fysisk separering av levande celler för vidare analys nedströms såsom gen eller proteinuttryck, re-odling i olika miljöförhållanden, läkemedelsbehandlingar eller annan analys.

Den Fucci sfäroid system i kombination med flödescytometri och bildanalys möjliggör identifiering av en inre ring av G1 arrested celler som omger den nekrotiska kärnan och ett yttre skikt av prolifererande celler. Nekros och G1 gripande som finns i mitten av sfäroiden beror på brist på syre och näringsämnen, och utvecklas som sfäroiden växer i storlek. Tidigare har vi och andra visat samlokalisering av pimonidazole hypoxi markören med G1 greps sfäroid center 7,23. Vi visar också att spridningen sker till stor del inom cirka 100 pm från kanten av sfäroid. Detta motsvarar tidigare studier i sfäroider 12,23,24, och även korrelerar med distance prolifererande celler från närmaste kärl in vivo 25,26.

En alternativ metod som kan användas för att separera celler baserat på deras position i sfäroid för flödescytometri eller annan analys är sekventiell trypsinization 24,27. I denna metod successiva "skal" av sfäroid avlägsnas genom korta, sekventiella inkubationsperioder med trypsin vid låga temperaturer. Men med hjälp av denna metod är det mer svårt att fastställa den exakta storleken på det yttre skalet (i ^ m tjocklek) som avlägsnas i jämförelse med Hoechst färgdiffusion metod, där Hoechst penetrationen kan direkt visualiseras och mätas.

Separation av de "inre" och "yttre" celler genom färgdiffusion och / eller bildanalys kan utsträckas till studier av Fucci tumörxenotransplantat i möss. Emellertid för analys av cellcykeln in vivo närvaron av kärlsystemet bör också vara TAken hänsyn som celler i en tumör kan ha möjlighet att få tillgång till syre och näringsämnen från kärl i de centrala delarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
agarose low melting point Life Technologies 16520-050 For sectioning
noble agar  Sigma A5431 For making spheroids
agarose for spheroids Fisher Scientific BP1356-100 For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
HBSS Life Technologies 14175-103
10% formalin Sigma HT5014-1CS CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR Life Technologies L10119
vibratome Technical Products International, Inc
coulture cup Thermo-Fisher Scientific SIE936 Mold for sectioning spheroids
hemocytometer Sigma Z359629
96-well tissue culture plate Invitro FAL353072
collagenase Sigma C5138 
confocal microscope Leica TCS SP5
Flow cytometer analyser Becton Dickinson LSRFortessa
volocity PerkinElmer Imaging software
flowjo Tree Star Flow cytometry software
Vaccuum grease Sigma Z273554
Mounting media Vector Laboratories H1000
FUCCI (commercial constructs) Life Technologies P36238 Transient transfection only
Cell strainer 70 μm In Vitro FAL352350
Round bottom 5 ml tubes (sterile) In Vitro FAL352003
Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) In Vitro FAL352008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
  4. Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
  5. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
  8. Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
  9. Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
  10. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  11. Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
  12. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  13. Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
  14. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
  15. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  17. Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
  18. Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
  19. Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
  20. Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
  21. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
  22. Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
  23. Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
  24. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
  25. Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
  26. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  27. Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).

Tags

Medicin melanom sfäroid cellcykeln bildanalys flödescytometrianalys 3D cancerbehandling cancer cellbiologi hypoxi tumörundergrupper vibratome sektionering flercelliga.
Imaging- och flödescytometri-baserad analys av cell Position och cellcykeln i 3D Melanom Sfäroider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, More

Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. J. Vis. Exp. (106), e53486, doi:10.3791/53486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter