Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных

doi: 10.3791/53495 Published: January 5, 2016

Abstract

Экзосомы небольшие пузырьки размером от 30 до 100 нм, которые выпускаются как конститутивно и после стимуляции из различных типов клеток. Их можно найти в ряде биологических жидкостей и, как известно, несут различные белки, липиды и молекул нуклеиновых кислот. Первоначально думали, чтобы быть немного больше, чем резервуары для сотовой мусора, роли регулирующих экзосом биологические процессы и в более заболеваний оценены.

Некоторые методы были описаны для выделения экзосомы из сотовой медиакультуры и биологических жидкостях. Из-за их небольшого размера и низкой плотности, дифференциального центрифугирования и / или ультрафильтрации являются наиболее часто используемые методы для выделения экзосома. Тем не менее, в плазме ВИЧ-1 инфицированных содержит как экзосомы и вирусные частицы ВИЧ, которые похожи по размеру и плотности. Таким образом, эффективность разделения экзосом от ВИЧ вирусных частиц в плазме крови человека былвызов.

Для решения это ограничение, мы разработали процедуру модифицированную Cantin др. др., 2008 для очистки экзосом из частиц ВИЧ в плазме крови человека. Градиенты скорости иодиксанола были использованы для разделения экзосомы из ВИЧ-1 частиц в плазме ВИЧ-1-инфицированных. Вирусные частицы были идентифицированы р24 ELISA. Экзосомы были определены на основе маркеров экзосома ацетилхолинэстеразы (АХЭ), и антигенов CD9, CD63, CD45 и. Наша процедура градиент дали экзосома препараты, свободные от вирусных частиц. Эффективная очистка экзосом из человеческой плазмы позволило нам изучить содержание плазмы крови экзосом и исследовать их иммунную модулирующее потенциал и другие биологические функции.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эпидемия ВИЧ-1 по-прежнему имеет значительное влияние во всем мире. В 2013, примерно в 35 миллионов человек по всему миру, живущих с ВИЧ, и 2,1 млн из них были вновь инфицированных 1. Превентивные стратегии и расширение доступа к антиретровирусной терапии, было полезно в сокращении общего заражения ВИЧ. Тем не менее, отдельные группы населения по-прежнему испытывает подъемы в приобретении ВИЧ 1. Таким образом, существует необходимость в постоянных усилиях по борьбе с этой эпидемией.

Один из самых сильных предсказателей прогрессирования ВИЧ-инфекции является хроническая иммунная активация (ЦРУ) 2-10. Определено упорно высоких уровнях обнаруживаемых цитокинов и повышенных маркеров экспрессии на поверхности Т-лимфоцитов, ЦРУ было обусловлено: I) непрерывной дендритных клеток типа I IFN 11; (II) прямое иммунная активация обусловлен белков ВИЧ Tat, Nef и gp120 12; (III) Транслокация бактериальных белков в кишечнике связаны иммунных клеток 6. Тем не менее, точный механизм (ы), лежащий в основе хронической, системная активация иммунной ВИЧ-инфекции в еще предстоит в полной мере выяснены.

Наша исследовательская группа и др продемонстрировали роль в патогенезе экзосом ВИЧ 15-18. Наша группа установила, что белок Nef выводится из инфицированных клеток в экзосом 15, и exosomal Неф (exNef) присутствует в плазме ВИЧ-инфицированных лиц на уровне нг 18. Мы показали, что прохожего CD4 + Т-клетки подвергаются exNef привело активации индуцированной клеточной гибели, зависящей от CXCR4 пути 19, 20. Кроме того, моноцитов / макрофагов были резистентны к exNef-индуцированного апоптоза, но выставлены измененные клеточные функции и экспрессии цитокинов. Совсем недавно, наша группа, показанные экзосомы, выделенные из плазмы ВИЧ-инфицированных содержат множество провоспалительных цитокинов. Марихуанаrther, наивные одноядерные клетки периферической крови подвергаются плазмы крови экзосом от ВИЧ-инфицированных пациентов, вызванных выражение CD38 на клетках наивно и центральной памяти CD4 + и CD8 + Т. Это, вероятно, способствует системного воспаления и размножения вирусов через активацию 21 наблюдателем клеток, и предполагает, что экзосомы играют важную роль в патогенезе ВИЧ.

При исследовании роли экзосом в патогенезе ВИЧ-инфекции, одной из проблем является разработка методов эффективного отдельных экзосомы из частиц ВИЧ, сохраняя при этом содержание exosomal а также их функциональная иммунная способность модуляторный. Несколько методов были описаны для выделения экзосомы из культуры клеток и биологических жидкостях 22,23. Из-за их малого размера и низкой плотности (экзосомы плавать при плотности 1,15 - 1,19 г / мл), дифференциальное ультрацентрифугирования и / или ультрафильтрации являются наиболее часто используемые методы для изоляции экзосома 23.Тем не менее, ВИЧ-инфицированные клетки и культуральные супернатанты плазмы пациентов содержать как экзосомы и ВИЧ-1 вирусные частицы. Экзосомы и ВИЧ-1 частицы очень похожи по размеру и плотности. Кроме того, пользуясь выражением уникальных exosomal маркеров, таких как CD63, CD45, CD81 и, экзосомы были выделены с использованием методов улавливания иммуноаффинная 23. Эта процедура может отделить от вируса экзосом. Тем не менее, недостатком этого метода является жесткой привязанности антител к очищенных экзосом, которые могут помешать оценке иммуномодулирующим потенциалом экзосом в культуре.

Для преодоления этих ограничений, мы разработали процедуру очистки экзосом из частиц ВИЧ в плазме крови человека модифицированных с Cantin и коллегами, используя 22 градиентов скорости Иодиксанол. Экзосомы найдено отделить в низкой плотности / верхний фракции иодиксанола градиентов, тогда как вирусные частицы отделены в высоко-плотность / нижние фракции. Вирусные частицы были определены р24 ELISA и экзосомы были определены с использованием маркеров экзосома боль, CD9, CD63, CD45 и. Верхние фракции низкой плотности, собранные содержится экзосомы которые были отрицательными для заражения ВИЧ-1 р24. Эффективное очищение и разделение экзосом из частиц ВИЧ в плазме крови человека позволяет точно рассмотрении содержания экзосомы, полученных из человеческой плазмы, а также при исследовании их иммунной модулирующего потенциала и диагностическое и прогностическое значение экзосом в ВИЧ-1 патогенезе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Общая схема процедуры выделения экзосом и очистки обеспечивается на рисунке 1. Цельная кровь была получена от здоровых доноров-добровольцев и у ВИЧ-инфицированных лиц, не получающих антиретровирусную theraoy лечащего Надежда клиника Университета Эмори и инфекционный программу заболевание системы здравоохранения Грейди в Атланте, штат Джорджия. Это исследование было одобрено институциональных наблюдательных советов Университета Эмори и Морхаус в Школе медицины. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие и.

1. Подготовка экзосомы из плазмы крови

  1. Человек забор крови и обработки
    1. Сбор 10 мл периферической крови из вены в пробирок ЭДТА крови (содержащей 18 мг калия EDTA), и осторожно инвертируют в пять раз перемешать.
    2. Центрифуга трубки забора крови при 1000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы осадить клетки крови. Используйте стерильную пипеткуте передавать фракции плазмы (4-5 мл) в 25 мл коническую пробирку. Развести плазму с 10 мл 1 X PBS. Откажитесь клетки крови (эритроциты и лейкоциты, также известные как РВМС) в соответствующим образом маркированы контейнер для биологически опасных отходов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае незараженных образцов донорской крови, РВМС могут быть зарезервированы для дальнейшего использования (см процедуру IV.2, ниже).
    3. Храните образцы плазмы при температуре 4 ° С за короткий срок (2-3 дня) или при -80 ° С на более длительный срок хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Принесите любые замороженные образцы плазмы до 4 ° С перед дальнейшей обработкой.
  2. Подготовка экзосома фракции из плазмы
    1. Центрифуга плазмы при 10000 х г в течение 30 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток. Использование стерильного серологические пипетки для передачи очищенной плазмы супернатант в 25 мл чистой ультрацентрифужную пробирку. Откажитесь от гранул в контейнер для биологически опасных.
    2. Центрифуга очищенную плазму при 100000 х г в течение 2ч при 4 ° С для удаления крупных пузырьков. Снимите 100000 XG супернатант тщательно с помощью пипетки, и выбросить в биологической отходов. Ресуспендируют осадок 100000 х г в 1 мл PBS в 1X чистую пробирку и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, осторожно вращая, чтобы сместить и отдельные частицы.
    3. Вымойте приостановлено 100000 XG экзосом / вирусов гранул путем добавления 25 мл PBS. Аккуратно инвертировать трубу на пять раз, чтобы смешать, затем центрифуги снова при 100000 х г в течение 2 ч при 4 ° С. Откажитесь от моющего раствора PBS в контейнер для биологически опасных отходов.
    4. Ресуспендируют осадок 100000 х г в 1 мл PBS 1 X и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин закрученного аккуратно, чтобы сместить и растворить осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не возможно, чтобы приступить непосредственно к градиент шага Иодиксанол, хранить осадок, содержащий экзосомы и вирусные частицы, при 4 ° С в течение 1-2 дней, пока на стадии иодиксанол градиента.

2. Очистка экзосомы

  1. Создание 6% -18% VELOCности градиенты иодиксанола использованием двухкамерного градиента бывшего аппарата.
    1. Подготовка 6% и 18% растворы в Иодиксанол реагента, поставляемые в виде 60% раствора в воде, путем разбавления в PBS. Внесите 5,5 мл 18% -ного раствора в камеру перемешивали и пипетки 5,5 мл 6% раствора в резервуар камеры. Включите мешалкой, открыть кран и позволяют каждому градиент стечь в 14 мл ультрацентрифужную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Либо использовать сразу или хранить подготовленные градиенты O / N при 4 ° С до использования.
    2. Тщательно слой 1 мл экзосом / раствора вируса на верхней части каждой 11 мл с градиентом. Центрифуга градиентов 250000 х г в течение 2 ч при 4 ° С, используя SW40Ti Бакет ротора.
    3. Добавьте двенадцать (12) 1.5 мл микроцентрифужных трубки. Удалить 1,0 мл из верхней части градиента, и передать трубки # 1. Перенесите оставшиеся 1мл фракции в пробирки 2-12 в последовательном порядке.
      Примечание: Самый верхний фракции таким образом, будет # 1, в нижней фракции, # 12. УлицаРуды градиентные фракции при 4 ° С. Очищенные экзосомы, которые должны быть во фракциях 1-3 в верхней части градиента, стабильны в течение 3-4 недель при хранении при 4 ° С.

3. Характеристика экзосома

  1. Ацетилхолинэстераза (АХЭ) Анализ активность
    1. Подготовьте 100 мМ субстрата запас путем смешивания ацетилтиохолиниодида 28,9 мг в 1 мл PBS 1X. Магазин субстрат акций при -20 ° C до 1 месяца.
    2. Подготовьте 10 мм, цвет индикатора запаса путем смешивания бензойная кислота 39.6mg и бикарбонат натрия 15 мг в 10 мл 1X PBS. Магазин цвет индикатора фондового при 4 ° С до двух недель.
    3. Подготовка анализа реагента путем смешивания 1X PBS, подложки, и цветовой индикатор в соотношении 100: 2: 5 (например, 10 мл 1X PBS + 200 мкл субстрата + 500 мкл цветовой индикатор).
    4. Передача 50 мкл из каждой 1,5 мл фракции градиента трубы (обозначено 1-12, от процедуры III.3) в лунки microtite 96-луночногог пластина. Подготовка дубликатов скважин для каждого образца градиента.
    5. Подготовьте набор стандартов, сначала делая мкЕд / мл AChE акции 2000 в PBS. Сделать одиннадцати (11) 2-кратных серийных разведений этого запаса и добавить 50 мкл каждого разбавления в отдельную лунку микротитрационного планшета, так, чтобы стандарт # 1 = 2000 мкЕд / мл, # 2 = 1,000 мкЕд / мл, # 3 = 500 мкЕд / мл и т.д. до # 12 = 0,98 мкЕд / мл. Стандарты двенадцать АХЭ, таким образом, занимают одну строку в планшет для анализа 96-а.
    6. Добавить 200 мкл смеси реагентов для анализа в каждую лунку и инкубируют 20 мин (в темноте) при комнатной температуре, чтобы позволить развитие цветной продукта реакции. Измерить активность AChE на длине волны 450 нм с использованием флуоресцентного микропланшет-ридера.
      Примечание: Процент исходного материала, остающегося после очистки экзосома оценивается АХЭ анализе по нефракционированного плазмы.
  2. Иммуноблот анализ
    1. Отдельные белки в градиентных фракций 1-12 (из ProcedЮр 2.1.3) с помощью SDS-PAGE на 4-20% Трис-HCl сборных гелей при 100 х 1 ч. Передача белков в геле на нитроцеллюлозную мембрану с использованием электрооптического блоттинга клеточного переноса в соответствии с инструкциями изготовителя. Разрешить переводы, чтобы уничтожить в течение 12-16 ч (O / N) на 350В.
    2. Удалить мембрану из промокательной аппарата и промыть в Трис-солевом буфере (TBS) в течение 5 мин. Блок 5% обезжиренного молока в TBS TTBS (0,1% Tween 20) в течение 1 ч при встряхивании при комнатной температуре.
    3. Инкубируйте мембрану с первичными антителами, специфичными к экзосомы (CD9, CD45, CD63) или ВИЧ-1 капсидного белка (P24) в 5% обезжиренного молока при встряхивании при 4 ° С в течение 12-16 ч (O / N). Растворы первичных антител для иммуноблоттинга в диапазоне от 1: 2000 -1: 5000.
    4. Промыть блот в TTBS в течение 20 мин с последующей инкубацией с разведении 1: 2000 пероксидазой хрена (HRP) с анти-IgG (вторичного антитела), в 5% обезжиренного молока в течение 1 часа при комнатной температуре. Вымойте блот 3 раза TTBS, 10 мин на промывку.
    5. Сохранение изображений в формате TIFF, как файлы, которые можно просматривать в Adobe Photoshop. Выполните денситометрии анализ с использованием ImageJ полос программное обеспечение (Национальные Институты Здоровья, Bethesda, MD).
  3. Анализ цитокинов
    1. До цитокинов анализа, нарушить иммунных комплексов, которые обычно присутствуют в человеческой плазме диссоциации кислоты и лизировать экзосомы от детергентом. Анализ оба исходных образцов плазмы и очищенные препараты экзосома.
      1. К 100 мкл человеческой плазмы 100 мкл 0,33 N HCl и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Добавить 100 мкл 0,33 N NaOH, чтобы нейтрализовать кислоты обрабатывают плазмой. Добавить к обеим нейтрализованный плазме и очищенный экзосома образцы Triton X-100, к Интернетнал концентрация 1%, чтобы вызвать лизис экзосом.
    2. Для этого теста (флуоресцентный процедуры шарик на основе), использовать магнитные шарики предварительно покрыты антителами производителем. Используйте специально разработанный панель покрытых антителами бисером антигуманных цитокинов; приведены в таблице 1. вихре покрытых антителами магнитных шариков из набора для анализа цитокинов в течение 30 сек и добавляют 50 мкл бисер в каждую лунку 96-луночного планшета для использования в анализе.
    3. Подготовьте серию разведений стандартов в стандартной плазмы буфера (оба содержатся в наборе цитокинов анализа), как описано в руководстве по эксплуатации набора для анализа цитокинов, чтобы генерировать стандартную кривую 8-точечное.
    4. Добавить 150 мкл промывочного буфера 1X (из комплекта) в каждую лунку и мыть бисером, используя магнитную шайбу шарик, как описано в руководстве. Добавить 25 мкл буфера для анализа плазмы (от комплекта) в каждую лунку. Добавить 25 мкл стандартов и образцов для всех скважин, используемых в анализе. Добавить 25 мкл плазмыОбразец буфера негативных скважин управления. Печать и встряхните пластину на 700 оборотов в минуту в течение 60 мин при комнатной температуре и инкубировать O / N при 4 ° С.
    5. Добавить 150 мкл промывочного буфера 1X в каждую лунку и мыть плиту (как в шаге 3.3.4, выше). Добавить 25 мкл антител обнаружения в каждую лунку, печать и встряхните пластину на 700 оборотов в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите этап промывки.
    6. Добавить 50 мкл стрептавидин раствора (SAPE, из комплекта) в каждую лунку, печать и встряхните пластину на 700 оборотов в минуту в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите плита моет как в 3.3.4.
    7. Добавить 120 мкл буфера для чтения (с комплектом) в каждую лунку и встряхивают в лабораторном шейкере при настольной 700 оборотов в минуту в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы позволить флуоресцентный сигнал для разработки. Читайте пластину на ридере в соответствии с указаниями изготовителя.
    8. Для того, чтобы счет на сумму экзосом потерянных во время процедуры изоляции, использовать следующее уравнение: [(оригинал чтения / объем плазмы) х 66,6 = регулируется чтения цитокинов].

4. Анализ на иммуномодулирующего потенциала

  1. Приготовление питательной среды с экзосома-обедненного фетальной бычьей сыворотки
    1. Центрифуга 500 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) при 100000 х г в течение 20 ч при 4 ° С для осаждения загрязняющих экзосомы и микровезикулы. Осторожно снимите и сохраните экзосома обедненного FBS супернатант. Откажитесь от гранул в биологической отходов.
    2. Смешайте 20% от экзосома обедненного FBS супернатанта с 500 мл Roswell Park Memorial института 1640 (RPMI 1640) среде. Фильтры среды, через мембранный фильтр 0,45 мкм.
    3. Добавить стрептомицин (100 ед / мл), пенициллин (100 Ед / мл), L-глутамин (2 мМ), HEPES-солевом буферном растворе (10 мкм) и IL-2 (20 Е / мл) к фильтруемой среды.
  2. Культура клеток и экзосома экспозиции
    1. Expose экзосомы донорским мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученных от здоровых добровольцев клиники. Приостановить РВМС вподготовлен культуральной среды и подсчет клеток с помощью счетчика клеток / частиц (по стандартной методике завода-изготовителя).
      Примечание: РВМС получают в процессе подготовки плазмы, описанной выше (шаг 1.2).
    2. Использование подготовленную среду от процедуры 4.1.3, совместно культуры 3.0 х 10 6 (РВМС) с 1 мкг / мл объединенных экзосом из трех (3) ВИЧ-1 серопозитивных или трех (3) ВИЧ-1 серонегативных лиц в общей объеме 1 мл в лунки планшета для культивирования 12-луночного (с крышкой). Инкубируйте культур в течение 48 ч при 37 ° С.
    3. Подготовка РВМС необработанных культурах и культурах, обработанных конканавалином A (Con A; 5 мкг / мл) в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно, как описано выше (4.2.2). Инкубируйте все культуры РВМС в течение 48 ч при 37 ° С.
    4. Непосредственно перед сбором клеток, подготовки разведений следующих флуорохромом конъюгированные моноклональные антитела: Alexa Fluor 700-меченого анти-CD3 (разведение 1: 400), allophycocyAnin (АРС) / цианин 7 (Cy7), меченным анти-CD4 (1: 400), перидинина хлорофилла белкового комплекса, меченного анти-CD4 (1: 400), V450-меченого анти-CD8 (1: 400), биотин меченными анти-CD45RA (1: 1000), фикоэритрин (РЕ) / Cy7 меченных анти-CD62L (1: 1000), ПЭ / цианин 5 (Су5), меченным анти-CD38 (1: 200), ПЭ-Техас красно меченными анти-стрептавидин (1: 2000), а ПЭ / Су5 меченных мыши IgG1k контрольного изотипа (1: 200).
    5. После 48 ч инкубации, собирать РВМС. Промыть РВМС в PBS, чтобы удалить экзосомы и окрашивают клетки инкубировали в течение 1 часа при 4 ° С с отдельными флуорохромом помечены антител. Анализ окрашенных РВМС с помощью проточной цитометрии для количественного выражения хемокинов (как описано 21).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Экзосомы эффективно очищен от ВИЧ-1-инфицированных человеческой плазмы. Изоляты экзосомы, идентифицированные ацетилхолинэстеразы (AChE) активности, отделены в более низкую плотность фракций 1-3 в верхней части иодиксанола градиентов, тогда как вирусные частицы, которые были определены ВИЧ-1 антиген p24 , отделены в более высокой плотности фракций (10-12, в нижней). Наличие экзосом было дополнительно подтверждено идентификации иммуноблот экзосом маркеров АХЭ, CD9, CD45, CD63 и, так и электронной микроскопией (рисунок 2).

Провоспалительных цитокинов и хемокинов, связанные с повышенным и существенно в экзосомы ВИЧ-1 серопозитивных индивидуумов. Очищенные экзосомы и нефракционированного плазмы от инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-серонегативных 1 особи были проанализированы на 21 цитокинов / хемокинов мультиплексной анализа. Все 21 цитокинов / химиоkines были обнаружены в экзосом, выделенных из ВИЧ-1-инфицированных лиц. Кроме того, их уровни были значительно повышены по сравнению с плазмой и экзосом из ВИЧ-1 серонегативных управления (таблица 1).

Экспрессия CD38 была увеличена на поверхности клеток, подвергшихся экзосом от ВИЧ-1 серопозитивных лиц. МНПК от неинфицированных людей-доноров были выставлены в течение 48 часов, чтобы объединенных экзосом от ВИЧ-1 серопозитивных или серонегативных лиц и оценивали уровни активации маркера CD38 на CD4 + и CD8 + Т-клетки через проточной цитометрии. Мы заметили, что на 48 часов после контакта, CD38 выражения на поверхности наивного и центральной памяти клетки CD4 + и CD8 + Т-были значительно повышены в Т-клетках, подвергнутых экзосом от ВИЧ-1-инфицированных лиц по сравнению с ВИЧ-отрицательным лечения экзосома и лечить управления (Рисунок 3).


Рисунок 1. Схематическое изображение изоляции экзосома от ВИЧ-1-инфицированных человеческой плазме. (А) 10 мл периферической крови брали из ВИЧ-1 seropositve и серонегативных индивидуумов. (B) сбора трубки ЭДТА крови центрифугировали при 1000 х г в течение 20 мин при комнатной температуре. (С) отделенную плазму переносили в 50 мл конические пробирки и разводили ½ с 1x PBS и (D) центрифугировали 10,000 мкг в течение 30 мин. (E) супернатант переносили в пробирки и Ультрацентрифуга (F) центрифугировали при 10000 х г в течение 2 ч. (G, H) Супернатант отбрасывали и осадок экзосом ресуспендировали и промывали в 1 мл PBS 1X. (I) После центрифугирования супернатант удаляли, а осадок повторно суспендировали в 1 мл PBS и 1x накладывается на 6-18% градиентом скорости иодиксанол и (J) центрифугировали при 250000 х г в течение 2 ч. (К) После центрифугирования 1 мл фракций из верхней части к нижней части градиента были TRAnsferred 1,5 мл пробирки и анализировали на содержание АХЭ и иммуноблот-анализа. (L) Фракции 2 и 3 были чем объединены и разбавлены 4 мл PBS и 1X (М) центрифугировали при 400000 х г в течение 2 ч. (N), После центрифугирования супернатант отбрасывали, а осадок ресуспендировали в 1 мл PBS 1X для анализа про-воспалительных цитокинов и хемокинов выражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2. Экзосомы эффективно очищен из человеческой плазмы. Индивидуальный иодиксанола градиентом скорости фракций из ВИЧ-серопозитивных индивидуумов или серонегативных подвергали (А) ферментативного количественного анализа для ацетилхолинэстеразы (AChE), и (В) Вестерн-блот-анализа для exosomal маркеров CD9, CD45 и CD63 и вирусный белок р24 и были (С) immunolabeled с анти-CD63 и исследуют с электронной микроскопии, чтобы подтвердить получение очищенных экзосомах (С). (Рис с Konadu др 2014 21, используемого разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Анализ на иммуномодулирующего потенциала. МНПК от ВИЧ-1 серонегативных лиц были подвержены либо объединенных экзосом из плазмы ВИЧ-1 серопозитивных (ВИЧ + Exo) или серонегативных (ВИЧ Exo) физические лица, не лечить, или лечить с 5 мкг / мл конканавалин А (Кон А) в качестве положительного контроля. Через 48 ч экспозиции, наивный (CD45RA + / CD62L +), Центральный (ТКМ; CD45RA- / CD62L +) и эффектов (ТЭМ; CD45RA- / CD62L-) Памяти CD4 + и CD8 + Т-клетки анализировали на экспрессию CD38 методом проточной цитометрии. Концентрация экзосома был нормированная общего белка и добавляют в 1 мкг / мл. Усы представляют среднее +/- SEM из шести независимых доноров. Разница между группами были проверены на статистическую значимость по One Way ANOVA тест. * Р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001, **** р <0,0001. (Рис с Konadu др 2014 21, используется с разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Таблица 1
Таблица 1. Анализ очищенных экзосом и всей плазмы от ВИЧ-1 серопозитивных и серонегативных лиц для про-воспалительных цитокинов и хемокинов выражения. Р <0,05, ** р <0,01, *** р <0,001, **** р <0,0001. (Рис с Konadu др 2014 21, используемого разрешения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Хронический активации иммунной (CIA) и истощение CD4 + Т-клеток являются двумя важными признаками инфекции ВИЧ-1. Они были созданы в качестве предсказателей для патогенеза, с ЦРУ является лучшим предиктором. Тем не менее, основные механизмы вождения хроническое системное иммунную активацию и CD4 + T клеток снижение до сих пор полностью не выяснены. Мы и другие лаборатории разработали убедительные доказательства, что экзосомы выделяемые из ВИЧ-1-инфицированных клеток играют роль в обоих признаков.

Продолжающийся интерес как состав и функции внеклеточного пузырьков привело к публикации различных методов выделения экзосома обеих культур клеток средств массовой информации и биологических жидкостях 24-26. Тем не менее, является препятствием для исследования роли экзосом в ВИЧ-1 патогенезе был эффективным разделение экзосом от ВИЧ-1 частиц, сохраняя способность расследовать как содержание экзосома и функциональную активность. Мы разработали протоCol для очистки экзосом от ВИЧ-1 частиц в плазме человека, используя градиенты скорости иодиксанол. ВИЧ-положительные доноры, используемые в данном исследовании не получили антиретровирусную терапию и образцы плазмы, используемые для этих экспериментов, содержащихся от 1500 до 400000 вирусных частиц / мл в среднем 206.000 вирусных частиц / мл 21. Таким образом, мы показали, что экзосомы в плазме ВИЧ-1 инфицированных может быть эффективно отделена от ВИЧ-1 вирусных частиц, даже когда вирус нагрузки высока. Хотя похожи по размеру и плотности, экзосомы отделены в низкой плотности / верхних фракций Иодиксанол градиентов по сравнению с вирусными частицами, которые отделены в высокой плотности / нижние фракции. В экзосомы полученные способом иодиксанол градиента высокоочищенный и свободный от загрязняющих внеклеточных белков. Чистоту изолированной популяции экзосомы было подтверждено с помощью p24 ELISA, и вестерн-блот анализ ВИЧ-1 p24 капсидного белкаа также Западной анализа для exosomal маркеров, боль, CD9, CD45, CD63 и. Использование этих маркеров в соответствии с недавно опубликованным руководящих принципов для идентификации экзосома 27.

Более физиологически отношение к иммунной активации, очищенные от экзосомы ВИЧ-1-инфицированных лиц были обнаружены цитокины / хемокины при значительно более высоких концентрациях, чем экзосом из ВИЧ-1 серонегативных управления. Кроме того, экзосомы от инфицированных ВИЧ-1 индивидуумов были биологически активный, демонстрируя способность индуцировать увеличение уровней маркера активации CD38, на поверхности клеток наивным и центральной памяти CD4 + и CD8 + Т. В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что механизм может управлять постоянное иммунную активацию во время ВИЧ-инфекции.

Результаты мы смогли получить, используя нашу экзосома процесс очистки, который объединяет дифференциального центрифугирования и иодиксанол разделение градиент скорости показать значениеиспользования высокоочищенные экзосомы для физиологических и функциональных биопробы. Процедура имеет определенные просчеты и недостатки. Значительное количество из экзосомы, часто большинство исходного материала, рассчитанное измерений AChE активности, теряются во время процесса. Кроме того, процедура также занимает много времени и требует доступа к дорогостоящего оборудования. И, наконец, поколение иодиксанола градиентов с использованием градиента Фромер аппарат требует значительных практике для обеспечения воспроизводимости. Альтернативный способ градиентного поколения может быть подготовить серии градуированных иодиксанола решений, а затем тщательного наслоение растворов в центрифужные пробирки и инкубировали O / N, чтобы градиенты, чтобы сформировать. Тем не менее, мы не проверяли эту альтернативу.

Экспериментальный протокол, описанный здесь для выделения и разделения экзосом от ВИЧ-1 частиц в плазме крови человека является эффективным методом для обеспечения чистоты эксosomes. Использование этого метода привело к захватывающих направлений для будущего исследования о роли экзосом ВИЧ-1 и патогенеза может быть в равной степени используются в запросах для других биологических процессов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)  Becton Dickinson 368589 pink top tubes
Lymphoprep Ficoll reagent Cosmo Bio AXS-1114545
Optiprep iodixanol reagent Sigma D1556
14ml ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 344060 ultraclear tubes
Gradient Former Model 485 BIO-RAD 165-4120
Acetylthiocholine iodide Sigma 1480
Benzoic Acid Sigma D8130
Sodium Bicarbonate Sigma S5761
Acetyl Cholinesterase Sigma C3389
96-well clear microtiter plate Medical Supply Partners TR5003
SpectraMax 190 microplate reader Molecular Devices 190 Fluorescent plate reader
Criterion Gel Electrophoresis Cell BIO-RAD 165-6001
Transblot Gel  BIO-RAD 170-3910
Transfer Cell
Tris-HCl Criterion precast gels BIO-RAD 567-1093
Anti-CD45 antibody  Abcam  Ab10558
CD63 Antibody (H-193) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-15363
CD9 Antibody (H-110) Santa Cruz Biotech, Inc. SC-9148
Rabbit pAb p24 HIV-1  ImmunoDX, LLC 1303
Nitrocellulose membrane  BIO-RAD G1472430
Tris Buffered Saline BIO-RAD 170-6435
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31460 Goat-Anti-Rabbit
HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody Thermo Scientific 31430 Goat-Anti-Mouse
Western Blotting Luminol Reagent Santa Cruz Biotech, Inc. SC-2048
GE LAS-4010 Imager GE Healthcare LAS-4010
Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit Affymetrix  N/A Custom immunoassay panel
Bio-Plex 200 Immunobead Reader BIO-RAD 171-000201
Coulter Z2 Particle Counter Beckman Coulter 383552 Cell counter
Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 BD Bioscience (UCHT1) 300424
APC/Cy7-labeled anti-CD4 Biolegend (OKT4) 317418
PerCP-labeled anti-CD4 BD Bioscience (RPA-T8) 550631
V450-labeled anti-CD8 BD Bioscience (RPA-T8) 560347
Biotin-labeled anti-CD45RA BD Bioscience (HI100) 555487
PE/Cy7-labeled anti-CD62L Biolegend (DREG-56) 304822
PE/Cy5-labeled anti-CD38 Biolegend (HIT2) 303508
APC/Cy7-labeled anti-HLADR Biolegend (L243) 307618
PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin BD Bioscience 551487
PE/Cy5-labeled mouse IgG1K Biolegend (MOPC-21) 400116
APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK Biolegend (MOPC-173) 400229

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. Geneva Switzerland. (2013).
  2. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).
  3. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).
  4. Bofill, M., et al. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10, 827-834 (1996).
  5. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).
  6. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).
  7. Roberts, L., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24, 819-831 (2010).
  8. Mueller, Y. M., et al. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J Virol. 79, 4877-4885 (2005).
  9. Picker, L. J., et al. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).
  10. Mueller, Y. M., et al. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J Immunol. 180, 350-360 (2008).
  11. O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection. Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).
  12. Chihara, T., et al. HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages. J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).
  13. Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. Vesicle formation during reticulocyte maturation. J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).
  14. Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. Microvesicles and viral infection. J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).
  15. Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions. Ethn. Dis. 18, (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).
  16. Muratori, C., et al. Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells. Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).
  17. Lenassi, M., et al. HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells. Traffic. 11, 110-122 (2009).
  18. Raymond, A. D., et al. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).
  19. James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).
  20. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).
  21. Konadu, K. A., et al. Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals. Journal of Infectious Diseases. (2014).
  22. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).
  23. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).
  24. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  25. McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media. J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).
  26. Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes. J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).
  27. Lötvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
Выделение экзосомы из плазмы ВИЧ-1-инфицированных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).More

Konadu, K. A., Huang, M. B., Roth, W., Armstrong, W., Powell, M., Villinger, F., Bond, V. Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals. J. Vis. Exp. (107), e53495, doi:10.3791/53495 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter