Abstract
엑소 좀은 세포 유형의 다양한 구성 적 자극 모두에 릴리스이 30 nm 내지 100nm 범위의 크기에 작은 소포이다. 이들은 생물학적 유체의 번호에서 발견되는 단백질, 지질, 핵산 분자의 다양성을 수행하는 것으로 알려져있다. 원래 세포 파편을위한 저수지보다 더 작은, 생물학적 과정을 조절하는 엑소 좀과 질병의 역할이 점점 더 감사합니다 것으로 생각했다.
방법은 여러 세포 배양 배지, 생물학적 유체에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 저밀도, 초 원심 미분 및 / 또는 한외 엑소 격리를위한 가장 널리 사용되는 기술들이다. 그러나, HIV-1에 감염된 개인의 플라즈마는 크기와 밀도 비슷 두 엑소 좀과 HIV 바이러스 입자가 포함되어 있습니다. 따라서, 인간 혈장에서 HIV 바이러스 입자에서 엑소 좀을 효율적으로 분리하고있다도전.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Cantin 등으로부터 변성 과정을 개발 하였다. 알., 인간 혈장에서 HIV 입자에서 엑소 좀 정화용 2008. Iodixanol 속도 구배는 HIV-1 양성 개인의 혈장에서 HIV-1 입자에서 엑소 좀을 분리 하였다. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 확인되었다. 엑소 좀은 엑소 마커 아세틸 콜린 에스 테라 제의 기초 (아세틸 콜린), 및 CD9, CD63 및 CD45 항원을 동정 하였다. 우리 구배 절차는 바이러스 입자의 자유로운 엑소 제제를 수득 하였다. 인간 혈장에서 엑소 좀의 효율적인 정제 혈장 유래 엑소 좀의 내용을 검사하고, 면역 조절 성 전위 및 기타 생물학적 기능을 조사 할 수있었습니다.
Introduction
HIV-1 전염병은 세계에 걸쳐 상당한 영향을 계속. 2013 년으로, 전 세계적으로 약 35 만 명이 HIV에 살고,이 중 210 만 새로 감염된 사람 1이었다. 예방 전략과 항 레트로 바이러스 치료에 증가 접근은 HIV의 전체 인수를 줄이는데 도움이되고있다. 그러나, 개인의 인구는 여전히 HIV 1의 인수에 상승을 경험하고있다. 따라서,이 전염병을 해결하기 위해 계속 노력이 필요하다.
에이즈 질병 진행의 가장 강력한 예측 인자 중 하나는 만성 면역 활성화 (CIA) 2-10이다. 검출 사이토 카인 및 T 림프구의 표면에 높은 표현 마커의 지속적으로 높은 수준의 정의, 중앙 정보국 (CIA)은에 기인하고있다 : 나는 11 IFN 유형 I) 연속 수지상 세포 생산; HIV 단백질 문신, 네프와 gp120의 (12)에 의해 구동 (II) 직접 면역 활성화; (III장 관련 면역 세포 6 박테리아 단백질) 전좌. 그러나, 정확한 메커니즘은 만성 하부는 HIV 감염에 전신성 면역 활성화는 완전히 밝혀지지 남아있다.
우리의 연구 그룹과 다른 사람은 에이즈 발병 15 ~ 18의 엑소 좀의 역할을 증명하고있다. 우리 그룹 네프 단백질 엑소 좀 15에 감염된 세포로부터 분비되는 것으로 판정하였으며, exosomal 네프 (exNef)은 나노 그램 수준 18 HIV 감염자의 혈장에 존재한다. 우리는 또한, 단핵구 / 대 식세포가 exNef에 의한 세포 사멸에 반응했다. exNef에 노출 된 CD4 + T 세포가 CXCR4 통로 (19), (20)에 따라 활성화 유도 된 세포의 죽음을 초래하는 방관자를 표시하지만, 변형 된 세포 기능 및 사이토 카인의 발현을 전시했다. HIV에 감염된 사람의 혈장에서 분리 된 가장 최근에, 우리 그룹이 보여 주었다 엑소 좀은 염증성 사이토 카인의 다양한 포함되어 있습니다. 부rther, 메모리 및 중앙 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포상에서 CD38의 발현을 유도하는 HIV 감염 환자에서 혈장 유래 엑소 좀에 노출 나이브 말초 혈액 단핵 세포. 이 가능성이 전신 염증과 방관자 세포 활성화 (21)를 통해 바이러스 전파에 기여하고, 엑소 좀은 에이즈 발병 기전에 중요한 역할을한다는 것을 의미한다.
HIV의 병인에서 엑소 좀의 역할을 조사하고, 하나의 도전은 HIV 입자로부터 효율적으로 분리 된 엑소 좀 exosomal 콘텐츠를 유지하면서,뿐만 아니라 면역 조절 성 기능적 능력에 기술들을 개발하고있다. 몇몇 방법은 세포 배양 물 및 생물학적 유체 (22, 23)에서 엑소 좀을 분리를 위해 설명되었다. 그들의 작은 크기 및 낮은 밀도 (엑소 좀은 1.15의 밀도 부동 - 1.19 g / ㎖), 차동 초 원심 분리 및 / 또는 한외 여과가 엑소 아이솔레이션 (23)이 가장 일반적으로 사용되는 기술이다.그러나 HIV에 감염된 세포 배양 상층 액과 환자의 혈장은 엑소 좀과 HIV-1 바이러스 입자를 모두 포함되어 있습니다. 엑소 좀과 HIV-1 입자 크기와 밀도 모두에서 매우 유사합니다. 대안 적으로, CD63, CD45 및 CD81와 같은 고유 exosomal 마커의 발현을 활용 엑소 좀은 면역 캡처 방법 (23)을 사용하여 분리되었다. 이 절차는 엑소 좀에서 바이러스를 분리 할 수 있습니다. 그러나,이 기술의 단점은 배양에서 엑소 좀의 면역 가능성을 방해 할 수있는 평가 엑소 좀 정제, 항체의 단단한 부착이다.
이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 Iodixanol 속도 구배를 사용하여 HIV의 Cantin에서 변성 인간 혈장 내의 입자 및 동료 엑소 좀 (22)로부터의 정제 방법을 개발 하였다. 바이러스 입자는 높은 반면에 편석 엑소 좀은 저밀도에서 iodixanol 구배 / 상부 분획을 분리하는 것으로 나타났다밀도 / 낮은 분수. 바이러스 입자는 P24 ELISA에 의해 식별하고, 엑소 좀은 아세틸 콜린 엑소 마커, CD9, CD63 및 CD45를 사용하여 확인 하였다. 수집 상단 저밀도 분수는 HIV-1의 P24 오염에 대한 음성이었다 엑소 좀을 포함. 인간 혈장에서 HIV 입자로부터 엑소 좀의 효율적인 정제 및 분리는 인간 혈장뿐만 아니라 면역 조절 성 전위의 조사 및 HIV-1 발병 엑소 좀의 진단 및 예후 유래의 엑소 좀의 컨텐츠에 대한 정확한 검사를 허용한다.
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Protocol
엑소의 분리 및 정제 과정의 일반적인 그림은 그림 1에 나와 있습니다. 전체 혈액을 건강한 자원 봉사 기증자와에 모리 대학의 희망 클리닉과 그래 디 건강 시스템의 감염증 프로그램에 참석 항 레트로 바이러스 theraoy를 수신하지 HIV 양성 개인로부터 얻은 것 애틀랜타, 조지아. 본 연구는에 모리 대학과 의학의 모어 하우스 대학의 제도적 검토 보드에 의해 승인되었다. 연구에 참여하는 모든 사람은 서면 동의를 통보했다.
혈장에서 엑소 좀 1. 준비
- 인간의 혈액 수집 및 처리
- (18 mg의 칼륨 EDTA를 함유 함) EDTA 혈액 수집 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 혼합 5 배를 반전.
- 혈액 세포 펠렛을 실온에서 20 분 동안 1,000 XG에서 혈액 수집 튜브를 원심 분리기. 멸균 피펫을 사용하여TE는 25 ㎖ 원뿔형 튜브에 혈장 분획 (4-5 ml)에 전송한다. 1 X PBS 10 mL로 혈장 희석. 생물 폐기물 용기에 적절하게 마킹 (또한 PBMC라고도 적혈구 및 백혈구)의 혈액 세포를 버린다.
주 : 감염되지 않은 공여자의 혈액 샘플의 경우에, PBMC는 상기 사용 (이하, 절차 IV.2 참조)를 위해 예약 될 수있다. - 단기 (2-3 일간) 또는 장기 저장을 위해 -80 ℃로 4 ℃로 플라즈마 샘플을 저장합니다.
참고 : 추가 처리를하기 전에 4 O C에 어떤 냉동 혈장 샘플을 가져와.
- 플라즈마로부터 엑소 분획 제제
- 4 ℃에서 30 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기 플라즈마 세포 파편을 제거합니다. 깨끗한 25 ML의 초원 심 분리기 튜브에 삭제 플라즈마 뜨는을 전송하기 위해 멸균 혈청 학적 피펫을 사용합니다. 생물 학적 용기에 펠렛을 폐기하십시오.
- 2 10 만 XG에서 삭제 플라즈마를 원심 분리기4 ℃에서 시간은 큰 소포를 제거합니다. 피펫 조심스럽게 100,000 XG 상층 액을 제거하고, 생물 학적 폐기물 폐기합니다. 깨끗한 튜브로 1X PBS 1 ㎖에 100,000 XG 펠렛을 재현 탁하고 부드럽게 이동시키다 분리 입자 소용돌이, 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- PBS의 25 ㎖를 추가하여 중단 100,000 XG 엑소 / 바이러스 펠렛을 씻으십시오. 부드럽게 한 후, 혼합하여 4 ℃에서 2 시간 동안 100,000 XG에서 다시 원심 분리기 튜브 다섯 번 반전. 생물 학적 폐기물 용기에 PBS 세척 솔루션을 폐기하십시오.
- 1 X PBS 1 ㎖에 100,000 XG 펠렛을 재현 탁하고시키다 펠렛을 용해 소용돌이 부드럽게 30 분 동안 RT에서 배양한다.
주 : iodixanol 그라데이션 단계까지 1-2일 4 ℃에서, 엑소 좀과 바이러스 입자를 함유하는, iodixanol 그라데이션 단계로 바로 진행 펠렛을 저장하는 것이 가능하지 않은 경우.
엑소 좀 2. 정제
- 6 % -18 %의 veloc 생성이중 챔버 구배 전자 장치를 사용 iodixanol 성만의 기울기.
- PBS에 희석하여 물에서 60 % 용액으로서 공급 iodixanol 시약 6 % 및 18 % 용액을 준비한다. 피펫 5.5 교반 챔버 내로 18 % 용액 ㎖, 및 피펫 저장 챔버에 6 %의 용액 5.5 mL로. , 교반기를 켭니다 마개를 열고 각각의 기울기는 14 ML의 초 원심 분리기 튜브로 유입 할 수 있습니다.
참고 : 즉시 사용하거나 사용하기 전에 4 ° C에서 준비 그라데이션 O / N를 저장 중 하나. - 신중하게 각 11 ㎖의 구배의 정상에 엑소 / 바이러스 액 1ml 계층. SW40Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 4 ℃에서 2 시간, 250,000 XG에 원심 분리기 그라디언트.
- 12 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 레이블. 구배의 상부로부터 1.0 ㎖의 튜브를 제거하고 1 번에 옮긴다. 순차적으로 튜브 2-12에 남아있는 1ml의 분수를 전송합니다.
참고 : 맨 위 부분은 이렇게 # 1, 바닥 분수, # 12이 될 것입니다. 성4 ° C에서 그라데이션 분수 광석. 4 ℃에서 보관시 구배 상단 분획 1-3이어야 정제 엑소 좀은 3-4 주 동안 안정하다.
- PBS에 희석하여 물에서 60 % 용액으로서 공급 iodixanol 시약 6 % 및 18 % 용액을 준비한다. 피펫 5.5 교반 챔버 내로 18 % 용액 ㎖, 및 피펫 저장 챔버에 6 %의 용액 5.5 mL로. , 교반기를 켭니다 마개를 열고 각각의 기울기는 14 ML의 초 원심 분리기 튜브로 유입 할 수 있습니다.
3. 엑소 특성
- 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 활동 분석
- 1X PBS 1 ml의 아세틸 콜린 요오드화 28.9 mg을 혼합하여 100 mM의 기판 재고를 준비합니다. 1개월에 -20 ° C 최대 스토어 기판 재고.
- 1X PBS 10ml에 벤조산 39.6mg과 탄산 수소 나트륨 15 mg을 혼합하여 10 mM의 색상 표시 주식을 준비합니다. 최대 2 주, 4 ℃에서 보관 색 표시 재고.
- (예를 들면 10 ㎖ + 1X PBS 200 ㎕를 기질 + 500 μL 색 표시기)를 5 : 1 : 100의 비율로 혼합 1X PBS, 기판, 및 컬러 표시하여 측정 시약을 제조.
- 96 웰 microtite의 우물로 전송 (프로 시저 III.3에서 1-12로 표시) 각 1.5 ml의 그라데이션 분수 관에서 50 μLR 판. 각 그라데이션 샘플에 대해 중복 우물을 준비합니다.
- 첫 번째 PBS에 2000 μU / ml의 아세틸 콜린의 주식을하여 표준 세트를 준비합니다. 확인 11 개의 2 배 콘텐츠의 연속 희석하고, 마이크로 타이 터 플레이트의 단일 웰에 각 희석액 50 μL를 추가되도록 표준 # 1 = 2,000 μU / ㎖, # 2 = 1,000 μU / ㎖, # 3 = 500 μU / ㎖, 등 # 12 = 0.98 μU / ㎖까지. 열두 시린 표준 따라서 96- 웰 분석 플레이트의 하나의 행을 차지한다.
- 각 측정 시약 혼합물의 200 μL를 첨가하고 잘 착색 반응 생성물의 개발을 허용하기 위해 RT에서 (어두운 곳에서) 20 분 동안 배양한다. 형광 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 450 nm의 파장에서의 AChE의 활성을 측정한다.
주 : 엑소 정제 후 남은 출발 물질의 비율은 비 분획 플라즈마의 통증 분석법에 의해 평가된다.
- 면역 분석
- proced 그라데이션 분수 1-12에서 분리 된 단백질 (100V X 1 시간에 4~20% 트리스 - 염산 프리 캐스트 젤의 SDS-PAGE에 의해 URE 2.1.3). 제조업체의 지시에 따라 전기 블로 팅 전사 셀을 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 겔에 옮긴다. 전송이 350V에서 12 ~ 16 시간 (O / N)에 대해시킨다하도록 허용합니다.
- 블로 팅 장치로부터 막을 제거하고 5 분 동안 트리스 완충 염수 (TBS)로 세척 하였다. RT에서 진탕하여 1 시간 동안 (0.1 % 트윈 20과 TBS) TTBS 중 5 % 탈지 우유로 차단.
- 12 ~ 16 시간 (O / N) 4 ℃에서 진탕 5 % 무 지방 우유에 엑소 좀 (CD9, CD45, CD63) 또는 HIV-1 캡시드 단백질 (P24)에 대한 특정 기본 항체와 멤브레인을 품어. 면역 블롯에 대한 일차 항체의 희석은 1 범위 : 2000 -1 : 5000.
- 1 인큐베이션 20 분 동안 TTBS로 블롯을 세척 : 양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 2,000 희석액을 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지 우유, 안티의 IgG (이차 항체)에 π 공역 계. 오에게 TTBS 3 회, 세척 당 10 분을 씻으십시오.
- 어도비 포토샵에서 볼 수있는 TIFF 파일로 이미지를 저장합니다. ImageJ에 소프트웨어 (건강의 국립 연구소, 베데스다, MD)를 사용하여 밴드의 밀도 측정 분석을 수행합니다.
- 사이토 카인 분석
- 사이토 카인 분석에 앞서, 산해리 의해 인간 혈장에 존재하는 통상 세제 처리하여 엑소 좀을 용균 면역 복합체를 방해. 분석 모두 시작 플라즈마 샘플 및 정제 엑소 좀 준비.
- 인간 혈장 100 ㎕를 100 ㎕의 0.33 N HCL을 부가하고 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 산 처리 된 플라즈마를 중화하기 위해 100 μL 0.33 N NaOH를 추가합니다. 인터넷에, 트리톤 X-100 중화 플라즈마 및 정제 엑소 모두 샘플을 추가1 %의 최종 농도는 엑소 좀의 분해를 야기한다.
- 이 분석 (형광 구슬 기반 절차)의 경우, 자석 구슬은 제조 업체에 의해 항체로 미리 코팅 사용합니다. 안티 - 인간 사이토 카인 항체 코팅 구슬의 맞춤 디자인 패널을 사용하여; 표 1. 30 초간 사이토킨 분석 키트에서, 항체 - 코팅 된 자성 비드 와동 및 분석에 사용되는 96- 웰 플레이트의 각 웰에 50 ㎕의 비드를 추가한다.
- 8- 점 표준 곡선을 생성하기 위해, 사이토 카인 분석 키트의 사용 설명서에 기재된 바와 같이 플라즈마 표준 완충액 (사이토 카인 분석 키트에 함유 된 양)의 표준 희석 시리즈를 준비한다.
- 사용 설명서에 설명 된 바와 같이, 물론 각 (키트) 1X 세척 버퍼의 150 μl를 추가하고 자기 비드 와셔를 사용하여 구슬을 씻는다. 각 웰 (키트) 25 μL 플라즈마 분석 버퍼를 추가합니다. 분석에 사용 된 모든 우물에 표준 및 샘플의 25 μl를 추가합니다. 플라즈마의 25 μl를 추가음성 대조군 우물에 샘플 버퍼. 밀봉하고 실온에서 60 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어 4 ℃에서 O / N을 품어.
- 각 웰에 1X 세척 버퍼의 150 μl를 추가하고 (위의 단계 3.3.4에서와 같이) 접시를 씻으십시오. 각 웰, 인감로 검출 항체의 25 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어. 세척 단계를 반복합니다.
- 각 웰, 인감로 (키트에서 SAPE) 스트렙 타비 딘 용액 50 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 700 rpm에서 판을 흔들어. 3.3.4에서와 같이 반복 플레이트 세척.
- 형광 신호가 발전 할 수 있도록 실온에서 5 분 동안 700 rpm으로 실험실 탁상 통에 각에 (키트) 읽기 버퍼의 120 μl를 잘 추가하고 악수. 제조업체의 지침에 따라 플레이트 리더에 판을 읽어보십시오.
- , 분리 과정 중에 손실 엑소 좀의 양을 설명하기 식을 사용하기 위해 [(원고 판독 / 혈장 부피) = 66.6 조절 사이토 카인 판독 X].
- 사이토 카인 분석에 앞서, 산해리 의해 인간 혈장에 존재하는 통상 세제 처리하여 엑소 좀을 용균 면역 복합체를 방해. 분석 모두 시작 플라즈마 샘플 및 정제 엑소 좀 준비.
면역 잠재적 4. 분석
- 엑소 좀 고갈 태아 소 혈청과 문화 매체의 준비
- 원심 분리기 4 ℃에서 20 시간 동안 100,000 XG에 소 태아 혈청 (FBS) 500 ml의 엑소 좀과 마이크로 소포를 오염 펠렛. 조심스럽게 제거하고 엑소 좀 고갈 FBS 상층 액을 저장합니다. 생물 학적 폐기물의 펠렛을 폐기하십시오.
- 로스웰 파크 메모리얼 연구소 1640 500 ㎖ (1640 RPMI) 매체와 엑소 좀 고갈 FBS 상층 액의 20 %를 결합합니다. 0.45 ㎛의 멤브레인 필터를 사용하여 배지를 필터.
- 여과 매체 스트렙토 마이신 (100 U / ㎖), 페니실린 (100 U / ㎖), L- 글루타민 (2 mM)을 HEPES 완충 식염수 용액 (10 μM) 및 IL-2 (20 U / ml)에 추가한다.
- 세포 배양 및 엑소 좀 노출
- 건강한 지원자 클리닉 기증자로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에 엑소 좀을 노출. 에서 PBMC를 일시 중단배양 배지를 제조하여 (제조자의 표준 방법에 따라) 셀 / 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
주 : PBMC는 (단계 1.2) 상술 한 플라즈마 제조 동안 얻어진다. - 4.1.3 절차로부터 제조 매체를 이용하여, 공존 배양 3.0 × 106에서 엑소 좀 풀링 1 μg의 / ㎖와 (PBMC) 세 (3) HIV-1 혈청 양성 또는 삼 (3) HIV-1 혈청 음성 개체로부터 총 (뚜껑) 12 웰 배양 플레이트의 웰에 1 ml의 부피. 37 ℃에서 48 시간 동안 문화를 품어.
- 콘 카나 발린으로 처리 미처리 PBMC 배양 물 및 배양 물 제조 (콘을 5 μg의 / ㎖) (4.2.2) 전술 한 바와 같이, 각각 같은 음성 및 양성 통제를 제공하기 위해. 37 ℃에서 48 시간 동안 모든 PBMC 문화를 품어.
- 형석 알렉사 700 표지 항 CD3 (1 : 400 희석), allophycocy 직전에 세포를 수확하려면 다음, 형광 - 공액 모노클로 날 항체의 희석액을 제조(1 : 400), V450 표지 항 CD8, 바이오틴 : 엽록소 단백질 복합체 표지 항 CD4 (400 1) peridinin : ANIN (APC) / 시아닌 7 (Cy7)는 안티 CD4 (400 1) - 표지 안티 CD45RA (1 : 1,000) 표지, 피코 에리 트린 (PE) / 항 CD62L (1 : 1,000)를 Cy7 - 표지 : PE-텍사스 레드 -, PE는 / 시아닌 5 (Cy5에)는 안티 CD38 (200 1) - 표지 표지 항 streptavidin (1 : 000), 및 PE / Cy5에 표지 된 마우스 IgG1K 아이소 타입 컨트롤 (1 : 200).
- 48 시간의 잠복기 후, PBMC를 수확. PBS에 세척 PBMC는 개인, 형광 표지 된 항체로 4 ℃에서 1 시간에 대한 배양 세포를 엑소 좀을 제거하고 얼룩합니다. (21의 설명 참조) 케모카인의 발현을 정량화하는 유동 세포 계측법에 의해 염색을 분석 PBMC.
- 건강한 지원자 클리닉 기증자로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)에 엑소 좀을 노출. 에서 PBMC를 일시 중단배양 배지를 제조하여 (제조자의 표준 방법에 따라) 셀 / 입자 계수기를 사용하여 세포를 카운트.
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Representative Results
엑소 좀을 효율적으로 HIV-1 긍정적 인 인간 혈장에서 정제된다. 아세틸 콜린 (아세틸 콜린) 활동에 의해 식별 고립 된 엑소 좀을, HIV-1 항원 P24에 의해 확인 된 바이러스 입자 반면, iodixanol 그라디언트의 상단에 낮은 밀도 분획 1-3에서 분리 (하단, 10-12) 고밀도 분획으로 분리. 엑소 좀의 존재는 상기 마커 아세틸 콜린 엑소, CD9, CD45 및 CD63, 및 전자 현미경에 의해 (도 2)의 면역 인식에 의해 확인 하였다.
염증성 사이토 카인과 케모카인은과 관련된 크게 HIV-1 혈청 양성 개인의 엑소 좀에 상승하고 있습니다. 정제 된 엑소 좀과 미분 획 플라즈마에서 HIV-1 감염과 HIV-1 혈청 음성 개인이 멀티 플렉스 분석에 의해 21 사이토 카인 / 케모카인을 분석 하였다. 모든 21 사이토 카인 / 항암 치료kines는 HIV-1 긍정적 인 개인으로부터 격리 엑소 좀 검출되었다. HIV-1 혈청 음성 컨트롤 (표 1)에서 플라즈마와 비교하여 엑소 좀 또한 그 레벨이 크게 상승 하였다.
CD38 발현은 HIV-1 혈청 양성 개체로부터 엑소 좀에 노출 된 세포의 표면 상에 증가 하였다. 감염되지 않은 인간 공여자로부터의 PBMCs를가 활성화 마커 CD38의 수준에 대한 HIV-1 혈청 양성 또는 혈청 음성 개체로부터 풀링 된 엑소 좀에 48 시간 동안 노출되고 평가되었다 CD4 + 및 유세포 통해 T CD8 + 세포. 우리는 관찰 48 시간 노출 후, CD4 + 및 CD8 + T 세포가 상당히 HIV 음성 엑소 처리 및 미처리 비교 HIV-1 양성 개체로부터 엑소 좀에 노출 된 T 세포에서 증가 하였다 나이브 및 중앙 메모리의 표면 상 CD38 발현에 의해 컨트롤 (그림 3).
HIV-1 긍정적 인 인간 혈장에서 엑소 좀 분리의 도식 표현을 그림. (A)의 말초 혈액 10 ml를 HIV-1 및 seropositve 혈청 음성 개체로부터 수집 하였다. (B) EDTA 혈액 수집 튜브는 RT에서 20 분 동안 1,000 XG에서 원심 분리 하였다. (C) 분리 플라즈마 1X PBS 및 (D)로 ½ 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 옮기고, 희석시키고 30 분 동안 10,000 XG을 원심 분리 하였다. (E) 상등액을 초 원심 분리기 튜브에 옮기고, (F)를 2 시간 동안 10,000 XG에서 원심 분리 하였다. (G, H) 상층 액을 버리고 엑소 좀 펠렛을 재 - 현탁하고, 1X PBS 1 ㎖로 세척 하였다. 원심 이하의 (I)는, 상등액을 버리고 펠릿 1X PBS 1 ㎖에 재 현탁하고 2 시간 동안 250,000 XG에서 원심 6~18% iodixanol 속도 구배 및 (J)에 오버레이. 원심 분리하기 (K), 구배의 위에서 아래로 1 ml의 분획을 TRA이었다1.5 ㎖의 튜브 nsferred 및 아세틸 콜린 함량 및 면역 블롯 분석을 위해 분석 하였다. (L) 분획 2 및 3보다 있었다 합하고 1X PBS 및 2 시간 동안 400,000 XG에서 원심 분리 (M)의 4 ㎖로 희석 하였다. (N)은 원심 분리 후, 상층 액을 버리고 펠릿 염증성 사이토 카인과 케모카인의 발현 분석을 위해 1X PBS 1 ㎖에 다시는 탁. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 엑소 좀을 효율적으로 인간 혈장에서 정제된다. HIV 양성자 또는 혈청 음성 개인의 개별 iodixanol 속도 구배의 분수를 (A) 아세틸 콜린 에스 테라 제에 대한 효소 분석 (아세틸 콜린), 및 exosomal 마커 CD9, CD의 (B) 웨스턴 블롯 분석을 실시 하였다45, CD63 및 바이러스 단백질 P24 하였다 (C) 항 CD63과 immunolabeled 정제하여 엑소 좀 (C)의 제조를 확인하는 전자 현미경으로 관찰하고. (허가에 의해 사용 Konadu 등의 알 2014 년 21에서 그림). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
면역 잠재적 그림 3. 분석에서. PBMC를 HIV-1 혈청 음성 개인은 HIV-1 혈청 양성의 플라즈마 (HIV + 출) 또는 혈청 음성에서 풀 엑소 좀 하나에 치료 (HIV-출) 개인이, 왼쪽에 노출, 또는 처리 한 5 μg의 / 양성 대조군으로 콘 카나 발린의 ㎖ (콘). 48 시간 노출 후, 나이브 (CD45RA + / CD62L +), 중앙 (TCM, CD45RA- / CD62L +)와 이펙터 (TEM; CD45RA- / CD62L-) 메모리 CD4 +와 CD8 + T 세포는 유동 세포 계측법에 의해 CD38 발현에 대해 분석 하였다. 엑소 농도로 총 단백질 및 1 μg의 규격화 / ㎖로 첨가 하였다. 오차 막대는 +/- 평균 나타내는 여섯 독립적 인 기증자의 SEM. 그룹 간의 차이는 편도 분산 분석 시험에 의해 통계적 유의성에 대해 시험 하였다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, **** P <0.0001. (허가에 의해 사용 Konadu 등의 알에서 그림 2014 21). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
염증성 사이토 카인과 케모카인의 발현에 대한 정제 엑소 좀과 HIV-1 혈청 양성에서 전체 혈장과 혈청 음성 개인 표 1. 분석. p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001, *** p <0.0001. (허가에 의해 사용 Konadu 등의 알 2014 년 21에서 그림). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
만성 면역 활성화 (CIA) 및 CD4 + T 세포 고갈은 HIV-1 감염의 두 가지 중요한 특징이다. 그들은 중앙 정보국 (CIA)이 가장 좋은 예측 인자 인 상태, 발병 기전에 대한 예측 인자로 설립되었다. 그러나, 만성 전신성 면역 활성화와 CD4 + T 세포의 감소를 구동 기전은 아직 완전히 규명되지 않았다. 우리와 다른 연구소는 HIV-1에 감염된 세포에서 분비되는 엑소 좀은 모두 특징에 중요한 역할을한다는 확고한 증거를 개발했다.
모두 조성과 세포 외 소포의 기능에 계속 관심이 세포 배양 매체와 생물 유체 24-26 모두에서 엑소 좀 격리를위한 다양한 방법의 출판하게되었다. 엑소 콘텐츠 및 기능적 활동 모두를 조사 할 수있는 능력을 유지하면서 그러나, HIV-1 발병 엑소 좀의 역할을 조사하는 장벽은 HIV-1 입자로부터 엑소 좀의 효율적인 분리되었다. 우리는 프로토를 개발했다iodixanol 속도 구배를 이용하여 인간 혈장 내 HIV-1의 입자에서 엑소 좀 정화용 내지 컬럼. 본 연구에서 사용 된 HIV 양성 공여체는 항 레트로 바이러스 치료 및 206,000 바이러스 입자 / ㎖ (21)의 평균 40 만 1500 바이러스 입자 / ㎖를 함유 이들 실험에 사용되는 혈장 샘플을 수신하지 않았다. 따라서, 우리는 바이러스 부하가 높은 경우에도, HIV-1 감염자의 혈장에서 엑소 좀을 효율적으로 HIV-1 바이러스 입자로부터 분리 될 수 있다는 것을 보여준다. 크기 및 밀도에서 유사하지만, 엑소 좀은 고밀도 / 하부 분획으로 분리 바이러스 입자에 비해 iodixanol 구배 저밀도 / 상부 분획으로 분리. iodixanol 구배 법에 의해 제조 된 엑소 좀은 고순도 및 세포 외 단백질을 오염 자유 롭다. 절연 엑소 좀 인구의 순도 P24 ELISA 및 HIV-1 P24 캡시드 단백질을 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 확인할 수 있었다뿐만 아니라 exosomal 마커, 아세틸 콜린, CD9, CD45, 및 CD63에 대한 서양의 분석과 같은. 이들 마커를 사용 엑소 식별 27 최근 발표 된 가이드 라인에 일치한다.
더 중요한 생리 면역 활성화에, HIV-1 감염자로부터 정제 된 엑소 좀은 HIV-1 엑소 좀 혈청 음성 대조군보다 훨씬 높은 농도의 사이토킨 / 케 모킨을 함유하는 것으로 확인되었다. 또한, HIV-1 감염된 개체로부터 엑소 좀은 메모리 및 중앙 나이브 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 표면 상에, 활성화 마커 CD38의 수준 증가를 유도 할 수있는 능력을 나타내는 생물학적 활성이었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 HIV 감염시 영구 면역 활성화를 구동 할 수있는 메커니즘을 제안한다.
결과 우리는 차등 원심 iodixanol 속도 구배 분리는 값을 보여 우리의 결합 엑소 정제 공정을 사용하여 수득 할 수 있었다생리적 기능에 대한 생물 검정 고순도 엑소 좀을 사용. 절차는 특정 함정과 한계를 가지고있다. 엑소 좀의 상당량, 아세틸 콜린 활성의 측정에 의해 계산 된 출발 물질들은 대부분은, 프로세스 동안 손실된다. 또한, 절차는 시간을 소비하며 고가의 장비에 대한 액세스를 필요로한다. 마지막으로, 그라데이션 fromer 장치를 이용 iodixanol 구배의 발생 재현성을 보장하기 위해 상당한 연습이 필요하다. 그라데이션 세대를위한 또 다른 방법은 그라디언트 형성 할 수 있도록 원심 분리기 튜브에 솔루션을 조심 레이어 및 배양 O / N 다음에 iodixanol 솔루션의 등급 시리즈를 준비 할 수 있습니다. 그러나, 우리는이 대안을 테스트하지 않았습니다.
인간 혈장에서 HIV-1 입자로부터 분리 및 엑소 좀의 분리를 위해 여기에 설명 된 실험 프로토콜은 EX의 순도를 보장하는 효과적인 방법osomes. 이 방법의 사용은 HIV-1 기전의 엑소 좀의 역할에 대한 미래의 질문에 대한 흥미로운 길을 주도하고 동등하게 다른 생물학적 과정에 대한 문의에 사용될 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer EDTA tubes (10ml) | Becton Dickinson | 368589 | pink top tubes |
| Lymphoprep Ficoll reagent | Cosmo Bio | AXS-1114545 | |
| Optiprep iodixanol reagent | Sigma | D1556 | |
| 14ml ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344060 | ultraclear tubes |
| Gradient Former Model 485 | BIO-RAD | 165-4120 | |
| Acetylthiocholine iodide | Sigma | 1480 | |
| Benzoic Acid | Sigma | D8130 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Acetyl Cholinesterase | Sigma | C3389 | |
| 96-well clear microtiter plate | Medical Supply Partners | TR5003 | |
| SpectraMax 190 microplate reader | Molecular Devices | 190 | Fluorescent plate reader |
| Criterion Gel Electrophoresis Cell | BIO-RAD | 165-6001 | |
| Transblot Gel | BIO-RAD | 170-3910 | |
| Transfer Cell | |||
| Tris-HCl Criterion precast gels | BIO-RAD | 567-1093 | |
| Anti-CD45 antibody | Abcam | Ab10558 | |
| CD63 Antibody (H-193) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-15363 | |
| CD9 Antibody (H-110) | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-9148 | |
| Rabbit pAb p24 HIV-1 | ImmunoDX, LLC | 1303 | |
| Nitrocellulose membrane | BIO-RAD | G1472430 | |
| Tris Buffered Saline | BIO-RAD | 170-6435 | |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31460 | Goat-Anti-Rabbit |
| HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Scientific | 31430 | Goat-Anti-Mouse |
| Western Blotting Luminol Reagent | Santa Cruz Biotech, Inc. | SC-2048 | |
| GE LAS-4010 Imager | GE Healthcare | LAS-4010 | |
| Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit | Affymetrix | N/A | Custom immunoassay panel |
| Bio-Plex 200 Immunobead Reader | BIO-RAD | 171-000201 | |
| Coulter Z2 Particle Counter | Beckman Coulter | 383552 | Cell counter |
| Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3 | BD Bioscience (UCHT1) | 300424 | |
| APC/Cy7-labeled anti-CD4 | Biolegend (OKT4) | 317418 | |
| PerCP-labeled anti-CD4 | BD Bioscience (RPA-T8) | 550631 | |
| V450-labeled anti-CD8 | BD Bioscience (RPA-T8) | 560347 | |
| Biotin-labeled anti-CD45RA | BD Bioscience (HI100) | 555487 | |
| PE/Cy7-labeled anti-CD62L | Biolegend (DREG-56) | 304822 | |
| PE/Cy5-labeled anti-CD38 | Biolegend (HIT2) | 303508 | |
| APC/Cy7-labeled anti-HLADR | Biolegend (L243) | 307618 | |
| PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin | BD Bioscience | 551487 | |
| PE/Cy5-labeled mouse IgG1K | Biolegend (MOPC-21) | 400116 | |
| APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK | Biolegend (MOPC-173) | 400229 |
References
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